本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種中成藥止咳寧嗽膠囊中活性成分的檢測方法，具體的說是一種切換波長法同時測定止咳寧嗽膠囊中三種活性成分的方法。

背景技術(shù)：

止咳寧嗽膠囊收錄于《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑(第九冊)》，由苦杏仁、防風、桔梗、荊芥、陳皮等11味中藥組成，具有疏風散寒、宣肺解表、鎮(zhèn)咳祛痰的功效，臨床用于風寒咳嗽、嘔吐、咽喉腫痛等癥狀。

目前，已有報道采用高效液相色譜法測定止咳寧嗽膠囊中橙皮苷、苦杏仁或橙皮苷與綠原酸的含量。例如：將樣品用甲醇超聲提取，在zorbaxsb-c18(3.0mm×250mm，5μm)色譜柱上分離，以含1％乙酸的水(a)-乙腈(b)體系為流動相進行階梯洗脫，程序為0min(82﹕18)～5min(82﹕18)～5.1min(75﹕25)～20min(75﹕25)；流速為0.35ml·min^-1；327nm紫外檢測，可同時測定止咳寧嗽膠囊中的綠原酸和橙皮苷的含量(具體見“高效液相色譜法測定止咳寧嗽膠囊中的綠原酸和橙皮苷”，許海棠等人，廣西民族大學化學與生態(tài)工程學院，南寧530006)。

然而，上述色譜條件由于流動相中乙酸的濃度過高，測定過程中對儀器和色譜柱會有一定的腐蝕；同時，流速需要控制在0.35ml·min^-1，這對儀器的選擇也有一定要求，色譜條件過于苛刻。最重要的是，止咳寧嗽膠囊中成分較多，在上述色譜條件下，綠原酸與橙皮苷的色譜峰之間仍存在沒有被完全分開的單一的樣品峰，無法將止咳寧嗽膠囊中其它活性成分有效的分離出來。流動相組成在5分鐘左右由(82﹕18)快速變成(75﹕25)，容易引起基線飄移。

為有效監(jiān)控藥品質(zhì)量，確保該制劑的療效，需要進一步完善高效液相色譜法，保證其能夠快速準確的分析出多種活性成分的含量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種利用高效液相色譜切換波長法同時測定止咳寧嗽膠囊中的綠原酸、金絲桃苷和橙皮苷含量的方法，為判斷該藥的質(zhì)量標準提供理論依據(jù)。該方法操作簡單、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，對儀器和色譜柱不會產(chǎn)生不良影響，可用于該藥品的質(zhì)量控制。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：該測定方法是利用高效液相色譜(hplc)切換波長法在同一實驗條件下同時分離并測定止咳寧嗽膠囊中的綠原酸、金絲桃苷和橙皮苷的含量，具體步驟如下：

(1)混合對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸0.00234g、橙皮苷0.00230g和金絲桃苷0.00305g，分別置于5ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線處；制得濃度分別為468μg·ml^-1、460μg·ml^-1和610μg·ml^-1的標準品溶液；分別移取每種標準品溶液150μl混合，制得混合對照品溶液；

(2)供試品溶液的制備：取16粒止咳寧嗽膠囊，除去膠囊外殼，精密稱取4.18535g，用80ml甲醇為溶劑進行索式提取5h，將提取液冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，甲醇定容，作為供試品溶液，供檢測使用；

(3)分離檢測：色譜柱：tc-c18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：a為乙腈，b為0.2％冰乙酸的水溶液梯度洗脫，梯度洗脫條件為：

流速：1.0ml·min^-1；檢測器：vwd檢測器；檢測波長：0-10min：327nm；10-48min：280nm；柱溫：25℃；進樣量：10μl。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點和積極效果：

1、本發(fā)明方法采用高效液相色譜法，利用梯度洗脫方式，實現(xiàn)了同時測定止咳寧嗽膠囊中三種有效成分；能夠較好的分離、測定止咳寧嗽膠囊中綠原酸、金絲桃苷和橙皮苷有效成分的含量，色譜峰峰形好，分離度較高，在此色譜條件下止咳寧嗽膠囊中綠原酸、金絲桃苷和橙皮苷的濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2、本發(fā)明所述方法操作簡單、精密度、準確度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，能夠更好地對該藥物進行質(zhì)量監(jiān)控，為全面評價和控制止咳寧嗽膠囊質(zhì)量和藥效評價的進一步研究奠定了理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明混合對照品溶液的色譜圖。

圖2為本發(fā)明實施例1供試品溶液的色譜圖。

圖3為本發(fā)明線性關(guān)系曲線圖。

圖4為本發(fā)明對比例1混合對照品溶液的色譜圖。

圖5為本發(fā)明不同提取方法下供試品溶液的色譜圖。

圖6為本發(fā)明不同流動相條件下綠原酸的色譜圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作以進一步的闡述，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但并不以此限制本發(fā)明。

儀器與試藥

儀器：agilent1100高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；uv-2550型紫外分光光度計(日本島津有限公司)；bt-125d十萬分之一分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；gwa-un4超純水器(北京普析通用儀器有限責任公司)；sk-5200h超聲波清洗器(上?？茖x器有限公司)；恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器公司)；shz-d型循環(huán)水真空泵(上海華光儀器儀表廠)；微孔濾膜(0.45μm)。

試藥：乙腈(gr)；冰乙酸(ar)；甲醇(gr)；止咳寧嗽膠囊(吉林吉春制藥股份有限公司，批號：z22021693)；綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-200413)；金絲桃苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111521-201406)；橙皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110721-201316)；超純水。

實施例1

(1)混合對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸0.00234g、橙皮苷0.00230g和金絲桃苷0.00305g，分別置于5ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線處；制得濃度分別468μg·ml^-1、460μg·ml^-1和610μg·ml^-1的標準品溶液；分別移取每種標準品溶液150μl混合，制得混合對照品溶液；

(2)供試品溶液的制備：取16粒止咳寧嗽膠囊，除去膠囊外殼，精密稱取4.18535g，用80ml甲醇為溶劑進行索式提取5h，將提取液冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，甲醇定容，作為供試品溶液，供檢測使用；

(3)色譜條件：色譜柱：tc-c18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：a為乙腈，b為質(zhì)量比為0.2％的冰乙酸水溶液梯度洗脫(見表1)；流速：1.0ml·min^-1；檢測器：vwd檢測器；檢測波長：0-10min：327nm；10-48min：280nm；柱溫：25℃；進樣量：10μl。

表1梯度洗脫條件

在上述色譜條件下，混和對照品和供試品溶液的色譜圖為圖1和圖2。綠原酸、金絲桃苷和橙皮苷在混合標準品中的保留時間分別是8.367min、16.150min和14.271min。

對比例1待測組分的選擇

(1)混合對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸、升麻素苷、金絲桃苷、5-o-甲基維斯阿米醇、橙皮苷、柚皮苷和連翹苷，分別置于5ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線處，制得標準品溶液，分別移取每種標準品溶液150μl混合，制得混合對照品溶液。

(2)供試品溶液的制備：參照實施例1。

(3)色譜條件：色譜柱：tc-c18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：a為乙腈，b為體積比為0.2％的冰乙酸水溶液水梯度洗脫(見表2)；流速：1.0ml·min^-1；檢測器：vwd檢測器；檢測波長：263nm；柱溫：25℃；進樣量：10μl。

表2梯度洗脫程序

在上述色譜條件下，混和對照品溶液的色譜圖為圖4，從左到右依次為綠原酸、升麻素苷、金絲桃苷、5-o-甲基維斯阿米醇、橙皮苷、柚皮苷和連翹苷；保留時間分別為3.033min、10.752min、15.556min、19.302min、20.102min、20.366min和22.910min。供試品溶液中升麻素苷、5-o-甲基維斯阿米醇和連翹苷含量較少，用該方法并未檢測到上述幾種成分。另外，供試品溶液中柚皮苷含量甚微且與橙皮苷較難分離；為保證分析質(zhì)量，最終確定將綠原酸、金絲桃苷和橙皮苷作為研究對象，進行定性和定量分析。

對比例2供試品溶液制備時提取方法的選擇

考察不同提取方法(超聲法、浸泡法和索式提取法)對止咳寧嗽膠囊中綠原酸和橙皮苷含量的影響。

(1)超聲提取法

取4粒止咳寧嗽膠囊，除去外殼，取膠囊中的粉末精密稱取1.04554g，放入錐形瓶中，加入適量的甲醇，超聲30min，靜置后過濾，將濾液轉(zhuǎn)移到25ml容量瓶中，甲醇定容，作為供試品溶液，供檢測使用。

(2)浸泡提取法

取4粒止咳寧嗽膠囊，除去外殼，取膠囊中的粉末精密稱取1.04565g，放入錐形瓶中，加入適量的甲醇，浸泡24h，靜置后過濾，將濾液轉(zhuǎn)移到25ml容量瓶中，甲醇定容，作為供試品溶液，供檢測使用。

(3)索式提取法

取16粒止咳寧嗽膠囊，除去膠囊外殼，精密稱取4.18535g，用80ml甲醇為溶劑進行索式提取5h，將提取液冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，甲醇定容，作為供試品溶液，供檢測使用。

上述超聲法提取的供試品溶液的色譜圖見圖5中的(a)、浸泡法提取的供試品溶液的色譜圖見圖5中的(b)、索式提取法提取的供試品溶液的色譜圖見圖5中的(c)，不提取方法對止咳寧嗽膠囊中綠原酸和橙皮苷含量的影響見表3。

表3不同提取方法對綠原酸和橙皮苷含量的影響

超聲提取法比其它兩種提取方法較方便快捷，但是提取的效果不如其它兩種提取方法好，可能會影響最后藥品含量的檢測結(jié)果。而索式提取法操作相對繁瑣，但是提取的效果最好。浸泡法的操作比較簡單，用時較長，提取效果在其它兩種提取方法之間。綜合考慮，本發(fā)明選擇索式提取法。

對比例3流動相的選擇

由于綠原酸不穩(wěn)定，在加酸的條件下才能使其穩(wěn)定存在，為了更好地檢測綠原酸，需要在流動相中加酸進行實驗。為了確定加何種酸以及加酸量，流動相分別以乙腈～0.05％磷酸、乙腈～0.1％磷酸、乙腈～0.2％磷酸為流動相和乙腈～0.05％冰醋酸、乙腈～0.1％冰醋酸、乙腈～0.2％冰醋酸進行實驗，其他色譜條件同實施例1，結(jié)果如圖6所示，圖6中(a)為不加酸；(b)為乙腈～0.05％磷酸；(c)為乙腈～0.1％磷酸；(d)為乙腈～0.2％磷酸；(e)為乙腈-0.05％冰醋酸；(f)為乙腈～0.1％冰醋酸；(g)為乙腈～0.2％冰醋酸。

結(jié)果：以乙腈～0.2％冰醋酸(0～15min：10％～30％a；15～30min：30％～85％a；30～40min：85％～85％a；40～48min:85％～10％a)作為流動相進行梯度洗脫的時，色譜峰分離較好，且峰形很好，滿足分析的要求。

實施例1色譜條件方法學考查

精密度實驗：準確吸取混合對照品溶液，在所述色譜條件下連續(xù)進樣5次，測定時間為48min。利用綠原酸、橙皮苷和金絲桃苷的峰面積計算相對標準偏差分別為2.67％、3.58％和1.98％(見表4)。結(jié)果表明儀器精密度良好。

表4精密度實驗數(shù)據(jù)

重現(xiàn)性實驗：取批號相同的止咳寧嗽膠囊5份，供試品溶液的制備方法處理樣品，在所述色譜條件下進行測定。綠原酸、橙皮苷和金絲桃苷峰面積的相對標準偏差分別為5.74％、2.98％和3.71％(見表5)。結(jié)果表明該法重復性良好。

表5重復性實驗數(shù)據(jù)

穩(wěn)定性試驗：取同一樣品溶液，按照所述色譜條件分別測定0、2、4、6、8、10、12和24h的色譜圖。根據(jù)所得綠原酸、橙皮苷和金絲桃苷的峰面積，計算相對標準偏差分別為3.97％，2.05％和3.05％(見表6)。實驗數(shù)據(jù)表明樣品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表6穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù)

回收率試驗：精密稱取樣品2份，分別置于容量中，并計算出三種活性成分的含量，以80％的比例在每份樣品中均加入對應(yīng)且適量的綠原酸、橙皮苷和金絲桃苷對照品，混勻后按供試品溶液的測定方法進行含量測定，并計算三種活性成分的平均回收率。再以100％、120％的比例進行加標回收實驗，所得數(shù)據(jù)見表7-表9。

表7綠原酸回收率實驗數(shù)據(jù)

表8橙皮苷回收率實驗數(shù)據(jù)

表9金絲桃苷回收率實驗數(shù)據(jù)

線性關(guān)系及含量測定：取對照品溶液，分別在所述色譜條件下進行測定。以濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，做峰面積-濃度關(guān)系曲線，如圖3，圖3中(a)為綠原酸，(b)為橙皮苷，(c)為金絲桃苷。三種活性成分回歸方程見表10。根據(jù)色譜峰面積及線性關(guān)系方程計算可得止咳寧嗽膠囊中綠原酸、橙皮苷和金絲桃苷分別為0.16mg·g^-1，4.08mg·g^-1和0.04mg·g^-1。

表10線性關(guān)系方程

綜上，本發(fā)明所建立的高效液相色譜法同時測定止咳寧嗽膠囊中三種活性成分的含量，具有操作簡便、精密度好、重復性高的特點，可全面、更有效地控制該藥的質(zhì)量。