本發(fā)明涉及富勒烯材料的應用領域，特別涉及基于富勒烯或其衍生物采用熒光分子探針檢測氧氣的方法。

背景技術：

氧氣在生物生命活動中發(fā)揮著舉足輕重的作用。生物體內的細胞需要氧氣來進行有氧代謝從而維持日常生理活動。缺氧會使生物的生命活動受到嚴重的損害，情況嚴重可能會出現(xiàn)昏迷甚至死亡。而氧過量則會造成“氧中毒”，導致眩暈，感覺遲鈍、刺痛感覺、視覺以及聽覺受損、意識減退等癥狀。只有適當?shù)难鯘舛炔艜S持生物生命活動的正常進行。所以對生物體內的氧含量的檢測就顯得至關重要。

目前已有一些氧氣檢測方法如滴定法、電流分析法、熱致發(fā)光法。雖然，這些方法可以有效的檢測氧氣的含量，但是也存在著一些弊端，比如：響應時間長，無法持續(xù)檢測，極易被其他氣體干擾，而且需要的成本也比較高等，對于微量的氧氣很難通過儀器精準的進行觀察和測量。

現(xiàn)有可采用熒光探針檢測活性氧。單線態(tài)氧是氧氣的一種激發(fā)態(tài)，也是一種高活性的分子，也是一種典型的活性氧分子。大多數(shù)單線態(tài)氧熒光探針都是基于它與蒽的反應。大多數(shù)單線態(tài)氧熒光探針是選擇蒽或者9,10-二苯蒽作為識別基團。熒光探針在單線態(tài)氧的作用下，發(fā)生環(huán)加成反應生成內過氧化物，熒光團的熒光得到猝滅，從而達到檢測單線態(tài)氧的目的。

因此，可將氧氣在一定條件下轉變成單線態(tài)氧，借助熒光分子與單線態(tài)氧相互作用后熒光顯著變化的特性來設計一種響應時間快、選擇性好、靈敏度高、操作簡單的用來檢測氧氣濃度的熒光分子探針，其有望在生物科學、基礎醫(yī)學和環(huán)境檢測等領域中被廣泛應用。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決上述現(xiàn)有技術中的問題，本發(fā)明提供了一種采用熒光分子探針檢測氧氣的方法，具體為基于富勒烯或富勒烯衍生物并采用熒光分子探針來檢測氧氣的方法。

本發(fā)明所提供的采用熒光分子探針檢測氧氣的方法，包括如下步驟：

(1)將富勒烯和/或富勒烯衍生物溶解在鹵代苯、烷基苯或二硫化碳中，配制成含有富勒烯和/或富勒烯衍生物的溶液，即為溶液1；

(2)將熒光分子溶解在鹵代苯、烷基苯或二硫化碳中，配制成含有熒光分子的溶液，即為溶液2；

(3)將溶液1和溶液2混合，得到含有富勒烯和/或富勒烯衍生物的熒光分子溶液；

(4)將步驟(3)得到的混合溶液抽真空，使氧氣濃度降為0ml/cm³，得到檢測體系；

(5)在光照條件下，建立檢測體系中熒光信號強度與氧含量的線性關系；

(6)將待測樣品通入到與步驟(4)相同的檢測體系中，并在與步驟(5)相同的光照條件下測定檢測體系中熒光信號強度，進而計算得到待測樣品中的氧含量。

富勒烯和/或富勒烯衍生物在光照條件下能夠與不同濃度的氧氣相互作用產生單線態(tài)氧，熒光分子與單線態(tài)氧反應生成熒光分子的環(huán)氧化合物即內過氧化合物，環(huán)氧化合物熒光強度低或不發(fā)出熒光，即發(fā)生熒光猝滅。

熒光分子和單線態(tài)氧的反應為可逆反應：由于熒光分子與單線態(tài)氧反應生成的環(huán)氧化合物具有熱不穩(wěn)定性，在加熱條件下，在溫度范圍為100～120℃，加熱時間為20～60min的條件下，環(huán)氧化合物能夠發(fā)生可逆的反應重新變成熒光強度很大的熒光分子，這使得這種熒光探針可以反復利用，高效、便捷。利用熒光分子本體的特征紫外吸收以及環(huán)氧化合物生成之后特征的紫外吸收的變化，能夠發(fā)現(xiàn)幾乎90％以上的環(huán)氧化合物都能進行可逆的反應(參見圖1)。

所述富勒烯包括空心富勒烯和內嵌富勒烯的至少一種。

所述空心富勒烯包括通式為c2m的由碳原子組成的籠狀結構的富勒烯，其中30≤m≤60，可選的為c60、c70、c76、c78、c82、c84中的至少一種。

所述內嵌富勒烯包括n@c60、la@c72、sc2@c74、sc2@c76、la2@c80、sc3n@c80、tm@c82、gd@c82、sc2c2@c84中的至少一種；

所述富勒烯衍生物包括富勒烯氧化物和富勒烯加成產物中的至少一種，可選的富勒烯氧化物為c60o、c70o中的至少一種，富勒烯加成產物為富勒烯1,3-偶極環(huán)加成產物、富勒烯賓格爾加成產物中的至少一種。

所述熒光分子為具有聯(lián)苯結構的共軛結構有機分子，可選的為9,10-二苯蒽、9-蒽-β-丙酸。

所述鹵代苯為氯苯，烷基苯為甲苯。

所述溶液1中富勒烯和/或富勒烯衍生物的濃度為10^-6mol/l～10^-2mol/l。

所述溶液2中熒光分子的濃度為10^-6mol/l～10^-2mol/l。

所述步驟(3)中溶液1和溶液2進行混合時，溶液1∶溶液2的體積比＝1∶3～3∶1。

通入的所述待測樣品可包括氣態(tài)樣品或液態(tài)樣品。

所述光照條件包括氙燈照射、鹵燈照射、汞燈照射，可選的為氙燈照射，進一步可選的為氙燈白光光源照射。

所述光照強度為1mw～30mw，光照時間為1min～60min。

步驟(5)中所述建立檢測體系中熒光信號強度與氧含量的線性關系的具體步驟是：在檢測體系中，根據(jù)多個氧氣濃度以及每個氧氣濃度對應的熒光強度繪制橫坐標為氧氣濃度、縱坐標為熒光信號強度的標準曲線圖并確定線性范圍。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)富勒烯和/或富勒烯衍生物在光照條件下能夠與不同濃度的氧氣相互作用，經檢測esr(electronspinresonance)電子自旋共振信號變化證明該相互作用能夠高效產生不同量的單線態(tài)氧(¹o2)，而熒光分子和單線態(tài)氧相互作用所得終產物經核磁共振氫譜檢測，可證明為環(huán)氧化合物。由于在光照條件下、且在富勒烯和/或富勒烯衍生物和熒光分子足量的情況下，氧氣形成單線態(tài)氧以及單線態(tài)氧與熒光分子反應的速度均非常迅速，因此可粗略認為最先檢測到氧氣時的氧氣濃度即為該檢測方法可檢測到的最低氧氣濃度。在實施例1的實驗條件下，通入氧氣2s后即可檢測到熒光發(fā)生下降，此時檢測體系中氧氣濃度為0.0707ml/cm³，檢測限低，檢測靈敏度高；在實施例3的實驗條件下，光照2min后檢測體系熒光強度就發(fā)生明顯的下降，下降率約為89％，檢測方法的響應速度快，因此該檢測方法高效，可操作性強。

(2)可以選用的富勒烯種類多，制備分離純化的條件已經比較成熟。

(3)選用的熒光分子性質穩(wěn)定，成本低廉，熒光特性明顯。

(4)氧氣檢測完畢后，在加熱條件下所得環(huán)氧化合物即內過氧化物90％能夠發(fā)生可逆反應，重新變成熒光強度很大的熒光分子，使得熒光探針可以反復利用。

附圖說明

圖1是9,10-二苯蒽熒光分子可逆變化的紫外-可見吸收光譜。

圖2是實施例1的熒光探針9,10-二苯蒽在空心富勒烯存在的條件下與單線態(tài)氧的作用過程圖。

圖3是熒光探針9,10-二苯蒽與¹o2反應前后的核磁共振氫譜圖。

圖4是實施例1中的檢測體系加入捕獲劑temp(2,2,6,6-四甲基哌啶醇)條件下光照前后的esr(electronspinresonance)電子自旋共振變化圖。

圖5是實施例1的檢測結果驗證步驟中得到的檢測體系經不同時間光照的熒光猝滅光譜圖。

圖6是實施例2的熒光探針9-蒽-β-丙酸在空心富勒烯存在的條件下與單線態(tài)氧的作用過程圖。

圖7是熒光探針9-蒽-β-丙酸與¹o2反應前后的核磁共振氫譜圖。

圖8是實施例2的檢測結果驗證步驟中得到的檢測體系經不同時間光照的熒光猝滅光譜圖。

圖9是實施例3的熒光探針9,10-二苯蒽與在內嵌富勒烯存在的條件下與單線態(tài)氧的作用過程圖。

圖10是實施例3的檢測結果驗證步驟中得到的檢測體系經不同時間光照的熒光猝滅光譜圖。

圖11是在實施例1條件下不同氧氣含量對應的熒光信號強度的下降趨勢圖。

具體實施方式

下面結合附圖，對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述，但應當理解本發(fā)明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。

以下實施例如無特殊說明，檢測體系均是建立在4cm³的密閉容器中，其中該容器中的檢測體系均為3ml，即含有富勒烯和/或富勒烯衍生物的熒光分子溶液均為3ml。

實施例1～實施例3的檢測體系中熒光強度值均是在最大吸收值為445nm的檢測條件下讀取出來的。

實施例1

一種基于富勒烯c60采用熒光分子探針9,10-二苯蒽檢測氧氣的方法，反應路線圖參見圖2，包括如下步驟：

(1)將富勒烯c60溶解在二硫化碳中，配制成富勒烯c60濃度為10^-3mol/l的溶液1；

(2)將熒光分子9,10-二苯蒽溶解在二硫化碳中，配制成9,10-二苯蒽濃度為10^-2mol/l溶液2；

(3)按溶液2∶溶液1的體積比為1∶1，將溶液2加入到溶液1中，得到含有富勒烯c60的熒光分子溶液；

(4)將步驟(3)得到的混合溶液抽真空，使氧氣濃度降為0ml/cm³，得到檢測體系，然后分別將0ml、0.555ml、1.11ml、1.665ml、2.22ml、2.775ml、3.33ml體積的純氧氣通入7個獨立的檢測體系中，每個檢測體系中的氧氣濃度依次為0ml/cm³、0.1388ml/cm³、0.2775ml/cm³、0.4163ml/cm³、0.555ml/cm³、0.6938ml/cm³、0.8325ml/cm³；

(5)用波長為200～1000nm的20mw的氙燈白光光源照射(其中在445nm樣品具有最大吸收)以上檢測體系2min，密閉容器中的氧氣產生單線態(tài)氧，熒光分子與單線態(tài)氧生成環(huán)氧化合物，發(fā)生熒光猝滅，檢測體系中熒光信號強度，繪制圖11所示的橫坐標為氧氣濃度、縱坐標為信號強的標準曲線圖。

其中，氧氣通入的具體過程是：通過一個直徑為0.3mm的小孔，向含有以上3ml檢測體系的密閉容器中以2m/s的流速通入氧氣。

當通入氧氣2s后，可檢測到熒光發(fā)生下降，說明向檢測體系通入氧氣2s后，在富勒烯存在下，環(huán)氧化合物開始產生，此時對應通入的氧氣體積為：(2m/s×2s×10²)×(π×(0.3mm/2)²×10^-2)＝0.2826ml，進而得到通入2s時檢測體系的氧氣濃度為：0.2826/4＝0.0707ml/cm³。

由圖11可以得出，在氧氣濃度為0.707ml/cm³至0.555ml/cm³的范圍內，熒光信號強度隨氧氣濃度的增加呈現(xiàn)線性變化，得到的函數(shù)是：

y＝3398.2-4173.8x

式中，x為氧氣濃度，y為熒光強度

根據(jù)此公式，可以在相同條件下(即富勒烯和熒光分子的種類相同、含量相同，待測體系的光線種類、照射時間相同)，根據(jù)檢測的待測樣品的熒光信號的強度值得到待檢測樣品中氧氣的濃度，從而檢測出待測樣品中氧氣含量。

檢測結果驗證：重新準備一個新的體積為4ml的密閉容器，其檢測體系與上述步驟(4)中相同，將檢測體系抽真空，然后通入0.74ml純氧氣，待光照2min后，檢測到體系的熒光強度為2700a.u.；另外，將此氧氣濃度0.74/4＝0.185ml/cm³代入步驟(5)中所述線性函數(shù)y＝3398.2-4173.8x中，得到理論的熒光強度為2626a.u.，與檢測到的熒光強度2700a.u.僅相差74a.u.，在誤差容許范圍內，因此本發(fā)明采用的檢測方法可用于檢測待測樣品中氧氣的具體含量。因此，此檢測方法能夠精確地檢測較低濃度的氧氣含量。

在圖3核磁共振氫譜圖中(采用dmso作為氘代試劑)，a、b、c、d、e分別代表9,10-二苯蒽對應的五種氫，a’、b’、c’、d’、e’代表9,10-二苯蒽內過氧化物的五種氫。圖3中最上面的圖代表9,10-二苯蒽和富勒烯混合均勻未光照的核磁氫譜圖，從氫譜中可以看到9,10-二苯蒽并未發(fā)生改變，說明在未光照的條件下9,10-二苯蒽與富勒烯不發(fā)生化學反應；下面的兩幅圖分別代表向9,10-二苯蒽和富勒烯混合均勻的溶液通氧氣20s、100s且在氙燈光源下光照2min后的核磁氫譜，可以看到，氫譜中出現(xiàn)了新的物質，說明光照條件下混合溶液發(fā)生了化學反應。當通氧量為20s時，9,10-二苯蒽還有剩余，氫譜顯示的是9,10-二苯蒽和9,10-二苯蒽內過氧化物的混合物；當通入100s時，9,10-二苯蒽完全反應，產物全部是9,10-二苯蒽內過氧化物。從氫譜中可以得出，比對體系光照前后兩種物質，氫的個數(shù)沒有發(fā)生變化，但是發(fā)生了相對的位移變化，說明有新的物質生成，比對氫的位置，可以確定新生成的物質為9,10-二苯蒽內過氧化物。

還通過esr電子自旋共振檢測單線態(tài)氧，檢測過程是：由于temp捕獲¹o2的能力很強，極少量的¹o2都可以捕獲到，因此選用temp(2,2,6,6-四甲基哌啶醇)為捕獲劑，temp捕獲到經光照后的檢測體系中的¹o2，生成了tempol(1-氧基-2,2,6,6-四甲基-4-羥基哌啶)，檢測到tempol的esr信號明顯增強(參見圖4)，證明檢測體系生成了單線態(tài)氧¹o2，從而證明在富勒烯c60的作用下，經光照，將檢測體系中的氧氣轉變成了單線態(tài)氧，從而引起熒光的猝滅。

同時，由圖5可知，光照前體系熒光強度為3500a.u.，光照2min后，體系熒光強度變?yōu)?700a.u.，因此，含有9,10-二苯蒽和富勒烯c60的檢測體系經光照后熒光強度明顯下降，熒光強度的下降率為23％，響應時間快；同時隨著光照時間的延長，分子的熒光信號強度下降不明顯。

說明：圖5中的熒光信號強度由上到下依次為在9,10-二苯蒽+c60(未光照)、9,10-二苯蒽+c60(光照2min)、9,10-二苯蒽+c60(光照4min)、9,10-二苯蒽+c60(光照6min)、9,10-二苯蒽+c60(光照8min)、9,10-二苯蒽+c60(光照10min)、9,10-二苯蒽+c60(光照12min)的條件下得到的熒光信號強度。

實施例2

一種基于富勒烯c60采用熒光分子探針9-蒽-β-丙酸檢測氧氣的方法，反應路線圖參見圖6，包括如下步驟：

(1)將富勒烯c60溶解在二硫化碳中，配制成富勒烯c60濃度為10^-3mol/l的溶液1；

(2)將熒光分子9-蒽-β-丙酸溶解在二硫化碳中，配制成9-蒽-β-丙酸濃度為10^-4mol/l溶液2；

(3)按溶液2：溶液1的體積比為1:1，將溶液1加入到溶液2中，得到含有富勒烯c60的熒光分子溶液；

(4)按上述實施例1中的步驟(4)構建7個檢測體系，同時按上述實施例1中的步驟(5)繪制橫坐標為氧氣濃度、縱坐標為信號強的標準曲線圖，進而得到熒光強度和氧氣濃度的線性函數(shù)，因此可以根據(jù)檢測的待測樣品的熒光信號的強度值得到待檢測樣品中氧氣的濃度。

檢測結果驗證：重新準備一個新的體積為4ml的密閉容器，其檢測體系與上述步驟(4)中相同，將檢測體系抽真空，然后通入0.74ml純氧氣，待光照2min后，檢測到體系的熒光強度為2400a.u.；同時，根據(jù)步驟(4)得到的函數(shù)以及氧氣濃度0.74/4＝0.185ml/cm³，得到理論的熒光強度為2320a.u.，與檢測到的熒光強度2400a.u.僅相差80a.u.，在誤差容許范圍內。因此，此檢測方法能夠精確地檢測較低濃度的氧氣含量。

圖7的核磁共振氫譜圖中(采用cdcl3作為氘代試劑)，a、b、c、d、e、f分別代表9-蒽-β-丙酸對應的六種氫，a’、b’、c’、d’、e’、f’代表9-蒽-β-丙酸內過氧化物的六種氫。圖7中最上面的圖代表9-蒽-β-丙酸和富勒烯混合均勻未光照的核磁氫譜圖，從氫譜中可以看到9-蒽-β-丙酸并未發(fā)生改變，說明在未光照的條件下9-蒽-β-丙酸與富勒烯不發(fā)生化學反應；下面的圖代表向9-蒽-β-丙酸和富勒烯混合均勻的溶液通氧氣20s且在氙燈光源下光照2min后的核磁氫譜，可以看到，氫譜中出現(xiàn)了新的物質，說明在光照的條件下混合溶液中發(fā)生了化學反應。當通氧20s時，9-蒽-β-丙酸還有剩余，氫譜顯示的是9-蒽-β-丙酸和9-蒽-β-丙酸內過氧化物的混合物。從氫譜中可以得出，比對體系光照前后兩種物質，氫的個數(shù)沒有發(fā)生變化，但是發(fā)生了相對的位移變化，證明有新的物質生成，比對氫的位置，可以確定新生成的物質為9-蒽-β-丙酸內過氧化物。

由圖8可知，光照前體系熒光強度為5500a.u.，光照2min后，體系熒光強度為2400a.u.，因此，含有9-蒽-β-丙酸和富勒烯c60的檢測體系經光照后熒光強度明顯下降，熒光強度的下降率為56％，響應時間快；同時隨著光照時間的延長，分子的熒光信號強度下降不明顯。

說明：圖8中的熒光信號強度由上到下依次為在9-蒽-β-丙酸+c60(未光照)、9,10-二苯蒽+c60(光照2min)、9,10-二苯蒽+c60(光照4min)、9,10-二苯蒽+c60(光照6min)、9,10-二苯蒽+c60(光照8min)、9,10-二苯蒽+c60(光照10min)、9,10-二苯蒽+c60(光照12min)的條件下得到的熒光信號強度。

實施例3

一種基于內嵌富勒烯sc3n@c80采用熒光分子探針9,10-二苯蒽檢測氧氣的方法，包括如下步驟：

(1)將內嵌富勒烯sc3n@c80溶解在二硫化碳中，配制成內嵌富勒烯sc3n@c80濃度為10^-3mol/l的溶液1；

(2)將熒光分子9,10-二苯蒽溶解在二硫化碳中，配制成9,10-二苯蒽濃度為10^-4mol/l溶液2；

(3)按溶液1與溶液2的體積比為1:1，將溶液1加入到溶液2中，得到含有內嵌富勒烯sc3n@c80的熒光分子溶液；

(4)按上述實施例1中的步驟(4)構建7個檢測體系，同時按上述實施例1中的步驟(5)繪制橫坐標為氧氣濃度、縱坐標為信號強的標準曲線圖，進而得到熒光強度和氧氣濃度的線性函數(shù)，因此可以根據(jù)檢測的待測樣品的熒光信號的強度值得到待檢測樣品中氧氣的濃度。

檢測結果驗證：重新準備一個新的體積為4ml的密閉容器，其檢測體系與上述步驟(4)中相同，將檢測體系抽真空，然后通入0.74ml純氧氣，待光照2min后，檢測到體系的熒光強度為300a.u.；同時，根據(jù)步驟(4)得到的函數(shù)以及氧氣濃度0.74/4＝0.185ml/cm³，得到理論的熒光強度為350a.u.，與檢測到的熒光強度300a.u.僅相差50a.u.，在誤差容許范圍內。因此，此檢測方法能夠精確地檢測較低濃度的氧氣含量。

由圖10可知，光照前熒光強度為2750a.u.，光照2min后，體系熒光強度為300a.u.，因此，含有9-蒽-β-丙酸和內嵌富勒烯sc3n@c80的檢測體系經光照后熒光強度明顯下降，熒光強度下降率為89％，響應時間快；同時隨著光照時間的延長，分子的熒光信號強度下降不明顯。

說明：圖10中的熒光信號強度由上到下依次為在9,10-二苯蒽+sc3n@c60(未光照)、9,10-二苯蒽+sc3n@c60(光照2min)、9,10-二苯蒽+sc3n@c60(光照4min)、9,10-二苯蒽+sc3n@c60(光照6min)、9,10-二苯蒽+sc3n@c60(光照8min)、9,10-二苯蒽+sc3n@c60(光照10min)、9,10-二苯蒽+sc3n@c60(光照12min)的條件下得到的熒光信號強度。

前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應用，從而使得本領域的技術人員能夠實現(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。