本發(fā)明涉及一種利用細(xì)胞原位合成制備的dna銀納米簇用于干細(xì)胞增殖和分化過程中端粒酶的長期監(jiān)控，屬于材料合成及生物成像與傳感技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

端粒酶(telomerase)是負(fù)責(zé)端粒延長的一種酶，端粒縮短的細(xì)胞復(fù)制能力受限，端粒酶能以自身rna為模版延長端粒長度，從而保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性，在細(xì)胞增殖及分化過程中起重要作用。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，常用于臨床上治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損，相較于骨髓源和脂肪源干細(xì)胞，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞易取材且不受倫理法制限制，在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用更為廣泛。然而，影響人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化潛力的重要的端粒酶在上述過程中的表達(dá)，卻未曾有實時原位監(jiān)測的方法。

銀納米簇具有光穩(wěn)定性好，毒性小，尺寸小等特性，常應(yīng)用于生物標(biāo)記。另外一些特定的堿基，金屬離子和生物分子會影響銀納米簇的熒光，使其增強或者猝滅。因而可以利用不同寡核苷酸修飾的銀納米簇作為多功能熒光探針，用來高靈敏檢測細(xì)胞內(nèi)功能分子如酶、葡萄糖、蛋白質(zhì)、dna等。

然而化學(xué)方法合成的dna-銀納米簇雖用途廣泛生物相容性較好，但仍易被免疫系統(tǒng)通過腎清除排出體外，從而限制了探針在生物體內(nèi)的停留時間，無法長期實時監(jiān)控端粒酶等其他功能分子的活性。

本發(fā)明公開的一種新的誘導(dǎo)細(xì)胞原位合成的方法來制備dna銀納米簇可用于細(xì)胞內(nèi)端粒酶的長期監(jiān)控。因生物方法原位合成的dna銀納米簇可以不受限于細(xì)胞免疫排斥的影響，極高的生物相容性大大提高了探針在生物體內(nèi)的滯留時間，使得探針可以長期留在細(xì)胞內(nèi)，對細(xì)胞在生長分化過程中的狀態(tài)進行實時動態(tài)成像。還可以作為一種納米熒光探針來識別和標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的功能分子，為活體熒光實時動態(tài)成像及細(xì)胞疾病的早期診斷和治療提供了新的思路和方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種利用細(xì)胞原位合成制備dna銀納米簇，用于干細(xì)胞增殖和分化過程中端粒酶的長期監(jiān)控；干細(xì)胞中谷胱甘肽(gsh)含量顯著高于普通細(xì)胞，gsh是一種含有巰基的三肽，是動物細(xì)胞中關(guān)鍵的抗氧化劑，真核細(xì)胞通過其可逆的氧化還原反應(yīng)以維持細(xì)胞的活性氧平衡。當(dāng)干細(xì)胞輸入大量dna和銀離子，細(xì)胞內(nèi)部會通過gsh自發(fā)地還原組裝銀納米顆粒，形成dna為模板的銀納米簇。所述dna銀納米簇具有生物相容好，在體時間長和檢測靈敏度高的優(yōu)點。

本發(fā)明提供了一種細(xì)胞內(nèi)源dna銀納米簇的原位合成方法，所述方法包括以下步驟：

(1)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(gsh)的水平：

培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)75～85％左右時，加入琉辛酸(α-lipoicacid)進行共孵育。

步驟(1)中，所述細(xì)胞選自人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、人胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞；優(yōu)選地，為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

步驟(1)中，培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基的組分為sciencell公司提供的混有hmscs生長因子的高糖/f12(dmem/f12)培養(yǎng)液(貨號7501)。

步驟(1)中，優(yōu)選地，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)80％時，加入琉辛酸。

步驟(1)中，加入琉辛酸前，所述琉辛酸的濃度為4～8μm；優(yōu)選地，為5μm。

步驟(1)中，加入琉辛酸后，3ml培養(yǎng)液中，含10⁴個細(xì)胞，所述琉辛酸的濃度為5×10^-5μm。

步驟(1)中，所述琉辛酸的作用為誘導(dǎo)刺激細(xì)胞內(nèi)還原型的谷胱甘肽含量上調(diào)。

步驟(1)中，所述共孵育的溫度為37℃。

步驟(1)中，所述共孵育的時間為12-36h；優(yōu)選地，為24h。

步驟(1)中，所述共孵育優(yōu)選地在5％co2的條件下進行。

步驟(1)中，培養(yǎng)結(jié)束后，緩慢傾去培養(yǎng)液并用新鮮培養(yǎng)液替換，其目的是終止誘導(dǎo)、讓細(xì)胞恢復(fù)正常生長環(huán)境。

(2)檢測細(xì)胞內(nèi)gsh含量：

離心收集細(xì)胞，凍融破碎細(xì)胞，釋放細(xì)胞中的gsh，用試劑盒測定gsh的含量。

步驟(2)中，收集細(xì)胞前還包括用pbs洗滌細(xì)胞的步驟。

步驟(2)中，收集細(xì)胞進行凍融破碎前，還包括加入蛋白去除試劑的步驟。

步驟(2)中，所述凍融破碎細(xì)胞的方法為，利用液氮和37℃水浴對樣品進行兩次快速的凍融破碎細(xì)胞。

步驟(2)中，所述測定gsh的試劑盒是dtnb試劑盒。

步驟(2)中，將所測定的誘導(dǎo)后的細(xì)胞內(nèi)gsh含量的結(jié)果與空白細(xì)胞內(nèi)的gsh含量測定結(jié)果對照，如果上調(diào)后的細(xì)胞內(nèi)的gsh含量高于空白細(xì)胞內(nèi)的gsh含量的15％，則說明上調(diào)成功?；蛘?，如果上調(diào)后的細(xì)胞內(nèi)的gsh含量接近肝癌hepg2細(xì)胞內(nèi)的gsh含量(71μg/gprotein)，則說明細(xì)胞內(nèi)的gsh含量適用于進行轉(zhuǎn)染等步驟。

(3)轉(zhuǎn)染dna：

取上述已上調(diào)gsh含量的細(xì)胞，加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液和轉(zhuǎn)染液進行培養(yǎng)，去除培養(yǎng)液和轉(zhuǎn)染液。加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

步驟(3)中，所述新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液為sciencecell公司提供的混有hmscs生長因子的高糖/f12(dmem/f12)培養(yǎng)液(貨號7501)。

步驟(3)中，加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液和轉(zhuǎn)染液后，培養(yǎng)的時間為2-4h；優(yōu)選地，為4小時。

步驟(3)中，加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)時間為2-4h；優(yōu)選地，為2小時。

步驟(3)中，所述細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)液、轉(zhuǎn)染液的用量比為10⁵個：3ml：88.75μl。

步驟(3)中，所述轉(zhuǎn)染液的配方是，88.75μl不含抗生素和谷氨酰胺(glutamine)的dmem溶液，22.5μllipotap及3.75μgdna；所述dna序列是gcccccccc；即，所述轉(zhuǎn)染液包括：88.75μl不含抗生素和glutamine的dmem溶液，22.5μllipotap及3.75μgdnagcccccccc。

步驟(3)中，所述加入轉(zhuǎn)染液的手法是，在一潔凈無菌離心管內(nèi)依次加入上述成份后用槍輕輕吹打混勻，25℃孵育10分鐘后再把上述混合物均勻加入到培養(yǎng)盒內(nèi)，隨后輕輕混勻。

(4)誘導(dǎo)細(xì)胞原位合成dna銀納米簇：

倒去培養(yǎng)液，加入agno3共孵育；然后用新鮮dmem替換，陳化后置于熒光顯微鏡下觀察；另取部分細(xì)胞裂解收集dna銀納米簇，進行形貌觀察和成分分析。

步驟(4)中，加入agno3前還包括用hepes緩沖液沖洗細(xì)胞的步驟。

步驟(4)中，所述agno3的濃度為0.005-0.1mm；優(yōu)選地，為0.01m。

步驟(4)中，所述agno3的用量為10⁵個細(xì)胞中加入100μl的0.01magno3。

步驟(4)中，所述共孵育的溫度為30-37℃；優(yōu)選地，為37℃。

步驟(4)中，所述共孵育的時間為5min-2h；優(yōu)選地，為20min。

步驟(4)中，所述陳化時間為12h-48h；優(yōu)選地，為24h。

步驟(4)中，裂解細(xì)胞的方法為，利用液氮和37℃水浴對細(xì)胞進行兩次快速的凍融，破碎細(xì)胞。

步驟(4)中，所述收集dna銀納米簇的方法是，離心除去破碎的細(xì)胞膜，收集懸濁液，即是dna銀納米簇；優(yōu)選地，在1500rpm/min下離心l0min除去破碎的細(xì)胞膜。

本發(fā)明還提供了由上述方法制備得到的dna銀納米簇，所述dna銀納米簇在經(jīng)上述方法處理的msc細(xì)胞的樹脂切片中富集在食物泡周圍，為黑色簇狀物；將細(xì)胞裂解，提取其中的dna銀納米簇，可以得知，所述dna銀納米簇為均勻分散的納米簇，銀納米簇高度約為2.7nm，粒徑約為3.1nm，晶面間距為0.24nm；在360nm和470nm附近有明顯紫外吸收峰；并且使用488nm光源激發(fā)時有較強的610nm的熒光發(fā)射；x光電子能譜表征在366.4ev處有明顯峰，對應(yīng)于零價銀的3d5/2。如圖2～4是本發(fā)明一具體實施方式制備的dna銀納米簇。

本發(fā)明還提供了將所述dna銀納米簇用于端粒酶的長期監(jiān)控的應(yīng)用，尤其是用于干細(xì)胞增殖和分化過程中端粒酶的長期監(jiān)控。

本發(fā)明還提供了一種利用上述dna銀納米簇原位監(jiān)測人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在增殖過程中的端粒酶活性變化的方法，所述方法包括以下步驟：

經(jīng)上述方法誘導(dǎo)細(xì)胞原位合成dna銀納米簇，利用熒光共聚焦顯微鏡觀察相應(yīng)的樣品，采用488nm波長進行激發(fā)，進行共熒光成像觀察。并利用軟件計算每個細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強度，對比得到每代間充質(zhì)干細(xì)胞中的端粒酶相對活性。

其中，所述細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；優(yōu)選地，為第一代的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

其中，所述熒光共聚焦顯微鏡的觀察樣品時，采用488nm波長進行激發(fā)，63x的物鏡倍數(shù)進行共熒光成像觀察。

其中，所述計算端粒酶相對活性的方法，指的是用每代細(xì)胞成像隨機得到的50個細(xì)胞區(qū)域內(nèi)熒光強度平均值，以第三代為基準(zhǔn)取相對值即為每代間充質(zhì)干細(xì)胞中的端粒酶相對活性。

本發(fā)明還提供了一種利用上述dna銀納米簇原位監(jiān)測人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成神經(jīng)干細(xì)胞過程的端粒酶活性變化的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)將間充質(zhì)干細(xì)胞以一定濃度接種于培養(yǎng)瓶，一段時間后更換成誘導(dǎo)液，在倒置顯微鏡下定期觀察細(xì)胞的生長情況及其形態(tài)變化，并拍照紀(jì)錄；誘導(dǎo)結(jié)束后，進行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白巢蛋白免疫熒光鑒定，計算其分化前后端粒酶活性的變化；

(b)將成功分化的神經(jīng)干細(xì)胞繼續(xù)傳代，重復(fù)步驟(1)同樣方法監(jiān)控其生長情況和端粒酶活性變化。

步驟(a)中，所述接種的濃度為5×10⁹l^-1。

步驟(a)中，接種后，培養(yǎng)2-12小時，加入誘導(dǎo)液；優(yōu)選地，培養(yǎng)8h，加入誘導(dǎo)液。

步驟(a)中，所述誘導(dǎo)液的配方為：含質(zhì)量百分比2％的b27和60g/l的葡萄糖的dmem/f12培養(yǎng)基，另加20μg/l的表皮生長因子(egf)和20μg/l的堿性成纖維生長因子(fgf)。

步驟(a)中，加入誘導(dǎo)液的用量和細(xì)胞用量之間的關(guān)系為3ml/5×10⁹個細(xì)胞。

步驟(a)中，加入誘導(dǎo)液誘導(dǎo)的時間為14-21天；優(yōu)選地，為18天。

步驟(a)中，采用常規(guī)方法對神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白巢蛋白，并進行免疫熒光鑒定。

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述細(xì)胞原位合成的方法來制備dna銀納米簇的制備方法和用其長期監(jiān)控干細(xì)胞內(nèi)端粒酶的活性的方法，包括以下步驟：

(1’)細(xì)胞內(nèi)源dna銀納米簇的原位合成

(a’)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)gsh水平：將細(xì)胞培養(yǎng)在25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)80％左右時加入琉辛酸(α-lipoicacid)在37攝氏度，5％co2的條件下共孵育24h后，緩慢傾去培養(yǎng)液并用新鮮培養(yǎng)液替換。

其中所述的加入琉辛酸(α-lipoicacid’)的體積是10μl，濃度是5μm。

(b’)檢測細(xì)胞內(nèi)gsh含量：用pbs洗滌細(xì)胞一次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清。加入細(xì)胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑，然后利用液氮和37℃水浴對樣品進行兩次快速的凍融破碎細(xì)胞。4℃或冰浴放置5分鐘后，4℃，10000g離心10分鐘。取上清用試劑盒測定谷胱甘肽的含量。

其中，所述的試劑盒是dtnb試劑盒。

(c’)轉(zhuǎn)染dna：取上述已上調(diào)gsh含量的細(xì)胞，確保細(xì)胞盒中準(zhǔn)確加入3毫升新鮮培養(yǎng)液，按照lipotap轉(zhuǎn)染試劑盒加入轉(zhuǎn)染夜。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時后，去除含有l(wèi)ipotap-dna的培養(yǎng)液。加入3ml新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2h。

其中，所述的加入轉(zhuǎn)染液的配方是，適量不含抗生素和glutamine的dmem溶液，22.5μllipotap及3.75μgdna，最終體積為115μl；所述的轉(zhuǎn)染液的dna的序列是gcccccccc；所述的加入轉(zhuǎn)染液的方法是，在一潔凈無菌離心管內(nèi)依次加入上述成份后用槍輕輕吹打混勻，25℃孵育10分鐘后再把上述混合物均勻加入到培養(yǎng)盒內(nèi)，隨后輕輕混勻。

(d’)誘導(dǎo)細(xì)胞原位合成dna銀納米簇：緩慢傾倒掉培養(yǎng)液，用hepes緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞兩次，加入100μl的0.01magno3共孵育20min。之后用新鮮dmem替換溶液，陳化24h后置于熒光顯微鏡下觀察。另取部分細(xì)胞裂解收集銀納米簇，進行形貌觀察和成分分析。

其中，所述的裂解細(xì)胞的方法是利用液氮和37℃水浴對樣品進行兩次快速的凍融破碎細(xì)胞；所述的收集dna銀納米簇的方法是，1500rpm/min離心l0min除去破碎的細(xì)胞膜，收集懸濁液即是dna銀納米簇。

(2’)原位監(jiān)測人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在增殖過程中的端粒酶活性變化

端粒酶傳感器的構(gòu)建：將第一代的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)步驟(1)處理后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每到傳代時，取部分鋪板。利用熒光共聚焦顯微鏡觀察相應(yīng)的樣品，采用488nm波長進行激發(fā)，63x的物鏡倍數(shù)進行共熒光成像觀察。并利用軟件計算每個細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強度，對比得到每代間充質(zhì)干細(xì)胞中的端粒酶相對活性。

其中所述的計算端粒酶相對活性的方法，指的是用每代細(xì)胞成像隨機得到的50個細(xì)胞區(qū)域內(nèi)熒光強度平均值，以第三代為1取相對值即為每代間充質(zhì)干細(xì)胞中的端粒酶相對活性。

另取每代間充質(zhì)干細(xì)胞裂解并提取端粒酶使用elisa試劑盒檢測每代細(xì)胞的端粒酶活性。

(3’)誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化成神經(jīng)干細(xì)胞并原位監(jiān)控該過程的端粒酶活性變化

借助傳感器監(jiān)控端粒酶在干細(xì)胞分化過程中的表達(dá)：將每代間充質(zhì)干細(xì)胞以一定濃度接種于25ml培養(yǎng)瓶，一段時間后更換成誘導(dǎo)液，在倒置顯微鏡下定期觀察細(xì)胞的生長情況及其形態(tài)變化，并拍照紀(jì)錄。誘導(dǎo)結(jié)束后，進行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白巢蛋白免疫熒光鑒定。取每代間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化得到的神經(jīng)干細(xì)胞重復(fù)步驟(3)計算其分化前后端粒酶活性的變化，另將成功分化的神經(jīng)干細(xì)胞分別繼續(xù)傳代，重復(fù)同樣方法監(jiān)控其生長情況和端粒酶活性變化。

另取每代間充質(zhì)干細(xì)胞分化后的神經(jīng)干細(xì)胞裂解并提取端粒酶使用elisa試劑盒檢測每代細(xì)胞的端粒酶活性

本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明首先采用誘導(dǎo)細(xì)胞原位合成的方法來制備dna銀納米簇，因生物方法原位合成的dna銀納米簇不受限于細(xì)胞免疫排斥的影響，在生物體內(nèi)的滯留時間長，可用于細(xì)胞內(nèi)端粒酶的長期監(jiān)控。原位合成dna銀納米簇的方法中采用藥物誘導(dǎo)細(xì)胞的還原型谷胱甘肽(gsh)水平上調(diào)，然后輸入大量的dna和銀離子，誘導(dǎo)細(xì)胞自發(fā)地還原組裝成銀納米顆粒，形成dna銀納米簇。由于本發(fā)明原位合成的dna銀納米簇的方法中使用的dna模版是富c序列，方便銀納米簇靠近端粒的重復(fù)序列(ttaggg)n，又因為銀納米簇靠近富g堿基序列時會有熒光增強的效應(yīng)，因而可以用來監(jiān)控端粒酶的活性。本發(fā)明使用該生物方法原位合成的dna銀納米簇可用于長期監(jiān)控人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化過程中端粒酶活性變化，不受限于細(xì)胞免疫排斥的影響，極高的生物相容性大大提高了探針在生物體內(nèi)的滯留時間，使得探針可以長期留在細(xì)胞內(nèi)實時動態(tài)成像干細(xì)胞在增殖分化過程中的狀態(tài)。因該探針可以長期留在細(xì)胞內(nèi)，實現(xiàn)對細(xì)胞在生長分化過程中的端粒酶活性進行實時動態(tài)成像，為活體熒光實時動態(tài)成像及細(xì)胞疾病的早期診斷和治療提供了新的思路和方法。本發(fā)明方法還可以通過更換不同序列的寡核苷酸修飾銀納米簇作為多功能熒光探針，用來高靈敏檢測細(xì)胞內(nèi)其他功能分子如酶、葡萄糖、蛋白質(zhì)、dna等，可廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記及疾病監(jiān)測等領(lǐng)域。

附圖說明

圖1是實施例1中上調(diào)msc細(xì)胞內(nèi)的gsh后，用試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)gsh含量的結(jié)果。

圖2是實施例1生物方法原位合成dna銀納米簇的msc細(xì)胞的樹脂切片電鏡照片。

圖3是實施例1生物方法原位合成的dna銀納米簇的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。

圖4是實施例1生物方法原位合成的dna銀納米簇的形貌表征圖；其中，a為原子力圖，b圖中對應(yīng)于a圖中線標(biāo)處銀納米簇高度，c為透射電鏡圖，d為高分辨射電鏡圖。

圖5是實施例1生物方法原位合成的dna銀納米簇的x光電子能譜表征。

圖6是實施例1生物方法原位合成的dna銀納米簇的用于msc細(xì)胞端粒酶活性成像的結(jié)果；其中，a為熒光成像圖，b為軟件計算得到的平均熒光強度，c為計算得到的相對端粒酶活性。

圖7是實施例1中誘導(dǎo)第三代msc細(xì)胞分化成nsc細(xì)胞的結(jié)果；其中，a為細(xì)胞形貌變化，b為免疫熒光鑒定nsc細(xì)胞的結(jié)果。

圖8是實施例1生物方法原位合成的dna銀納米簇的用于nsc細(xì)胞端粒酶活性成像的結(jié)果；其中，a為熒光成像圖，b為軟件計算得到的平均熒光強度，c為計算得到的相對端粒酶活性。

圖9是實施例1用elisa試劑盒檢測msc和nsc細(xì)胞端粒酶活性的結(jié)果。

具體實施方式

結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)說明。實施本發(fā)明的過程、條件、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制。

實施例1細(xì)胞內(nèi)源dna銀納米簇的原位合成

(1)實施例上調(diào)細(xì)胞內(nèi)gsh水平：

將細(xì)胞培養(yǎng)在25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)80％左右時加入10μl的5μm琉辛酸(α-lipoicacid)在37攝氏度，5％co2的條件下共孵育24h后，緩慢傾去培養(yǎng)液并用新鮮培養(yǎng)液替換。

用pbs將上述細(xì)胞洗滌一次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清。加入細(xì)胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑，然后利用液氮和37℃水浴對樣品進行兩次快速的凍融破碎細(xì)胞。4℃或冰浴放置5分鐘后，4℃，10000g離心10分鐘。取上清用dtnb試劑盒測定谷胱甘肽的含量。

(2)轉(zhuǎn)染dna：

取上述已上調(diào)gsh含量的細(xì)胞，確保細(xì)胞盒中準(zhǔn)確加入3毫升新鮮培養(yǎng)液，按照lipotap轉(zhuǎn)染試劑盒加入轉(zhuǎn)染夜。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時后，去除含有l(wèi)ipotap-dna的培養(yǎng)液。加入3ml新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2h。加入轉(zhuǎn)染液的配方是，適量不含抗生素和glutamine的dmem溶液，22.5μllipotap及3.75μgdna，最終體積為115μl；轉(zhuǎn)染液的dna的序列是gcccccccc；加入轉(zhuǎn)染液的手法是，在一潔凈無菌離心管內(nèi)依次加入上述成份后用槍輕輕吹打混勻，25℃孵育10分鐘后再把上述混合物均勻加入到培養(yǎng)盒內(nèi)，隨后輕輕混勻。

(3)誘導(dǎo)細(xì)胞原位合成dna銀納米簇：

緩慢傾倒掉培養(yǎng)液，用hepes緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞兩次，加入100μl的0.01magno3共孵育20min。之后用新鮮dmem替換溶液，陳化24h后置于熒光顯微鏡下觀察。另取部分細(xì)胞裂解收集銀納米簇，進行形貌觀察和成分分析。裂解細(xì)胞的方法是利用液氮和37℃水浴對樣品進行兩次快速的凍融破碎細(xì)胞；所述的收集dna銀納米簇的方法是，1500rpm/min離心l0min除去破碎的細(xì)胞膜，收集懸濁液即是dna銀納米簇。

圖1可以看到藥物誘導(dǎo)后的間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)的gsh含量大大提高。圖2為原位合成dna銀納米簇的msc細(xì)胞樹脂切片電鏡圖，可清晰的看到細(xì)胞內(nèi)食物泡周圍聚集有大量黑色簇狀物，即為所述dna銀納米簇。將細(xì)胞裂解，提取其中的dna銀納米簇進行表征。圖3為dna銀納米簇的光譜表征，銀納米簇在360nm和470nm附近有明顯紫外吸收峰，并且使用488nm光源激發(fā)時有較強的610nm的熒光發(fā)射(圖3)。圖4為銀納米簇的形貌表征圖，從結(jié)果可以看出成功合成均勻分散的納米簇。原子力圖可以看出銀納米簇高度約為2.7nm(圖4a)。從透射電鏡圖可看出，粒徑約為3.1nm，晶面間距為0.274nm(圖4c&d)。進一步通過x光電子能譜表征可以看出，銀納米簇在366.4ev處有明顯峰，對應(yīng)于零價銀的3d5/2，證明合成的銀納米簇是0價的(圖5)。本發(fā)明成功使用生物方法誘導(dǎo)細(xì)胞原位合成了dna銀納米簇。

實施例2實施例1原位合成的dna銀納米簇探針用于長期監(jiān)測干細(xì)胞增殖

分化過程中的端粒酶活性變化。

(1)原位監(jiān)測人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在增殖過程中的端粒酶活性變化：

將經(jīng)實施例1處理后的第一代的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每到傳代時，取部分鋪板。利用熒光共聚焦顯微鏡觀察相應(yīng)的樣品，采用488nm波長進行激發(fā)，63x的物鏡倍數(shù)進行共熒光成像觀察。并利用軟件計算每個細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強度，對比得到每代間充質(zhì)干細(xì)胞中的端粒酶相對活性。

計算端粒酶相對活性的方法，是用每代細(xì)胞成像隨機得到的50個細(xì)胞區(qū)域內(nèi)熒光強度平均值，以第三代為1取相對值即為每代間充質(zhì)干細(xì)胞中的端粒酶相對活性。

(2)誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化成神經(jīng)干細(xì)胞并原位監(jiān)控該過程的端粒酶活性變化

將每代間充質(zhì)干細(xì)胞以一定濃度接種于25ml培養(yǎng)瓶，一段時間后更換成誘導(dǎo)液，在倒置顯微鏡下定期觀察細(xì)胞的生長情況及其形態(tài)變化，并拍照紀(jì)錄。誘導(dǎo)結(jié)束后，進行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白巢蛋白免疫熒光鑒定。取每代間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化得到的神經(jīng)干細(xì)胞重復(fù)步驟(3)計算其分化前后端粒酶活性的變化，另將成功分化的神經(jīng)干細(xì)胞分別繼續(xù)傳代，重復(fù)同樣方法監(jiān)控其生長情況和端粒酶活性變化。

由圖6可知，隨著加入端粒酶抑制劑，銀納米簇的熒光強度大幅減弱，證明本發(fā)明中的原位合成的dna銀納米簇探針的熒光強度能靈敏響應(yīng)端粒酶活性變化。銀納米簇的熒光強度在間充質(zhì)干細(xì)胞傳至第三代時最亮，隨后迅速衰弱。這說明第三代間充質(zhì)干細(xì)胞的端粒酶活性最高。而后面的誘導(dǎo)分化實驗中也發(fā)現(xiàn)第三代間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能明顯高于其他幾代細(xì)胞，也從另一方面證明了第三代間充質(zhì)干細(xì)胞的端粒酶活性較好。雖然干細(xì)胞的前五代都能成功誘導(dǎo)出神經(jīng)干細(xì)胞，然而僅第三代間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)出來的神經(jīng)干細(xì)胞(圖7)密度最大，在以后傳代過程中的端粒酶表達(dá)也明顯高于其他幾代間充質(zhì)干細(xì)胞分化出來的神經(jīng)干細(xì)胞(圖8)，另外神經(jīng)干細(xì)胞在分化出來后，其端粒酶活性明顯低于間充質(zhì)干細(xì)胞，并在傳代過程中迅速衰退。

實施例3體外驗證實驗

為了評估本發(fā)明實施例1原位合成的dna銀納米簇探針，用于長期監(jiān)測干細(xì)胞增殖分化過程中的端粒酶活性變化的準(zhǔn)確性，分別取每代間充質(zhì)干細(xì)胞裂解并提取端粒酶使用elisa試劑盒檢測每代細(xì)胞的端粒酶活性。另取每代間充質(zhì)干細(xì)胞分化后的神經(jīng)干細(xì)胞裂解并提取端粒酶使用elisa試劑盒檢測每代細(xì)胞的端粒酶活性。

圖9a是實施例3驗證實驗所用到的一系列細(xì)胞。圖9b是每代間充質(zhì)干細(xì)胞裂解提取端粒酶，使用elisa試劑盒檢測的結(jié)果。從圖中可看到每代間充質(zhì)干細(xì)胞的端粒酶活性變化趨勢與實施例2使用dna銀納米簇探針監(jiān)測的結(jié)果大致吻合。圖9c是每代間充質(zhì)干細(xì)胞分化出來的神經(jīng)干細(xì)胞裂解所提取端粒酶，使用elisa試劑盒檢測的結(jié)果。從圖中可看到每代神經(jīng)干細(xì)胞的端粒酶活性變化趨勢與實施例2使用dna銀納米簇探針監(jiān)測的結(jié)果大致吻合。證明本發(fā)明中的原位合成的dna銀納米簇探針可用于長期監(jiān)測干細(xì)胞增殖分化過程中的端粒酶活性變化。

本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以上實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。

<110>華東師范大學(xué)

<120>一種dna銀納米簇及其細(xì)胞原位的合成方法和應(yīng)用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>9

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcccccccc