本發(fā)明涉及一種檢測方法，特別涉及一種檢測人體尿液中新蝶呤和生物蝶呤的方法。

背景技術：

新蝶呤和生物蝶呤是體內三磷酸鳥苷(gtp)的代謝產物，而三磷酸鳥苷(gtp)是輔酶四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，bh4)合成過程中的重要組成部分，兩種蝶呤主要通過尿液排泄，專業(yè)人員通過其含量及二者的比值可以有效區(qū)分高苯丙氨酸血癥的分型。因此，對hpa患兒進行早期bh4缺乏癥的鑒別診斷非常重要。非典型的高苯丙氨酸血癥與傳統(tǒng)高苯丙氨酸血癥有著不完全相同的治療方案，開發(fā)建立一種適合臨床醫(yī)學檢驗的前處理方法、準確，快速，高通量的色譜方法有利于快速大批量地獲得準確的數據，有助于專業(yè)人員進行相應的分析評價，具有重要意義。

尿液中含大量鹽等水溶性強極性雜質，新蝶呤和生物蝶呤又極易發(fā)生水解，保存穩(wěn)定性差，不適合在高有機相比例的hilic模式下進行大量樣本檢測，傳統(tǒng)方法多采用25cm的c18色譜柱增強保留和分離效果，分析時間較長，不符合臨床醫(yī)學檢驗快速、高通量的要求。同時，傳統(tǒng)的hilic模式，液質聯用等方法的檢測成本比較高，不利于推廣使用。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種準確、快速、高通量檢測人體尿液中新蝶呤和生物蝶呤的方法。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

一種檢測人體尿液中新蝶呤和生物蝶呤的方法，包括如下步驟：

1)前處理：對尿液進行液相檢測前處理；

2)液相洗脫：將前處理后的尿樣以液相色譜進行分析，所述分析條件為：

固定相：色譜柱為反向鍵合硅膠柱；

流動相：a相為甲醇；b相為15～25mmol/l的乙酸銨緩沖液，并以乙酸調ph5.5～7.0；梯度洗脫方式；

3)檢測：以熒光檢測器檢測。

作為上述方法的進一步改進，所述色譜柱為poroshell120ec-c18；

作為上述方法的進一步改進，梯度洗脫方式為：

色譜柱的柱溫為28～32℃；

流動相的流速為0.3～0.5ml/min。

作為上述方法的進一步改進，液相洗脫時的進樣量為0.5～2μl。

作為上述方法的進一步改進，檢測條件為：激發(fā)光波長為358～362nm，發(fā)射光波長為448～452nm。

作為上述方法的進一步改進，前處理步驟之前，還包括預處理步驟，所述預處理步驟為：尿液收集后立即加入5～7m的鹽酸，冷凍避光保存。

作為上述方法的進一步改進，前處理步驟包括如下步驟：

1)取樣：放置解凍至室溫，混勻，取樣品加入離心管；

2)氧化：加入碘/碘化鉀溶液，震蕩后置于離心機中避光反應；

3)中和：離心，依次抗壞血酸、氫氧化鈉，渦旋震蕩后離心；

4)過濾：取上清液過0.22μm水相濾膜進樣分析。

作為上述方法的進一步改進，碘/碘化鉀溶液的濃度為1～5wt％，加入量為5～15μl/100μl樣品。

作為上述方法的進一步改進，抗壞血酸的濃度為1～5mg/ml，加入量為1～5μl/100μl樣品；所述氫氧化鈉的濃度為5-10mol/l，加入量為1～5μl/100μl樣品。

作為上述方法的進一步改進，在進行液相洗脫時，間歇性對色譜柱進行沖柱。

作為上述方法的進一步改進，進樣盤的溫度為2～6℃。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明方法成本低，前處理簡單，可實現批量處理檢測，優(yōu)化色譜方法縮短了分析時間，大大提高樣本通量，特別適用于臨床和日常檢測對色譜方法的需求。

附圖說明

圖1是新蝶呤的線性回歸曲線；

圖2是生物蝶呤的線性回歸曲線。

具體實施方式

一種檢測人體尿液中新蝶呤和生物蝶呤的方法，包括如下步驟：

1)前處理：對尿液進行液相檢測前處理；

2)液相洗脫：將前處理后的尿樣以液相色譜進行分析，所述分析條件為：

固定相：色譜柱為反向鍵合硅膠柱；

流動相：a相為甲醇；b相為15～25mmol/l的乙酸銨緩沖液，并以乙酸調ph5.5～7.0；梯度洗脫方式；

3)檢測：以熒光檢測器檢測。

作為上述方法的進一步改進，所述色譜柱為poroshell120ec-c18；

作為上述方法的進一步改進，梯度洗脫方式為：

色譜柱的柱溫為28～32℃；

流動相的流速為0.3～0.5ml/min。

這種條件下可以快速、高能量地進行洗脫，提高洗脫效果。

作為上述方法的進一步改進，液相洗脫時的進樣量為0.5～2μl。

作為上述方法的進一步改進，檢測條件為：激發(fā)光波長為358～362nm，發(fā)射光波長為448～452nm。

作為上述方法的進一步改進，前處理步驟之前，還包括預處理步驟，所述預處理步驟為：尿液收集后立即加入5～7m的鹽酸，冷凍避光保存。

作為上述方法的進一步改進，前處理步驟包括如下步驟：

1)取樣：放置解凍至室溫，混勻，取樣品加入離心管；

2)氧化：加入碘/碘化鉀溶液，震蕩后置于離心機中避光反應；

3)中和：離心，依次抗壞血酸、氫氧化鈉，渦旋震蕩后離心；

4)過濾：取上清液過0.22μm水相濾膜進樣分析。

作為上述方法的進一步改進，碘/碘化鉀溶液的濃度為1～5wt％，加入量為5～15μl/100μl樣品。

作為上述方法的進一步改進，抗壞血酸的濃度為1～5mg/ml，加入量為1～5μl/100μl樣品；所述氫氧化鈉的濃度為5-10mol/l，加入量為1～5μl/100μl樣品。

作為上述方法的進一步改進，在進行液相洗脫時，間歇性對色譜柱進行沖柱。

作為上述方法的進一步改進，進樣盤的溫度為2～6℃。這種溫度下，更有利于保持樣品的穩(wěn)定性，同時對液相洗脫基本無不利影響。

下面結合具體實施方式，對本發(fā)明的技術方案進行進一步的說明。

實施例1

1、人源尿液的收集及樣品保存

采集新鮮尿液樣本三例，每例樣本分別加6mhcl調節(jié)ph至1左右后，避光分別置于-20℃和-70℃條件下存放，每隔0、1、2、5、8、15、22天各測定一次。

2、尿液樣品的前處理

1)取樣：放置解凍至室溫，混勻取已酸化樣品420μl至1.5ml離心管；

2)氧化：加入1％碘/碘化鉀溶液30μl，震蕩3min，置于4℃離心機中避光反應30min；

3)中和：短離心3秒，依次加入5μl2mg/ml抗壞血酸，15μl6m氫氧化鈉，渦旋震蕩3min，4℃，12000rpm離心5min；

4)過濾：采用2.0ml一次性注射器移取上清液過0.22μm水相濾膜進樣分析。

3、樣本檢測

液相條件

色譜柱：poroshell120ec-c18(2.1×100mm，2.7μm)

流動相a＝甲醇

流動相b＝20mmol/l乙酸銨緩沖液，乙酸調ph6.0

檢測波長：ex360nm，em450nm，峰寬74.07hz

柱溫：30℃

進樣量：1μl

進樣盤溫度：5℃

流速：0.4ml/min

保留時間：np1.2min，bp3.3min

保留時間窗：5％

寬度：0.1

閾值：50。

方法驗證

分析靈敏度與線性范圍結果

新蝶呤線性回歸曲線如圖1所示；

生物蝶呤線性回歸曲線如圖2所示。

方法準確度

新蝶呤的回收率在88.1％～114.5％之間，生物蝶呤的回收率在93.3％～107.8％，滿足85％-115％的要求。

精密度

批內精密度和批間精密度均小于20％，符合要求。

新蝶呤精密度實驗結果匯總

生物蝶呤精密度實驗結果匯總

樣本存放穩(wěn)定性

避光-20℃存放，新蝶呤穩(wěn)定性數據

避光-20℃存放，生物蝶呤穩(wěn)定性數據

避光-70℃存放，新蝶呤穩(wěn)定性數據

避光-70℃存放，生物蝶呤穩(wěn)定性數據

從表中的數據可知，尿液樣本可在避光-20℃條件下穩(wěn)定存放5天，避光-70℃條件下可穩(wěn)定存放15天。