本發(fā)明涉及一種植物品種鑒定方法，特別涉及一種快速準(zhǔn)確鑒定水稻生長(zhǎng)早期的香與非香植株的方法。

背景技術(shù)：

香稻，以其清香可口而深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)，市場(chǎng)上優(yōu)質(zhì)香米售價(jià)一般是普通稻米的2～3倍。香稻資源豐富、栽培歷史悠久，幾乎遍及世界各稻米生產(chǎn)國(guó)，印度、泰國(guó)、巴基斯坦、越南、日本和美國(guó)等都有自己的優(yōu)質(zhì)香稻品種；如印度的巴斯馬蒂香稻（basmati），泰國(guó)的khaodawkmail105，澳大利亞的goolarah,美國(guó)的della，伊朗sadri，日本的祝賀，中國(guó)的萬(wàn)年香米等均是著名的香稻品種類(lèi)?，F(xiàn)中國(guó)眾多的育種家都很重視對(duì)香稻品種的選育。大多數(shù)研究表明水稻的香味遺傳是受單隱性基因控制。在香稻常規(guī)育種工作中，最常用的方法有雜交育種，而此選育過(guò)程中對(duì)f2代及多代的香味植株的篩選非常重要?，F(xiàn)一般常規(guī)容易做的還是參照sood等1988年創(chuàng)立的氫氧化鉀溶液浸泡法進(jìn)行香味鑒定方法；即葉片剪碎，浸入1.7%濃度的氫氧化鉀后聞嗅而評(píng)判香味有否。此方法容易帶有個(gè)人感官經(jīng)驗(yàn)性而使評(píng)判有主觀性和不穩(wěn)定性，甚至?xí)姓`判。同理，咀嚼法、熱水法、顯色法等傳統(tǒng)感官鑒評(píng)均存在人員感官差異，結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性難以保證。儀器法具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能有效彌補(bǔ)上述方法的缺陷。儀器分析方法但目前應(yīng)用于稻米香氣收集的技術(shù)，如超臨界流體萃取、頂空氣體捕集、同時(shí)蒸餾萃取和柱吸附等技術(shù)，存在樣品及試劑消耗量大、操作步驟復(fù)雜和收集濃縮耗時(shí)等缺點(diǎn)，難以滿足育種工作中大批量試驗(yàn)材料的鑒定工作。目前對(duì)香稻研究已三十多年，迄今已報(bào)道的香稻中的香味揮發(fā)物有200余種，只確定少數(shù)幾種與米飯的香味或風(fēng)味有關(guān)（champage,2008;cho等2014）。美國(guó)威斯頓地區(qū)研究中心(wrrc)buttery等1982年首次分離和鑒定出水稻香味的主要成分：2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline，2-ap)，并提出此物質(zhì)是幾個(gè)亞洲水稻品種呈香味的主要緣由；同時(shí)我們實(shí)驗(yàn)室已得到數(shù)據(jù)結(jié)果是若是香稻，則整個(gè)生長(zhǎng)期的植株葉子均是香的；反之，則均沒(méi)有香味。正是基于此兩因素，我們提出早期鑒定植株葉片的2-ap而來(lái)評(píng)判是否是香稻。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速準(zhǔn)確鑒定水稻生長(zhǎng)早期的香與非香植株的方法，通過(guò)優(yōu)化自動(dòng)固相微萃取程序,快速鑒定香稻中香味主要特征香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

一種快速準(zhǔn)確鑒定水稻生長(zhǎng)早期的香與非香植株的方法，該方法包括如下步驟：

步驟1：樣品的制備水稻抽穗初期的葉片用液氮磨碎，稱樣量為20mg-50mg，入頂空樣品瓶備用；

步驟2：樣品進(jìn)行自動(dòng)固相微萃取階段，萃取分為三階段

1)第一階段：80℃保持預(yù)加熱2-5分鐘；

2)第二階段：采用萃取頭型號(hào)為fiber(聚二甲基硅烷/二乙烯苯/;65μm)或fiber(car/dvb/pdms;50/30μm,1cm長(zhǎng))以80℃,轉(zhuǎn)速250rpm/min,搖20s,停5s的間隔步驟，萃取頭插入進(jìn)樣瓶的深度為22毫米，此萃取階段持續(xù)10-15分鐘；

3）第三階段：萃取物直接入氣質(zhì)聯(lián)用儀的進(jìn)樣口,進(jìn)樣時(shí)間為1分鐘,進(jìn)樣溫度為260℃；

步驟3：樣品進(jìn)入氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析。

本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化自動(dòng)固相微萃取對(duì)香稻香味主要特征物2-乙酰-1-吡咯啉萃取前處理?xiàng)l件及氣相-質(zhì)譜儀器參數(shù)設(shè)置，使之可以快速準(zhǔn)確鑒定2-乙酰-1-吡咯啉，從而達(dá)到鑒別香與非香植株。

作為優(yōu)選，第三階段中，萃取頭入自動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣烘烤位置以高溫260℃凈化萃取頭5分鐘。

作為優(yōu)選，所述步驟3的具體參數(shù)是：

1）氣質(zhì)接口溫度為250℃,離子源溫度為200℃，分離柱子采用rxi-5sil毛細(xì)柱(30m×0.25mm×0.25μm)；

2）氣相程序升溫為50℃保持1分鐘,然后以5℃/min升至120℃,后以20℃/min升至260℃,保持5分鐘；

3）質(zhì)譜采用全掃描(scan)結(jié)合選擇離子監(jiān)測(cè)(sim,selectedionmonitoring)模式,掃描速度為10000,m/z范圍為40to450，間隔為0.05，離子檢測(cè)選擇檢測(cè)通道為m/z83，111，和68，間隔為0.3。

作為優(yōu)選，步驟3的3）中，載氣為純度為99.999%的氦,流速為36.3cm/sec，電子轟擊(ei)離子源,離子化能量為70ev。

本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化自動(dòng)固相微萃取程序,快速鑒定香稻中香味主要特征香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉,克服以往用超臨界流體萃取、頂空氣體捕集、同時(shí)蒸餾萃取和柱吸附或手工固相微萃取等技術(shù)的步驟繁瑣和易損失的問(wèn)題,本發(fā)明提供了葉片前處理，自動(dòng)固相微萃取的提取條件和氣質(zhì)聯(lián)用儀器參數(shù),可以對(duì)2--乙酰-1-吡咯啉進(jìn)行快速準(zhǔn)確分析,在香稻品質(zhì)選育和香味遺傳研究等均有很好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明方法包括采樣時(shí)期，采樣處理，自動(dòng)固相微萃取處理的優(yōu)化和氣質(zhì)聯(lián)用儀器測(cè)試方法參數(shù)的建立。本發(fā)明所提出的方法具有簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確和高效，在香稻育種早世代篩選和香味基因遺傳研究等均具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是香稻樣品的總離子流色譜圖；

圖2是2-ap的質(zhì)譜圖；

圖3是香稻樣品的總離子流色譜圖；

圖4是2-ap的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。

在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實(shí)施例1：

一種快速準(zhǔn)確鑒定水稻生長(zhǎng)早期的香與非香植株的方法，步驟如下：

步驟1：水稻樣品一：取抽穗初期采1-2片葉子，用液氮磨碎，稱樣量50mg,入20毫升螺紋口頂空樣品瓶，用含ptfe/藍(lán)色硅膠隔墊的磁性金屬蓋擰緊。

步驟2：進(jìn)行自動(dòng)固相微萃取階段，萃取分為三階段

第一階段：80℃保持預(yù)加熱5分鐘；

第二階段：采用萃取頭型號(hào)為fiber(carboxen/divinybenzene/polydimethylsiloxane,碳分子篩/二乙烯苯/聚二甲基硅烷;50/30μm,1cm長(zhǎng))以80℃,轉(zhuǎn)速250rpm/min,搖20s,停5s的間隔步驟。萃取頭入進(jìn)樣瓶的深度為離瓶口22毫米。此萃取階段持續(xù)10分鐘。

第三階段：萃取物直接入氣質(zhì)聯(lián)用儀的進(jìn)樣口,進(jìn)樣時(shí)間為1分鐘,進(jìn)樣溫度為260℃。萃取頭入自動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣烘烤位置以高溫260℃凈化萃取頭5分鐘。

步驟3:進(jìn)入氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析,儀器設(shè)置參數(shù)如下:

氣質(zhì)接口溫度為250℃,離子源溫度為200℃。分離柱子采用rxi-5sil毛細(xì)柱(30m×0.25mm×0.25μm)。氣相程序升溫為50℃保持1分鐘,然后以5℃/min升至120℃,后以20℃/min升至260℃,保持5分鐘。質(zhì)譜采用全掃描(scan)結(jié)合選擇離子監(jiān)測(cè)(sim,selectedionmonitoring)模式,掃描速度為10000,m/z范圍為40to450，間隔為0.05。離子檢測(cè)選擇檢測(cè)通道為m/z83，111，和68，間隔為0.3。氣為高氦(99.999%),流速為36.3cm/sec。電子轟擊(ei)離子源,離子化能量為70ev。2-乙酰-1-吡咯啉物質(zhì)的判定經(jīng)nist庫(kù)檢索，與2-ap標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖匹配。

圖1為香稻樣品的總離子流色譜圖,由圖可見(jiàn)2-ap出峰保留時(shí)間在6.12min（箭頭處）。圖2為2-ap的質(zhì)譜圖，分子離子峰為m/z111，特征離子碎片為m/z68和83

經(jīng)nist庫(kù)檢索，與2-ap標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖匹配。

實(shí)施例2：

一種快速準(zhǔn)確鑒定水稻生長(zhǎng)早期的香與非香植株的方法，步驟如下：

步驟1：水稻樣品二：取水稻抽穗初期采1-2片葉子，用液氮磨碎，稱樣量20mg-50mg,入20毫升螺紋口頂空樣品瓶，用含ptfe/藍(lán)色硅膠隔墊的磁性金屬蓋擰緊。

步驟2：進(jìn)行自動(dòng)固相微萃取階段，萃取分為三階段

第一階段：85℃保持預(yù)加熱2分鐘；

第二階段：采用萃取頭型號(hào)為fiber(polydimethylsiloxane/divinybenzene/,聚二甲基硅烷/二乙烯苯/;65μm)以80℃,轉(zhuǎn)速250rpm/min,搖20s,停5的間隔步驟。萃取頭入進(jìn)樣瓶口深度的距離為22毫米。此萃取階段持續(xù)15分鐘。

第三階段：萃取物直接入氣質(zhì)聯(lián)用儀的進(jìn)樣口,進(jìn)樣時(shí)間為1分鐘,進(jìn)樣溫度為260℃。萃取頭入自動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣烘烤位置以高溫260℃凈化萃取頭5分鐘。

步驟3:進(jìn)入氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析,儀器設(shè)置參數(shù)如下:

氣質(zhì)接口溫度為250℃,離子源溫度為200℃。分離柱子采用rxi-5sil毛細(xì)柱(30m×0.25mm×0.25μm)。氣相程序升溫為50℃保持1分鐘,然后以5℃/min升至120℃,后以20℃/min升至260℃,保持5分鐘。質(zhì)譜采用全掃描(scan)結(jié)合選擇離子監(jiān)測(cè)(sim,selectedionmonitoring)模式,全掃描速度為10000,m/z范圍為40to450，間隔為0.05。離子檢測(cè)選擇檢測(cè)通道為m/z83，111，和68，間隔為0.3。載氣為高氦(99.999%),流速為36.3cm/sec。電子轟擊(ei)離子源,離子化能量為70ev。2-乙酰-1-吡咯啉物質(zhì)的判定經(jīng)nist庫(kù)檢索，要與2-ap標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖匹配。

圖3為香稻樣品的總離子流色譜圖,由圖可見(jiàn)2-ap出峰保留時(shí)間在6.32min（箭頭處），圖4是2-ap的質(zhì)譜圖，分子離子峰為m/z111，特征離子碎片為m/z68和83,經(jīng)nist庫(kù)檢索，與2-ap標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖匹配。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。