本發(fā)明涉及一種檢測沙門氏菌的方法，屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，是革蘭氏陰性、細(xì)胞內(nèi)寄生的一種腸道菌。該菌廣泛存在于自然界中，不但能引起家畜家禽及其他動物發(fā)生急性、慢性或隱性感染，而且還能通過污染食物導(dǎo)致人的食物中毒，對人類造成很大威脅。據(jù)統(tǒng)計在世界各國的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙門氏菌每年會導(dǎo)致約四萬美國人病倒，約600人死亡。在我國沙門氏菌是食物中毒中最常見的致病菌，占食物中毒的第一位。沙門氏菌病的臨床癥狀主要包括頭痛、腹痛、發(fā)熱等，死亡率在1%，對人危害很大。

目前報道的檢測沙門氏菌的方法包括傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法、酶聯(lián)免疫法、pcr技術(shù)等。傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法檢測周期長達(dá)一周，工序繁瑣，設(shè)備昂貴，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足要求。因此，食品工業(yè)急需一種快速、準(zhǔn)確、簡便、微量的分析方法，以對食品中的沙門氏菌進(jìn)行檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中檢測沙門氏菌的方法特異性和靈敏度都比較低、成本高、檢測周期長的問題，本發(fā)明提供了一種特異性和靈敏度高、檢測速度快、成本低的基于血紅素/g-四聯(lián)體誘導(dǎo)dna銀納米簇光致電子轉(zhuǎn)移檢測沙門氏菌的方法。

本發(fā)明中一共用到了4條dna鏈，其序列分別是：

h1：5’-agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaagatccccgcattact-3’（seqidno.1）；

primer：5’-agtaatgcgg-3’(seqidno.2)；

h2：5’-ggtagttattcaaagatgagtaggttttggttgagtactttgaataactaccttgggtagggcgggttggg-3’(seqidno.3)；

h3：5’-cctccttcctcccggtagttattcaaagtacacaagcaaaacctactcatctttgaataactaccgcc-3’(seqidno.4)；

其中h1下劃線標(biāo)記部分是沙門氏菌的aptamer，黑色字體是nt.alwi的識別位點，黑色斜體部分是primer的互補序列，當(dāng)目標(biāo)物與aptamer結(jié)合打開發(fā)夾h1后，引物primer與發(fā)夾的黑色斜體部分結(jié)合，在phi29聚合酶的作用下進(jìn)行dna的復(fù)制同時實現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)，形成的雙鏈dna在nt.alwi內(nèi)切酶的作用下產(chǎn)生引發(fā)鏈置換的trigger序列。此外，將aptamer設(shè)計到發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，增強了傳感器的特異性。h2下劃線標(biāo)記的是形成g-四聯(lián)體的序列，它可以與血紅素形成血紅素/g-四聯(lián)體復(fù)合物，黑色斜體字體是與產(chǎn)生的trigger堿基互補的序列，h3下劃線標(biāo)記的是形成銀納米簇的序列。trigger將h2打開后，h2暴露的部分又能將h3打開，通過鏈置換的方式h3與h2形成完全互補的雙鏈結(jié)構(gòu)，同時將trigger置換下來用于下一次的循環(huán)，進(jìn)一步實現(xiàn)信號放大，而形成的h2-h3雙鏈結(jié)構(gòu)將血紅素/g-四聯(lián)體復(fù)合物與dna銀納米簇的距離拉近，血紅素/g-四聯(lián)體的復(fù)合結(jié)構(gòu)能夠誘導(dǎo)dna銀納米簇進(jìn)行光致電子轉(zhuǎn)移，因此dna銀納米簇的熒光被猝滅。通過測量熒光強度來定量檢測沙門氏菌。

本發(fā)明中沙門氏菌的檢測是在均相溶液中實現(xiàn)的，通過鏈置換的方式來實現(xiàn)信號的放大，從而實現(xiàn)沙門氏菌的高靈敏檢測，并獲得較低的檢測下限。

均相中發(fā)生的反應(yīng)主要有：當(dāng)有沙門氏菌存在時，沙門氏菌通過與其aptamer的特異性結(jié)合將h1打開，使得primer與h1斜體下劃線字體部分堿基互補配對，并且primer作為引物在phi29聚合酶的作用下進(jìn)行h1的復(fù)制，同時實現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)（循環(huán)i）。形成的雙鏈結(jié)構(gòu)中含有nt.alwi內(nèi)切酶的識別序列(h1黑色字體)和剪切序列(h1黑色字體的互補序列)，因此在nt.alwi內(nèi)切酶的作用下，產(chǎn)生大量的trigger用于引發(fā)鏈置換，而剩余的部分在phi29的作用下重復(fù)上述過程，繼續(xù)對h1進(jìn)行循環(huán)復(fù)制(循環(huán)ii)，產(chǎn)生更多的trigger。此外，trigger能夠打開h1，這使得更多的primer與h1結(jié)合，在phi29的作用下進(jìn)行dna復(fù)制，將trigger置換下來用于下一次循環(huán)，同時又產(chǎn)生新的trigger(循環(huán)iii)。通過上述無限次循環(huán)實現(xiàn)指數(shù)放大，產(chǎn)生大量的trigger。產(chǎn)生的trigger能夠與h2的紫色部分結(jié)合打開發(fā)夾，h2的黑色部分又可以將h3打開，h3通過鏈置換與h2完全結(jié)合將trigger置換下來，置換出的trigger將繼續(xù)打開別的h2，然后重復(fù)上述過程，這樣trigger可以進(jìn)行無限次的循環(huán)，從而實現(xiàn)信號放大。此外，由于h2-h3形成的雙鏈結(jié)構(gòu)拉近了血紅素/g-四聯(lián)體復(fù)合物與dna銀納米簇的距離，使得dna銀納米簇發(fā)生光致電子轉(zhuǎn)移，熒光猝滅，產(chǎn)生信號。

在均相反應(yīng)中，反應(yīng)條件為37℃，反應(yīng)時間是90min。

所述的檢測沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

（1）進(jìn)行dna銀納米簇的合成；

（2）將目標(biāo)菌加入到均相反應(yīng)溶液中，均相反應(yīng)溶液包含h1、primer、phi29聚合酶、dntps、nt.alwi內(nèi)切酶、h2和h3；

（3）熒光儀檢測熒光強度。

所述的制備方法，優(yōu)選dna銀納米簇的合成操作步驟如下：

將15μl的100μmh3和73μl的20mmpb緩沖液（ph7.0）加入到用錫箔紙包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（確保ag⁺與h3的比例為6:1），震蕩1min，于4℃下放置30min；

30min后，繼續(xù)向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震蕩1min，于4℃下黑暗放置6h以上備用。

所述的制備方法，優(yōu)選均相反應(yīng)操作步驟如下：

將h1、primer、phi29聚合酶、dntps、nt.alwi內(nèi)切酶、h2和h3、血紅素加入到錫箔紙包裹的ep管中，再加入目標(biāo)菌，混合均勻后，于37℃下水浴90min

該發(fā)明的檢測方式是熒光法檢測，利用dna鏈的堿基互補配對將血紅素/g-四聯(lián)體的復(fù)合結(jié)構(gòu)與dna銀納米粒子間的距離拉近，血紅素/g-四聯(lián)體誘導(dǎo)dna銀納米粒子發(fā)生光致電子轉(zhuǎn)移，使得dna銀納米粒子的熒光猝滅，產(chǎn)生熒光強度的顯著下降。在檢測之前，先合成dna銀納米粒子作為信號探針。然后在37℃孵育90min下完成酶輔助的指數(shù)放大和鏈置換的循環(huán)放大過程。最后，通過檢測溶液的熒光強度進(jìn)行目標(biāo)物的檢測。其中，熒光儀設(shè)置激發(fā)波長為565nm，出峰位置在650nm左右。

本發(fā)明基于核酸適配體與目標(biāo)物的特異性識別，將aptamer設(shè)計到發(fā)夾結(jié)構(gòu)的h1中，能夠有效的增強傳感器的特異性；具有鏈延伸功能的phi29聚合酶實現(xiàn)鏈的延伸，實現(xiàn)目標(biāo)物的循環(huán)放大，在nt.alwi內(nèi)切酶的協(xié)助下，同時產(chǎn)生大量既能打開h1又能打開h2的trigger，phi29聚合酶和nt.alwi內(nèi)切酶的共同作用實現(xiàn)trigger指數(shù)放大，而trigger又引發(fā)了h2和h3的鏈置換等溫放大以及血紅素/g-四聯(lián)體復(fù)合物誘導(dǎo)dna銀納米粒子發(fā)生光致電子轉(zhuǎn)移構(gòu)建了適體生物傳感器。該傳感器反應(yīng)只需要一步，因此具有檢測速度快，操作簡便，價格低廉，檢測限低，特異性高等優(yōu)點，可以彌補沙門氏菌現(xiàn)有檢測方法的缺陷與不足，實現(xiàn)對其快速，準(zhǔn)確的定量檢測。

本發(fā)明的有益效果：

1、利用了核酸適配體的特異型識別，將aptamer設(shè)計到h1中，提高了傳感器對沙門氏菌的特異性識別，實現(xiàn)了對目標(biāo)物的高特異性檢測；

2、利用phi29聚合酶與nt.alwi內(nèi)切酶的共同作用，實現(xiàn)了指數(shù)放大，產(chǎn)生大量的trigger，有效地提高了傳感器的靈敏度。

3、利用鏈置換循環(huán)放大功能，實現(xiàn)了trigger的循環(huán)利用，進(jìn)一步放大了檢測信號，提高了檢測的靈敏度，實現(xiàn)對目標(biāo)物沙門氏菌的超靈敏性檢測；

4、該傳感器的構(gòu)建僅需一步，有效地避免了多步加入樣品可能帶來的污染，同時具有操作簡便、反應(yīng)速度快等優(yōu)勢；

5、由于使用合成的dna銀納米簇作為信號探針，減少了熒光基團的標(biāo)記，使得大大地降低了成本；

6、檢測原理的過程均是在均相中實現(xiàn)的，提高了反應(yīng)速度，降低了操作的復(fù)雜程度，實現(xiàn)了目標(biāo)物的快速，簡單，靈敏的檢測；

7、制備方法簡單，性能穩(wěn)定，dna銀納米簇的熒光穩(wěn)定，因此傳感器的重復(fù)性好，適用于食品安全及水體中沙門氏菌的檢測和生物傳感器產(chǎn)業(yè)化的實際應(yīng)用；

8、制作該生物傳感器的工藝成本低，適用于產(chǎn)業(yè)化中價廉的要求。

附圖說明

圖1為該實驗的原理圖；

圖2為實施例1h1濃度優(yōu)化檢測結(jié)果圖；

圖3為實施例2phi29聚合酶濃度優(yōu)化檢測結(jié)果圖；

圖4為實施例3反應(yīng)時間優(yōu)化檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。

所述檢測方法，包括以下步驟：

（1）進(jìn)行dna銀納米簇的合成；

（2）將目標(biāo)菌加入到均相反應(yīng)溶液中，均相反應(yīng)溶液包含h1、primer、phi29聚合酶、dntps、nt.alwi內(nèi)切酶、h2和h3；

所述的制備方法，優(yōu)選dna銀納米簇的合成操作步驟如下：

①將15μl的100μmh3和73μl的20mmpb緩沖液（ph7.0）加入到用錫箔紙包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（確保ag⁺與h3的比例為6:1），震蕩1min，于4℃下放置30min。

②30min后，繼續(xù)向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震蕩1min，于4℃下黑暗放置6h以上備用。

所述的制備方法，優(yōu)選均相反應(yīng)操作步驟如下：

將h1（3μl，20μm）、primer（3μl，5μm）、phi29聚合酶（0.5u）、dntps（5μl）、nt.alwi內(nèi)切酶（0.5u）、h2（9μl，50μm）、血紅素(5μl)和h3（9μl，50μm）、10×的緩沖液（buffer10μl）和5μl滅菌水加入到錫箔紙包裹的ep管中，再加入5μl目標(biāo)菌，混合均勻后，于37℃下水浴90min。

該發(fā)明的檢測方式是熒光法檢測，利用dna鏈的堿基互補配對將血紅素/g-四聯(lián)體的復(fù)合結(jié)構(gòu)與dna銀納米粒子間的距離拉近，血紅素/g-四聯(lián)體誘導(dǎo)dna銀納米粒子發(fā)生光致電子轉(zhuǎn)移，使得dna銀納米粒子的熒光猝滅，產(chǎn)生熒光強度的顯著下降。在檢測之前，先合成dna銀納米粒子作為分子信標(biāo)。然后在37℃孵育90min下完成酶輔助的指數(shù)放大和鏈置換的循環(huán)放大過程。最后，通過檢測溶液的熒光強度進(jìn)行目標(biāo)物的檢測。其中，熒光儀設(shè)置激發(fā)波長為565nm，出峰位置在650nm左右。具體反應(yīng)原理圖如圖1所示。

本發(fā)明基于核酸適配體與目標(biāo)物的特異性識別，將aptamer設(shè)計到發(fā)夾結(jié)構(gòu)的h1中，能夠有效的增強傳感器的特異性；具有鏈延伸功能的phi29聚合酶實現(xiàn)鏈的延伸，實現(xiàn)目標(biāo)物的循環(huán)放大，在nt.alwi內(nèi)切酶的協(xié)助下，同時產(chǎn)生大量既能打開h1又能打開h2的trigger，phi29聚合酶和nt.alwi內(nèi)切酶的共同作用實現(xiàn)trigger指數(shù)放大，而trigger又引發(fā)了h2和h3的鏈置換等溫放大以及血紅素/g-四聯(lián)體復(fù)合物誘導(dǎo)dna銀納米粒子發(fā)生光致電子轉(zhuǎn)移構(gòu)建了適體生物傳感器。該傳感器反應(yīng)只需要一步，因此具有檢測速度快，操作簡便，價格低廉，檢測限低，特異性高等優(yōu)點，可以彌補沙門氏菌現(xiàn)有檢測方法的缺陷與不足，實現(xiàn)對其快速，準(zhǔn)確的定量檢測。

實施例1

所述的熒光生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

dna銀納米簇的合成操作步驟如下：

①將15μl的100μmh3和73μl的20mmpb緩沖液（ph7.0）加入到用錫箔紙包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（確保ag⁺與h3的比例為6:1），震蕩1min，于4℃下放置30min。

②30min后，繼續(xù)向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震蕩1min，于4℃下黑暗放置6h以上備用。

均相溶液中反應(yīng)過程的主要步驟如下：

a、將h1（終濃度分別為0.4μm，0.6μm，0.8μm，1.0μm，1.2μm，1.4μm）、primer（3μl，5μm）、phi29聚合酶（0.5u）、dntps（5μl）、nt.alwi內(nèi)切酶（0.5u）、h2（9μl，50μm）、血紅素(5μl)和h3（9μl，50μm）、10×的緩沖液（buffer10μl）和5μl滅菌水加入到錫箔紙包裹的ep管中，再加入目標(biāo)菌（5μl，10⁵cfu/ml），混合均勻后，于37℃下水浴90min。

b、將a步反應(yīng)后的溶液（60μl）稀釋至100μl，用熒光儀在650nm處檢測熒光峰值強度。

熒光儀激發(fā)波長設(shè)置為565nm，發(fā)射波長為650nm，檢測范圍600nm-800nm，讀取熒光信號變化，檢測目標(biāo)物。

上述過程中用到的溶液的制備方法：

1、超純水均需進(jìn)行高溫滅菌處理。具體方法是，將超純水分別放置在錐形瓶中，然后用錫箔紙和報紙進(jìn)行封口。在高壓滅菌鍋中在120℃的溫度下滅菌20min。

2、10×的緩沖液（buffer）是隨聚合酶一起買來的，可直接使用。

結(jié)果見圖2，從圖中可以看出，檢測到的熒光強度峰值隨著h1的濃度增大而減小，當(dāng)濃度超過1.0μm后，熒光強度趨于穩(wěn)定。所以h1的最佳終濃度為1.0μm。

實施例2

所述的熒光生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

dna銀納米簇的合成操作步驟如下：

①將15μl的100μmh3和73μl的20mmpb緩沖液（ph7.0）加入到用錫箔紙包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（確保ag⁺與h3的比例為6:1），震蕩1min，于4℃下放置30min。

②30min后，繼續(xù)向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震蕩1min，于4℃下黑暗放置6h以上備用。

均相溶液中反應(yīng)過程的主要步驟如下：

a、將h1（3μl，20μm）、primer（3μl，5μm）、phi29聚合酶（0.1u，0.2u，0.3u，0.4u，0.5u，0.6u，0.7u）、dntps（5μl）、nt.alwi內(nèi)切酶（0.5u）、h2（9μl，50μm）、血紅素(5μl)和h3（9μl，50μm）、10×的緩沖液（buffer10μl）和5μl滅菌水加入到錫箔紙包裹的ep管中，再加入目標(biāo)菌（5μl，10⁵cfu/ml），混合均勻后，于37℃下水浴90min。

b、將a步反應(yīng)后的溶液（60μl）稀釋至100μl，用熒光儀在650nm處檢測熒光峰值強度。

熒光儀激發(fā)波長設(shè)置為565nm，發(fā)射波長為650nm，檢測范圍600nm-800nm，讀取熒光信號變化，檢測目標(biāo)物。

上述過程中用到的溶液的制備方法：

1、超純水均需進(jìn)行高溫滅菌處理。具體方法是，將超純水分別放置在錐形瓶中，然后用錫箔紙和報紙進(jìn)行封口。在高壓滅菌鍋中在120℃的溫度下滅菌20min。

2、10×的緩沖液（buffer）是隨聚合酶一起買來的，可直接使用。

結(jié)果見圖3，從圖中可以看出，檢測到的熒光強度峰值隨著phi29聚合酶的濃度增大而減小，當(dāng)濃度超過0.5u后，熒光強度趨于穩(wěn)定。所以phi29聚合酶的最佳終濃度為0.5u。

實施例3

所述的熒光生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

dna銀納米簇的合成操作步驟如下：

①將15μl的100μmh3和73μl的20mmpb緩沖液（ph7.0）加入到用錫箔紙包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（確保ag⁺與h3的比例為6:1），震蕩1min，于4℃下放置30min。

②30min后，繼續(xù)向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震蕩1min，于4℃下黑暗放置6h以上備用。

均相溶液中反應(yīng)過程的主要步驟如下：

a、將h1（3μl，20μm）、primer（3μl，5μm）、phi29聚合酶（0.5u）、dntps（5μl）、nt.alwi內(nèi)切酶（0.5u）、h2（9μl，50μm）、血紅素(5μl)和h3（9μl，50μm）、10×的緩沖液（buffer10μl）和5μl滅菌水加入到錫箔紙包裹的ep管中，再加入目標(biāo)菌（5μl，10⁵cfu/ml），混合均勻后，于37℃下水浴30min，45min，60min，75min，90min，105min，120min。

b、將a步反應(yīng)后的溶液（60μl）稀釋至100μl，用熒光儀在650nm處檢測熒光峰值強度。

熒光儀激發(fā)波長設(shè)置為565nm，發(fā)射波長為650nm，檢測范圍600nm-800nm，讀取熒光信號變化，檢測目標(biāo)物。

上述過程中用到的溶液的制備方法：

1、超純水均需進(jìn)行高溫滅菌處理。具體方法是，將超純水分別放置在錐形瓶中，然后用錫箔紙和報紙進(jìn)行封口。在高壓滅菌鍋中在120℃的溫度下滅菌20min。

2、10×的緩沖液（buffer）是隨聚合酶一起買來的，可直接使用。

結(jié)果見圖4，從圖中可以看出，檢測到的熒光強度峰值隨著反應(yīng)時間的延長而降低，當(dāng)反應(yīng)時間超過90min后，熒光強度趨于穩(wěn)定。所以最佳的均相反應(yīng)時間為90min。

實施例4

所述的熒光生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

dna銀納米簇的合成操作步驟如下：

①將15μl的100μmh3和73μl的20mmpb緩沖液（ph7.0）加入到用錫箔紙包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（確保ag⁺與h3的比例為6:1），震蕩1min，于4℃下放置30min。

②30min后，繼續(xù)向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震蕩1min，于4℃下黑暗放置6h以上備用。

均相溶液中反應(yīng)過程的主要步驟如下：

a、將h1（3μl，20μm）、primer（3μl，5μm）、phi29聚合酶（0.5u）、dntps（5μl）、nt.alwi內(nèi)切酶（0.5u）、h2（9μl，50μm）、血紅素(5μl)和h3（9μl，50μm）、10×的緩沖液（buffer10μl）和5μl滅菌水加入到錫箔紙包裹的ep管中，再加入目標(biāo)菌（終濃度分別為10⁶cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml），混合均勻后，于37℃下水浴90min。

b、將a步反應(yīng)后的溶液（60μl）稀釋至100μl，用熒光儀在650nm處檢測熒光峰值強度。

熒光儀激發(fā)波長設(shè)置為565nm，發(fā)射波長為650nm，檢測范圍600nm-800nm，讀取熒光信號變化，檢測目標(biāo)物。

上述過程中用到的溶液的制備方法：

1、超純水均需進(jìn)行高溫滅菌處理。具體方法是，將超純水分別放置在錐形瓶中，然后用錫箔紙和報紙進(jìn)行封口。在高壓滅菌鍋中在120℃的溫度下滅菌20min。

2、10×的緩沖液（buffer）是隨聚合酶一起買來的，可直接使用。

檢測結(jié)果如下表所示：

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

<110>濟南大學(xué)

<120>一種檢測沙門氏菌的方法

<160>2

<210>1

<211>53

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(53)

<223>引物

<400>1

agtaatgcccggtagttattcaaagatgag30

taggaaaagatccccgcattact53

<210>2

<211>10

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(10)

<223>引物

<400>2

agtaatgcgg10

<210>3

<211>71

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(71)

<223>引物

<400>3

ggtagttattcaaagatgagtaggttttgg30

ttgagtactttgaataactaccttgggtag60

ggcgggttggg71

<210>4

<211>68

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(68)

<223>引物

<400>4

cctccttcctcccggtagttattcaaagta30

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ctaccgcc68