本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的適配體分子對(duì)、試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

黃曲霉毒素是具有強(qiáng)毒性的真菌毒素，可污染玉米、花生等糧食、谷物和食品，動(dòng)物和人食用被黃曲霉毒素污染的食品后，黃曲霉毒素會(huì)造成肝臟損傷、導(dǎo)致癌癥、對(duì)動(dòng)物和人的健康造成重大危害，其中黃曲霉毒素b1(afb1)污染廣泛，毒性最強(qiáng)。檢測(cè)黃曲霉毒素b1對(duì)于食品安全、食品質(zhì)量控制和人類健康等具有重要意義。常用的一些檢測(cè)方法主要包括薄層色譜分析、酶聯(lián)免疫分析、液相色譜分析等方法。這些方法往往需要昂貴的儀器和復(fù)雜的操作步驟。采用免疫抗體的分析方法需要采用免疫抗體作為識(shí)別試劑，往往還需要采用黃曲霉素和蛋白偶聯(lián)的抗原，免疫抗體的制備成本高，制備批間重現(xiàn)性差，抗體穩(wěn)定性對(duì)溫度比較敏感，抗體試劑的保存和運(yùn)輸?shù)臈l件要求高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的適配體分子對(duì)、試劑盒及其檢測(cè)方法，以期解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的至少部分技術(shù)問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的適配體分子對(duì)，其是如下的分子對(duì)：

(1)序列如seqidno.1所示核酸分子的5’端經(jīng)fam(fluorescein，熒光素)標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.4所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1(blackholequencher-1)標(biāo)記得到的分子組成的分子對(duì)；或

(2)序列如seqidno.1所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.5所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對(duì)；或

(3)序列如seqidno.2所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.6所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對(duì)；或

(4)序列如seqidno.2所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.7所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對(duì)；或

(5)序列如seqidno.3所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.8所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對(duì)。

上述技術(shù)方案換一種表述方式如下：一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的適配體分子對(duì)，其是如下的分子對(duì)：

由seqidno.1所示分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記與seqidno.4或seqidno.5所示分子的3’端經(jīng)bhq-1標(biāo)記所得分子組成的分子對(duì)，或者是由seqidno.2所示分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記與seqidno.6或seqidno.7所示分子的3’端經(jīng)bhq-1標(biāo)記所得分子組成的分子對(duì)，或者是由seqidno.3所示分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記與seqidno.8所示分子的3’端經(jīng)bhq-1標(biāo)記所得分子組成的分子對(duì)。

本發(fā)明還提供一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的試劑盒，其包括上述的適配體分子對(duì)。

本發(fā)明還提供一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的方法，其是將上述適配體分子對(duì)與待測(cè)樣本混合后溫育，測(cè)定熒光強(qiáng)度值。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：

本發(fā)明采用核酸適配體作為特異性識(shí)別黃曲霉毒素b1的親和配體，不同于以往利用免疫抗體檢測(cè)黃曲霉毒素的分析方法。核酸適配體具有易制備、穩(wěn)定性高、易引入熒光標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。熒光檢測(cè)技術(shù)具有靈敏、簡(jiǎn)單、快速、無(wú)需分離等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的產(chǎn)品和方法在應(yīng)用時(shí)，采用熒光染料標(biāo)記的核酸適配體和猝滅劑修飾的短鏈核酸所構(gòu)成的熒光開關(guān)方法，具有熒光背景低，熒光變化顯著，熒光增強(qiáng)倍數(shù)高、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的檢測(cè)限可達(dá)到0.2nm。

附圖說(shuō)明

圖1顯示實(shí)施例1中采用熒光素標(biāo)記的核酸適配體af31-5f和bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸分子af31-c13b或af31-c14b檢測(cè)不同濃度的黃曲霉毒素b1的結(jié)果。

圖2顯示實(shí)施例2中采用熒光素標(biāo)記的核酸適配體af29-5f和bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸分子af29-c14b或af29-c13b檢測(cè)不同濃度的黃曲霉毒素b1的結(jié)果。

圖3顯示實(shí)施例3中采用熒光素標(biāo)記的核酸適配體af27-5f和bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸分子af27-c14b檢測(cè)不同濃度的黃曲霉毒素b1的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

核酸適配體是從寡聚核苷酸文庫(kù)中篩選得到的可高親和力高選擇性識(shí)別目標(biāo)分子的單鏈核酸分子。核酸適配體的出現(xiàn)為檢測(cè)黃曲霉毒素提供了新的研究手段。作為核酸類的親和配體，核酸適配體在分析檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用具有很多優(yōu)點(diǎn)，如合成制備方便，熱穩(wěn)定性高，易于引入功能團(tuán)如熒光染料標(biāo)記等。核酸適配體在親和力和選擇性方面都可以和免疫抗體相媲美，核酸適配體的分析方法可以克服免疫分析中免疫抗體的在穩(wěn)定性和制備等方面的一些局限，顯示出潛力，核酸適配體的應(yīng)用也受到廣泛的關(guān)注，在分析傳感領(lǐng)域顯示出很大的潛力和應(yīng)用前景。

本申請(qǐng)的發(fā)明人基于本領(lǐng)域的現(xiàn)狀，經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)探究和反復(fù)的實(shí)踐驗(yàn)證，終于發(fā)現(xiàn)能夠檢測(cè)黃曲霉毒素b1的dna核酸適配體及與其配對(duì)使用的互補(bǔ)短鏈核酸分子，并將其開發(fā)制備成試劑盒應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中，從而得到了本發(fā)明。本發(fā)明的dna核酸適配體可以與黃曲霉毒素b1選擇性作用，具有很強(qiáng)的親和力，利用核酸適配體可以發(fā)展檢測(cè)黃曲霉毒素b1的檢測(cè)方法。

本發(fā)明的原理是：熒光素(fluorescein，簡(jiǎn)稱fam)標(biāo)記的核酸適配體與猝滅劑bhq-1(blackholequencher-1)標(biāo)記的互補(bǔ)短鏈核酸雜交，由于熒光素和猝滅劑靠近，熒光素的熒光被猝滅。當(dāng)黃曲霉毒素b1存在時(shí)，fam標(biāo)記的核酸適配體與黃曲霉毒素b1結(jié)合，bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸不與fam標(biāo)記的核酸適配體雜交，bhq-1遠(yuǎn)離fam，fam的熒光恢復(fù)。隨著黃曲霉毒素b1的加入，fam標(biāo)記的核酸適配體熒光強(qiáng)度逐漸增加，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)黃曲霉毒素b1的檢測(cè)。

本發(fā)明提供的檢測(cè)黃曲霉毒素b1的適配體分子對(duì)，其是如下的分子對(duì)：

(1)序列如seqidno.1所示核酸分子的5’端經(jīng)fam(fluorescein，熒光素)標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.4所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1(blackholequencher-1)標(biāo)記得到的分子組成的分子對(duì)；或

(2)序列如seqidno.1所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.5所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對(duì)；或

(3)序列如seqidno.2所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.6所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對(duì)；或

(4)序列如seqidno.2所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.7所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對(duì)；或

(5)序列如seqidno.3所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.8所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對(duì)。

本發(fā)明提供的檢測(cè)黃曲霉毒素b1的試劑盒，其包括上述的適配體分子對(duì)。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照黃曲霉毒素b1。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括ph為6～10的結(jié)合緩沖液，更優(yōu)選地，所述結(jié)合緩沖液的ph為7.5，包括10mmtris-hcl、50mmmgcl2、50mmnacl和0.1％tween20。

本發(fā)明提供的黃曲霉毒素b1的檢測(cè)方法，其是將上述適配體分子對(duì)與待測(cè)樣本混合后溫育，測(cè)定熒光強(qiáng)度值。

其中，優(yōu)選地，所述適配體分子對(duì)的使用濃度為50～100nm，更優(yōu)選地，其中，5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子的使用濃度為50nm，3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子的使用濃度為100nm。

優(yōu)選地，所述待測(cè)樣本進(jìn)行預(yù)處理，即將待測(cè)的樣本采用結(jié)合緩沖溶液稀釋。

優(yōu)選地，所述溫育的溫度為2～8℃，更優(yōu)選地，所述溫育的溫度為4℃。

優(yōu)選地，所述溫育是在ph為6～10的結(jié)合緩沖液中進(jìn)行，更優(yōu)選地，所述結(jié)合緩沖液的ph為7.5，包括10mmtris-hcl、50mmmgcl2、50mmnacl和0.1％tween20。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

下面列舉一些具體實(shí)施例，以對(duì)本發(fā)明的實(shí)施和技術(shù)效果作更進(jìn)一步的說(shuō)明。

下述具體實(shí)施例中，檢測(cè)所用的激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為528nm，狹峰寬度均為5nm。適配體分子對(duì)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成純化。

實(shí)施例1：采用熒光素(fam)標(biāo)記的核酸適配體af31-5f和bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸分子af31-c13b或af31-c14b檢測(cè)黃曲霉毒素b1

fam標(biāo)記的核酸適配體af31-5f的序列為seqidno.1(5’-tggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcc-3’)，5’端標(biāo)記fam。bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸af31-c14b的序列為seqidno.4(5'-gacaacacgtgcca-3')，3’端標(biāo)記bhq-1。bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸af31-c13b序列為seqidno.5(5'-acaacacgtgcca-3')，3’端標(biāo)記bhq-1。在結(jié)合緩沖溶液(10mmtris-hcl(ph7.5)、50mmmgcl2、50mmnacl、0.1％tween20)中，af31-5f(50nm)與af31-c14b(100nm)或af31-c13b(100nm)以及黃曲霉毒素b1溫育，然后測(cè)fam的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為528nm)。隨著黃曲霉毒素b1的加入，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。黃曲霉毒素b1的檢測(cè)限為0.2nm，結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例2：采用熒光素(fam)標(biāo)記的核酸適配體af29-5f和bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸分子a29-c14b或a29-c13b檢測(cè)黃曲霉毒素b1

fam標(biāo)記的核酸適配體af29-5f序列為seqidno.2(5'-tgcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcc-3')，fam標(biāo)記在序列的5’端。bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸af29-c14b序列為seqidno.6(5'-agacaacacgtgca-3')，猝滅劑bhq-1標(biāo)記在序列的3’端。bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸af29-c13b序列為seqidno.7(5'-gacaacacgtgca-3')，bhq-1標(biāo)記在序列的3’端。在結(jié)合緩沖溶液(10mmtris-hcl(ph7.5)、50mmmgcl2、50mmnacl、0.1％tween20)中，af29-5f(50nm)與af29-c14b(100nm)或af29-c13b(100nm)以及黃曲霉毒素b1溫育，然后測(cè)fam的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為528nm)。隨著黃曲霉毒素b1的加入，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，結(jié)果如圖2所示。

實(shí)施例3：采用熒光素(fam)標(biāo)記的核酸適配體af27-5f和bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸分子af27-c14b檢測(cè)黃曲霉毒素b1

fam標(biāo)記的核酸適配體af27-5f序列為seqidno.3(5’-tcacgtgttgtctctctgtgtctcgtg-3’)，fam標(biāo)記在序列的5’端。bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸a27-c14b的序列為seqidno.8(5’-gagacaacacgtga-3’)，猝滅劑bhq-1標(biāo)記在序列的3’端。在結(jié)合緩沖溶液(10mmtris-hcl(ph7.5)、50mmmgcl2、50mmnacl、0.1％tween20)中，af27-5f(50nm)與af27-c14b(100nm)以及黃曲霉毒素b1溫育，然后測(cè)fam的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為528nm)。隨著黃曲霉毒素b1的加入，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，結(jié)果如圖3所示。

上述實(shí)施例的結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明檢測(cè)所用的適配體分子對(duì)和檢測(cè)方法對(duì)目標(biāo)分子的響應(yīng)特異性強(qiáng)，檢測(cè)精度高，檢測(cè)限低。

綜上所述，本發(fā)明提供的檢測(cè)黃曲霉毒素b1的適配體分子對(duì)、試劑盒及其檢測(cè)方法為檢測(cè)黃曲霉毒素b1提供了新的技術(shù)手段，本發(fā)明的適配體分子對(duì)具有易合成、易標(biāo)記、成本低、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，具有非常好的應(yīng)用前景。

以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心

<120>檢測(cè)黃曲霉毒素b1的適配體分子對(duì)、試劑盒及其檢測(cè)方法

<130>ib177076

<160>8

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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