本申請為申請日為2015年4月4日、申請?zhí)枮?01510157509.1、發(fā)明名稱為“一種基于碳點(diǎn)熒光關(guān)-開模式檢測肌醇六磷酸的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。

本發(fā)明涉及熒光分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于碳點(diǎn)熒光關(guān)-開模式檢測肌醇六磷酸的方法中使用的碳點(diǎn)熒光探針的制備方法。

背景技術(shù)：

肌醇六磷酸，又稱植酸，廣泛存在于谷類和豆類等植物性食物中。肌醇六磷酸是一種重要的有機(jī)磷系添加劑，以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)、生理和藥理功能，廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、日化、冶金等行業(yè)中。通常認(rèn)為肌醇六磷酸是一種抗?fàn)I養(yǎng)劑，然而近年來許多研究表明它具有諸多生理活性作用，因而，肌醇六磷酸越來越受到人們的關(guān)注。為深入理解其生理作用并為日常飲食攝入提供有效指導(dǎo)，肌醇六磷酸的定量分析尤為重要。目前肌醇六磷酸的檢測方法主要有沉淀法、比色法和高壓液相色譜法。沉淀法和比色法較為直觀，但選擇性和靈敏度較差。液相色譜法存在儀器價(jià)格昂貴，檢測成本高，操作人員需經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)等不足，難以用于現(xiàn)場檢測。

熒光分析法由于靈敏度高、選擇性好、操作簡便快捷等特點(diǎn)而具有明顯的檢測優(yōu)勢，在環(huán)境監(jiān)測和食品安全等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。熒光碳點(diǎn)不僅具有優(yōu)良的光學(xué)性能與小尺寸特性，而且具有良好的生物相容性，易于實(shí)現(xiàn)表面功能化，在生化傳感、成像分析、環(huán)境檢測、光催化技術(shù)及藥物載體等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用潛力。近年來，碳點(diǎn)的熒光性質(zhì)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于檢測各種離子、有機(jī)小分子和生物大分子。同時(shí)，通過表面功能化可以調(diào)控碳點(diǎn)表面性質(zhì)，進(jìn)而設(shè)計(jì)多種高效檢測體系。因此，基于碳點(diǎn)優(yōu)異的熒光特性，將熒光分析和納米技術(shù)相結(jié)合，建立針對肌醇六磷酸的高靈敏、快速、低成本的熒光檢測方法，具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏和高選擇性的檢測食品中肌醇六磷酸的熒光方法中使用的碳點(diǎn)熒光探針的制備方法。

利用碳點(diǎn)熒光猝滅(關(guān))和熒光恢復(fù)(開)的性質(zhì)，將其應(yīng)用到肌醇六磷酸檢測中，開發(fā)出一種碳點(diǎn)熒光關(guān)-開模式的檢測方法。首先用三價(jià)鐵離子(fe(iii))將碳點(diǎn)熒光猝滅，然后加入待測樣品，熒光被恢復(fù)，隨著待測樣品濃度的增加，恢復(fù)的熒光發(fā)生由弱到強(qiáng)的變化，從而實(shí)現(xiàn)定性和定量的檢測。

基于碳點(diǎn)熒光關(guān)-開模式檢測肌醇六磷酸的方法，用三價(jià)鐵離子將碳點(diǎn)熒光猝滅，然后加入肌醇六磷酸樣品，熒光被恢復(fù)，隨著待測樣品濃度的增加，恢復(fù)的熒光發(fā)生由弱到強(qiáng)的變化，實(shí)現(xiàn)定性和定量的檢測。

基于碳點(diǎn)熒光關(guān)-開模式檢測肌醇六磷酸的方法包括如下步驟：

(1)制備碳點(diǎn)熒光探針；

(2)配置一系列濃度的肌醇六磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；

(3)向碳點(diǎn)溶液中加入三價(jià)鐵，使碳點(diǎn)逐漸熒光猝滅，得到碳點(diǎn)/三價(jià)鐵溶液；

(4)向步驟(3)中熒光猝滅的溶液中加入肌醇六磷酸，使碳點(diǎn)熒光恢復(fù)；

(5)測定中碳點(diǎn)/三價(jià)鐵和肌醇六磷酸反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度，根據(jù)肌醇六磷酸濃度和相對熒光強(qiáng)度變化值之間的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(6)定量檢測：測定待測樣品和碳點(diǎn)/fe(iii)混合溶液反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化，計(jì)算相對熒光強(qiáng)度變化值，對比步驟(3)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測樣品中肌醇六磷酸的含量。

上述方法中，碳點(diǎn)熒光探針的制備方法包括：按檸檬酸和賴氨酸質(zhì)量比為2.5～3：1，以及按每升水中105克檸檬酸計(jì)，將檸檬酸和賴氨酸加入水中，得到混合溶液；混合溶液在溫度為200℃下反應(yīng)5小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后將溶液置于純水溶液中透析36h以上，去除雜質(zhì)。

上述制備方法中，優(yōu)選的是，檸檬酸和賴氨酸質(zhì)量比優(yōu)選為2.87：1。

肌醇六磷酸標(biāo)準(zhǔn)品的配置方法為：用10～100毫摩爾每升的嗎啉乙磺酸緩沖液配制肌醇六磷酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液，儲備液濃度為0.1～10毫摩爾每升。

嗎啉乙磺酸緩沖液ph5.0-6.0。

相對熒光強(qiáng)度變化值根據(jù)公式(f-fa)/fa×100％計(jì)算，其中fa表示碳點(diǎn)/fe(iii)的熒光強(qiáng)度，f表示碳點(diǎn)/fe(iii)與不同濃度肌醇六磷酸反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度。

在步驟(3)中，所述碳點(diǎn)溶液為用10～100毫摩爾每升(ph5.0-6.0)嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋后的溶液，其中碳點(diǎn)濃度為0.1～0.2毫克每升。所述三價(jià)鐵離子在混合溶液中的最終濃度為100微摩爾每升。

在步驟(5)中，所述熒光強(qiáng)度的測量可以通過任意一款熒光光譜儀實(shí)現(xiàn)；所述相對熒光強(qiáng)度變化值根據(jù)公式(f-fa)/fa×100％計(jì)算得到，其中fa表示碳點(diǎn)/fe(iii)的熒光強(qiáng)度，f表示碳點(diǎn)/fe(iii)與不同濃度肌醇六磷酸反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度；所述熒光強(qiáng)度的測試條件如下：熒光發(fā)射波長為碳點(diǎn)熒光發(fā)射光譜的波峰，熒光激發(fā)波長為相應(yīng)激發(fā)光譜的波峰。

基于碳點(diǎn)熒光關(guān)-開模式檢測肌醇六磷酸的方法的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)所述熒光探針即碳點(diǎn)，具有成本低廉、生物相容性好和熒光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，且對肌醇六磷酸有較好的選擇性和較高的靈敏度；(2)該方法建立的熒光分析法，能夠快速有效地檢測肌醇六磷酸，提高了樣品檢測效率，縮短了樣品檢測時(shí)間，且操作簡便快捷；(3)該熒光分析法具有響應(yīng)快速、操作簡便、成本低廉和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，由于高選擇性，該方法適用于食品中的肌醇六磷酸酸的精確分析和定量檢測。

附圖說明

圖1：為碳點(diǎn)/fe(iii)與不同濃度肌醇六磷酸反應(yīng)后的熒光發(fā)射光譜圖。

圖2：為熒光檢測方法測定肌醇六磷酸的檢測限和線性范圍。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

以玉米種子中所含肌醇六磷酸為檢測對象，具體操作步驟如下：

(1)制備碳點(diǎn)熒光探針：將4.2g檸檬酸和2.1g賴氨酸加入到40ml超純水中。經(jīng)攪拌2～3分鐘后，加入到反應(yīng)釜中?；旌先芤涸?00℃下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將溶液置于純水溶液中透析36h，去除雜質(zhì)，用10mmol/l(ph＝5.7)嗎啉乙磺酸緩沖液將透析所得碳點(diǎn)稀釋至0.2mg/l；

(2)配置肌醇六磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：用10mmol/l(ph＝5)的嗎啉乙磺酸緩沖液配制肌醇六磷酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液，儲備液濃度為0.1mmol/l至10mmol/l，用嗎啉乙磺酸緩沖液將儲備液配置成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液；

(3)熒光猝滅：向2ml0.2mg/l碳點(diǎn)溶液中加入20μl10mmfecl3溶液，使碳點(diǎn)逐漸熒光猝滅，使用熒光光譜儀測量猝滅后的熒光強(qiáng)度fa＝63，(見圖1中a曲線)；

(4)熒光恢復(fù)：向上述碳點(diǎn)/fe(iii)混合溶液中加入0.68，1.35，2.71，5.40，8.08，13.41，18.68，23.91，29.08，34.21μm肌醇六磷酸，使碳點(diǎn)熒光恢復(fù)，使用熒光光譜儀測量熒光強(qiáng)度f，分別為64.26，65.52，68.37，71.33，75.56，79.21，85.91，94.62，114.63，118.30(見圖1中b-k曲線)；

(5)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：由公式(f-fa)/fa×100％計(jì)算相對熒光強(qiáng)度變化值(以0.68μm肌醇六磷酸為例，(f-fa)/fa×100％＝(64.26—63)/63×100％＝0.02)，根據(jù)肌醇六磷酸濃度與相對熒光強(qiáng)度變化值之間的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

(6)定量檢測：取0.5g玉米種子經(jīng)干燥后粉碎，加入10ml0.5m鹽酸，振蕩2小時(shí)后，離心，過濾，收集濾液；將濾液通過陰離子交換柱，以0.7m氯化鈉溶液洗脫，用10mmph5.7的嗎啉乙磺酸緩沖液將收集的洗脫液稀釋至50ml。利用熒光光譜儀，測定50μl待測樣品和碳點(diǎn)/fe(iii)混合溶液反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化，計(jì)算相對熒光強(qiáng)度變化值，(f-fa)/fa×100％＝(76.23—63)/63×100％＝0.21，對比步驟(5)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測樣品中肌醇六磷酸的含量為10.14μm。

實(shí)施例2：

具體操作步驟如下：

(1)制備碳點(diǎn)熒光探針：將4.2g檸檬酸和1.4g賴氨酸加入到40ml超純水中。經(jīng)攪拌2～3分鐘后，加入到反應(yīng)釜中?；旌先芤涸?00℃下反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將溶液置于純水溶液中透析36h，去除雜質(zhì)，用10mmol/l(ph＝5.7)的嗎啉乙磺酸緩沖液將透析所得碳點(diǎn)稀釋至0.1mg/l；

(2)配置肌醇六磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：用10mmol/l(ph＝6)的嗎啉乙磺酸緩沖液配制肌醇六磷酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液，儲備液濃度為0.1mmol/l至10mmol/l，用嗎啉乙磺酸緩沖液將儲備液配置成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液；

(3)熒光猝滅：向2ml0.1mg/l碳點(diǎn)溶液中加入20μl10mmfecl3溶液，使碳點(diǎn)逐漸熒光猝滅，測量猝滅后的熒光強(qiáng)度fa＝31；

(4)熒光恢復(fù)：向上述碳點(diǎn)/fe(iii)混合溶液中加入0.68，1.35，2.71，5.40，8.09，13.41，18.69，23.91，29.08，34.21μm肌醇六磷酸，使碳點(diǎn)熒光恢復(fù)，測量熒光強(qiáng)度f，分別為31.62，32.24，33.64，35.10，37.18，39.02，42.27，45.78，52.40，56.93；

(5)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：由公式(f-fa)/fa×100％計(jì)算相對熒光強(qiáng)度變化值：以0.68μm肌醇六磷酸為例，(f-fa)/fa×100％＝(31.62—31)/31×100％＝0.02，根據(jù)肌醇六磷酸濃度與相對熒光強(qiáng)度變化值之間的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

(6)定量檢測：取0.5g玉米種子經(jīng)干燥后粉碎，加入10ml0.5m鹽酸，振蕩2小時(shí)后，離心，過濾，收集濾液；將濾液通過陰離子交換柱，以0.7m氯化鈉溶液洗脫，用10mmph5.7嗎啉乙磺酸緩沖液將收集的洗脫液稀釋至50ml。利用熒光光譜儀，測定50μl待測樣品和碳點(diǎn)/fe(iii)混合溶液反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化，計(jì)算相對熒光強(qiáng)度變化值，(f-fa)/fa×100％＝(37.5—31)/31×100％＝0.209對比步驟(5)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測樣品中肌醇六磷酸的含量為10.12μm。

該方法同樣適用于其它谷物食品中肌醇六磷酸的精確分析和定量檢測，如小麥、大麥種子等。上述內(nèi)容均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。