本發(fā)明屬于藥品中抗生素類藥物含量的測定技術領域，具體涉及一種β-環(huán)糊精增敏亞甲基藍熒光法測定抗生素類藥物含量的方法。
背景技術：
抗生素是由某些微生物產(chǎn)生的化學物質，能抑制微生物和其它細胞增殖的物質，包括抗細菌藥物、抗真菌藥物以及對抗其他微小病原的藥物，常見的抗生素類藥物有頭孢氨芐、頭孢拉定和左氧氟沙星等。
對抗生素類藥物的測定已見報道的方法主要有分光光度法、熒光法、流動注射化學發(fā)光法、高效液相色譜法和電化學分析法等。然而分光光度法的靈敏度不夠，高效液相色譜法所需設備較昂貴，難于普及，而已報道的熒光法以及化學發(fā)光法均需對抗生素類藥物先在強酸介質或強堿介質中水浴加熱水解20min使其生成熒光產(chǎn)物，其分析過程較長且步驟較為繁瑣。
環(huán)糊精(cyclodextrin，簡稱cd)是由親水的外腔和能夠包合一系列有機或無機化合物的疏水性空腔組合而成的環(huán)狀聚合物，其中β-cd的應用最為廣泛。有機客體分子被β-cd包結后，β-cd空腔內(nèi)的高電子云密度會誘導客體分子的電子發(fā)生移動，從而影響有機客體分子的光學性質。利用這種原理可以測定出客體分子與β-cd的包結平衡常數(shù)及熱力學常數(shù)，同時通過改變?nèi)芤簶O性、離子強度等因素可以推測包結過程的驅動力。
亞甲基藍(methyleneblue)是一種芳香雜環(huán)化合物，具有剛性平面，易產(chǎn)生熒光，常被用作化學指示劑、染料、生物染色劑和藥物使用。已有文獻報道，染料作為一種獨特的客體，可以和環(huán)糊精形成一系列穩(wěn)定的包合物，但是并未見關于研究亞甲基藍和β-環(huán)糊精包合物的報道。本專利通過紫外可見分光光度法﹑熒光光譜法﹑分子模擬和紅外光譜法研究了β-cd和亞甲基藍形成包合物的包合機理及微環(huán)境對包合物光譜性能的影響，并求出了包合物的包和比及包和常數(shù)。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足而提供了一種簡單、快速且靈敏的β-環(huán)糊精增敏亞甲基藍熒光法測定抗生素類藥物含量的方法，該方法具有很高的靈敏度和較低的檢測限，并且操作簡單，干擾物質較少。
本發(fā)明為解決上述技術問題采用如下技術方案，β-環(huán)糊精增敏亞甲基藍熒光法測定抗生素類藥物含量的方法，其特征在于具體步驟為：
(1)標準曲線的繪制，在10ml比色管中依次加入不同質量濃度的抗生素類藥物標準溶液3ml、5mol/l的鹽酸溶液0.4ml和25mg/l的kbro3-kbr溶液0.6ml，搖勻，反應10min，再加入1.0×10-4mol/l的亞甲基藍溶液1.0ml，反應10min，然后加入β-cd3ml，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置30min后，以660nm為激發(fā)波長在熒光光譜儀中測定混合溶液的熒光強度f，以不加抗生素類藥物溶液的混合溶液為空白f0，計算δf＝f-f0，并用δf對抗生素類藥物標準溶液的質量濃度繪制標準曲線；
(2)待測藥品中抗生素類藥物含量的測定，將待測藥品研磨、精密稱重并溶解稀釋成10mg/l的待測藥品溶液，移取待測藥品溶液3ml置于10ml的比色皿中，并加入5mol/l的鹽酸溶液0.4ml和25mg/l的kbro3-kbr溶液0.6ml，搖勻，反應10min，再加入1.0×10-4mol/l的亞甲基藍溶液1.0ml，反應10min，然后加入β-cd3ml，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置30min后，以660nm為激發(fā)波長在熒光光譜儀中測定混合溶液的熒光強度f1，以不加抗生素類藥物溶液的混合溶液為空白f0，計算δf1＝f1-f0，并根據(jù)步驟(1)繪制的標準曲線計算得到待測藥品溶液中抗生素類藥物的質量濃度，然后根據(jù)待測藥品溶液中抗生素類藥物的質量濃度、待測藥品溶液的體積及待測藥品的質量計算得到待測藥品中抗生素類藥物的含量。
進一步優(yōu)選，所述的抗生素類藥物為頭孢氨芐、頭孢拉定或左氧氟沙星。
進一步優(yōu)選，所述的熒光光譜儀在測定過程中的溫度保持在10℃。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下有益效果：
1、本發(fā)明利用氧化劑溴水與抗生素類還原性藥物發(fā)生氧化還原反應，選擇性較強，反應較為靈敏；
2、本發(fā)明用熒光法間接測定抗生素類藥物的含量，靈敏度較高，操作簡單，不需要復雜的大型儀器；
3、本發(fā)明利用β-環(huán)糊精作增敏劑，通過主客體相互作用與亞甲基藍形成包合物，可以在更低濃度下間接測定抗生素類藥物的含量，大大降低了該類抗生素類藥物的檢測限；
4、本發(fā)明的測定方法對實際樣品進行檢測過程，進行50次平行測定得出相對標準偏差小于2％，表明該方法重現(xiàn)性較好，穩(wěn)定性較高且靈敏度較高。
附圖說明
圖1是mb在kbro3-kbr、kbro3-kbr/β-cd、kbro3-kbr/cpx、kbro3-kbr/β-cd/cpx中的熒光光譜圖。
具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步詳細說明，但不應該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明利用β-環(huán)糊精作為增敏劑，通過主客體相互作用與亞甲基藍形成包合物的方法測定抗生素類藥物的含量，代表性的抗生素類藥物主要有頭孢氨芐、頭孢拉定和左氧氟沙星等。其中頭孢氨芐的結構式如式(i)所示，頭孢拉定的結構式如式(ii)所示，左氧氟沙星的結構式如式(iii)所示。
通過研究發(fā)現(xiàn)，測定這幾種抗生素類藥物均是利用β-環(huán)糊精增敏亞甲基藍的方法，β-環(huán)糊精的空腔大小和疏水性使其特別容易包合熒光試劑亞甲基藍，屬于一種超分子自組裝，能大大增強亞甲基藍的熒光強度。利用β-環(huán)糊精作為敏化劑，通過主客體相互作用與亞甲基藍形成包合物，其熒光強度是亞甲基藍的近2倍，作為熒光探針使用，可以大大提高測定的靈敏度，進而能夠實現(xiàn)在更低濃度下間接測定該類抗生素類藥物的含量。
本發(fā)明測定過程的實驗方法為：(1)標準曲線的繪制，在10ml比色管中依次加入不同質量濃度的抗生素類藥物標準溶液3ml、5mol/l的鹽酸溶液0.4ml和25mg/l的kbro3-kbr溶液0.6ml，搖勻，反應10min，再加入1.0×10-4mol/l的亞甲基藍溶液1.0ml，反應10min，然后加入β-cd3ml，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置30min后，以660nm為激發(fā)波長在熒光光譜儀中測定混合溶液的熒光強度f，以不加抗生素類藥物溶液的混合溶液為空白f0，計算δf＝f-f0，并用δf對抗生素類藥物標準溶液的質量濃度繪制標準曲線；
(2)待測藥品中抗生素類藥物含量的測定，將待測藥品研磨、精密稱重并溶解稀釋成10mg/l的待測藥品溶液，移取待測藥品溶液3ml置于10ml的比色皿中，并加入5mol/l的鹽酸溶液0.4ml和25mg/l的kbro3-kbr溶液0.6ml，搖勻，反應10min，再加入1.0×10-4mol/l的亞甲基藍溶液1.0ml，反應10min，然后加入β-cd3ml，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置30min后，以660nm為激發(fā)波長在熒光光譜儀中測定混合溶液的熒光強度f1，以不加抗生素類藥物溶液的混合溶液為空白f0，計算δf1＝f1-f0，并根據(jù)步驟(1)繪制的標準曲線計算得到待測藥品溶液中抗生素類藥物的質量濃度，然后根據(jù)待測藥品溶液中抗生素類藥物的質量濃度、待測藥品溶液的體積及待測藥品的質量計算得到待測藥品中抗生素類藥物的含量。
實施例1
頭孢氨芐的檢測
本實施例選擇采用本法對市售頭孢氨芐片(黑龍江惠普生醫(yī)藥有限公司)和頭孢氨芐膠囊(石藥集團歐意有限公司)中頭孢氨芐含量進行測定，作為待測樣品，對其中的頭孢含量進行檢測。
依照實驗所述方法進行實驗后，在熒光光譜儀上分別繪制mb在kbro3-kbr、kbro3-kbr/β-cd、kbro3-kbr/cpx、kbro3-kbr/β-cd/cpx中的熒光光譜圖(如圖1所示)。該方法包括四個階段，第一階段為bro3-+5brˉ+6h+＝3br2+3h2o，kbro3-kbr在強酸中生成br2；第二階段為未知的頭孢氨芐與過量已知的br2之間的氧化還原反應，此階段中頭孢氨芐被消耗殆盡；第三階段為剩余的br2與適量已知的mb之間的氧化還原反應，此階段中剩余的br2被消耗殆盡；第四階段為β-cd與剩余的mb之間發(fā)生包合反應，形成較穩(wěn)定的包合產(chǎn)物，β-cd的疏水空腔增強剩余mb的熒光強度，在最大激發(fā)波長為660nm條件下測定頭孢氨芐的含量。根據(jù)以上步驟，分別繪制了在hcl介質中，mb在β-cd和水溶液中的熒光發(fā)射光譜圖(如圖1)，得出以下結論：(1)加入β-cd后fkbro3-kbr+mb上升為原來的近5倍(曲線1和2)；(2)加入頭孢氨芐后fkbro3-kbr+mb上升為原來的近8倍(曲線1和3)；(3)在等量的頭孢氨芐條件下，δf＝fcpx+kbro3-kbr+mb+β-cd-f0kbro3-kbr+mb+β-cd(曲線4和2)的熒光增敏值是δf＝fcpx+kbro3-kbr+mb–f0kbro3-kbr+mb(曲線3和1)的近3倍，由此可知痕量的頭孢氨芐對β-cd增敏kbro3-kbr氧化mb體系的熒光具有增強作用。
關于該體系的反應機理，我們推測可能是：
(1)bro3-+5br-+6h+＝3br2+3h2o
(2)
(3)
取頭孢氨芐片8片精細研磨均勻后稱其重量，取其重量的十分之一(約為0.20g頭孢氨芐)溶于100ml容量瓶中，超聲30min，干過濾，取其后續(xù)濾液5ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，備用。
取頭孢氨芐膠囊8?；旌暇鶆蚝蠓Q其重量，取其重量的十分之一(約為0.20g頭孢氨芐)溶于100ml容量瓶中，超聲30min，干過濾，取其后續(xù)濾液5ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，備用。
采用本方法對市售頭孢氨芐片(黑龍江惠普生醫(yī)藥有限公司)和頭孢氨芐膠囊(石藥集團歐意有限公司)中的頭孢氨芐含量進行測定，結果如表1所示。
表1實際樣品中頭孢氨芐含量的測定結果
實施例2
頭孢拉定的檢測
采用本法對市售頭孢拉定片(石藥集團歐意有限公司)和頭孢拉定膠囊(石藥集團歐意有限公司)中的頭孢拉定含量進行測定，所得結果與hplc法的測定結果全部繪制到下表。發(fā)現(xiàn)我們所用的方法無論是用f-檢驗或是t-檢驗都不存在顯著性差異，說明該分析方法可靠，能用于實際樣品中頭孢拉定含量的測定，可以用于臨床檢驗，結果如表2所示。
表2實際樣品中頭孢拉定含量的測定結果
實施例3
左氧氟沙星的檢測
采用本法對市售鹽酸左氧氟沙星片(四川珍珠制藥有限公司)，鹽酸左氧氟沙星膠囊(揚子江藥業(yè)集團有限公司)中的左氧氟沙星含量進行測定，結果如表3所示。
表3實際樣品中左氧氟沙星含量的測定結果
以上實施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點，本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進均落入本發(fā)明保護的范圍內(nèi)。