本發(fā)明屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種側(cè)柏葉tlc鑒別方法。

背景技術(shù)：

側(cè)柏葉又名柏葉、叢柏葉、扁柏、云片柏等，是醫(yī)家所重視的治血良藥。中醫(yī)認(rèn)為側(cè)柏葉味苦，性微寒，無(wú)毒，入心、肝、大腸經(jīng)。具有涼血、止血、祛內(nèi)濕、散腫毒之功?？芍瓮卵?、鼻出血、尿血、血痢、崩漏、風(fēng)濕痛、咳嗽、燙傷等癥。根據(jù)科學(xué)研究表明，側(cè)柏葉含大量的揮發(fā)油，油中主要成分為側(cè)柏烯、小茴香酮等，葉中還含有鉀、鈉、磷、氮、鈣、鎂、錳和鋅等多種微量元素。藥理實(shí)驗(yàn)表明，側(cè)柏葉煎劑能夠明顯的縮短出血時(shí)間及凝血時(shí)間，除此以外，還有鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、鎮(zhèn)靜等作用。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，側(cè)柏葉對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、卡他球菌、白喉?xiàng)U菌、傷寒桿菌等均有很好的抑制作用，有烏須發(fā)、止血、止咳喘的功效。

目前，對(duì)中藥材的理化鑒別方法，主要包括熒光法，微量升華法，顯色，沉淀、泡沫反應(yīng)，鈣鹽、鈉鹽等鑒別反應(yīng)，薄層色譜法（tlc）等。其中，由于tlc法處理簡(jiǎn)單，成本低，可同時(shí)對(duì)多個(gè)成分進(jìn)行一個(gè)比較，不需使用復(fù)雜儀器，應(yīng)用范圍最為廣泛。如2015版中國(guó)藥典側(cè)柏葉項(xiàng)下收載了目前法定的側(cè)柏葉tlc鑒別方法，但由于該法中采用的索氏提取步驟，至少需6小時(shí)，加熱回流步驟也需要1小時(shí)，操作繁瑣，操作時(shí)間長(zhǎng)、有機(jī)試劑用量多導(dǎo)致成本較高等缺點(diǎn)，無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)際應(yīng)用中快速、簡(jiǎn)便的需求。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確，高效的側(cè)柏葉tlc鑒別方法是很有必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，提供一種側(cè)柏葉tlc鑒別方法，具有專(zhuān)屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，高效、成本低廉、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于對(duì)側(cè)柏葉藥材及飲片質(zhì)量快速檢測(cè)。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種側(cè)柏葉tlc鑒別方法，步驟包括：

（1）取待測(cè)樣品粉末0.5～1.5g，置具塞錐形瓶中，加70％甲醇10～30ml，超聲30min，過(guò)濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?ml溶解，作為供試品溶液；

（2）取槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，加乙醇配制為0.05～0.15mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液；

（3）薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各2～4μl，分別點(diǎn)于同一硅膠g薄層板上，以體積比為（10:1:1）～（14:1:1）的乙酸乙酯-甲酸-水為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴以1wt％的三氯化鋁-乙醇溶液，置紫外光燈365nm下檢視。

優(yōu)選地，步驟（1）中，各原料用量為待測(cè)樣品粉末1g、70％甲醇20ml。

優(yōu)選地，步驟（2）中，取槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，加乙醇配制為0.1mg/ml的溶液。

優(yōu)選地，步驟（3）中，吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各3μl，展開(kāi)劑乙酸乙酯-甲酸-水的體積比為12:1:1。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述的薄層色譜法試驗(yàn)為2015年版中國(guó)藥典四部0502薄層色譜法。

所述的側(cè)柏葉tlc鑒別方法，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，則待測(cè)樣品為側(cè)柏葉。

側(cè)柏葉的止血有效成分通常認(rèn)為是槲皮素和鞣質(zhì)，實(shí)際上，本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明側(cè)柏葉中沒(méi)有槲皮素，只有槲皮苷，現(xiàn)有檢測(cè)方法中，也都是將槲皮苷水解成槲皮素后進(jìn)行鑒定?，F(xiàn)有技術(shù)中，以藥典的鑒別方法為例，是將側(cè)柏葉葉綠素成分進(jìn)行提取后，再對(duì)其所含黃酮類(lèi)成分槲皮苷進(jìn)行酸水解，水解成槲皮素，再用乙酸乙酯萃取，水洗，濃縮后進(jìn)行鑒定。由于其樣品制備過(guò)程涉及索氏提取，耗時(shí)至少6h，且以乙醚為提取液，操作具一定的危險(xiǎn)性，黃酮類(lèi)成分提取、水解共計(jì)耗時(shí)1.5h。由于側(cè)柏葉中含有的是槲皮苷等黃酮類(lèi)成分，本發(fā)明改變以往采用槲皮素為對(duì)照品的通用方法，不通過(guò)水解、索氏提取等步驟，在最優(yōu)條件下，直接將槲皮苷提取出來(lái)進(jìn)行鑒定，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，便捷，有效，且能發(fā)映出側(cè)柏葉自身的特點(diǎn)，可快速準(zhǔn)確用于對(duì)側(cè)柏葉進(jìn)行tlc鑒定。

本發(fā)明技術(shù)方案相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)有益效果為：

1、快速、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好：①節(jié)約時(shí)間：該法較藥典法省去藥典中索氏提?。ㄖ辽?小時(shí)）、加熱回流1小時(shí)、酸水解等步驟，整體可將鑒定時(shí)間縮短90%。②節(jié)省試劑：上述步驟中的有機(jī)試劑均可節(jié)省，尤其是減少了乙醚的使用，減少操作過(guò)程的不適性和危險(xiǎn)性。③重現(xiàn)性好：該法較為簡(jiǎn)單、易操作，重現(xiàn)性好。

2、以槲皮苷為對(duì)照更適宜于鑒別側(cè)柏葉：因側(cè)柏葉中含有槲皮苷不含槲皮素成分，因此更適于側(cè)柏葉的鑒別。

3、色譜清晰，各斑點(diǎn)分離良好：該方法所得圖譜的斑點(diǎn)清晰，分離良好，重現(xiàn)性好。

4、節(jié)約藥材：與藥典方法相比，鑒別用側(cè)柏葉由3g降到1g，明顯節(jié)約了藥材用量。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1側(cè)柏葉tlc鑒別圖譜，圖中1-5，6-9均為側(cè)柏葉，5-槲皮苷對(duì)照品；

圖2為實(shí)施例2側(cè)柏葉tlc鑒別圖譜，圖中1-4,6-9均為側(cè)柏葉，5-槲皮苷對(duì)照品；

圖3為實(shí)施例3側(cè)柏葉tlc鑒別圖譜，圖中1-4,6-9均為側(cè)柏葉，5-槲皮苷對(duì)照品；

圖4為對(duì)比例1側(cè)柏葉tlc鑒別圖譜，圖中1-5,7-10均為側(cè)柏葉，6-槲皮素對(duì)照品；

圖5為對(duì)比例2側(cè)柏葉tlc鑒別圖譜，圖中1-4,6-9均為側(cè)柏葉，5-槲皮苷對(duì)照品；

圖6為對(duì)比例3側(cè)柏葉tlc鑒別圖譜，圖中1-4,6-9均為側(cè)柏葉，5-槲皮素對(duì)照品。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明方案及有益效果。

實(shí)施例1

一種側(cè)柏葉tlc鑒別方法，步驟包括：

（1）取待測(cè)樣品粉末1g，置具塞錐形瓶中，加70％甲醇20ml，超聲30min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?ml溶解，作為供試品溶液；

（2）取槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，加乙醇配制為0.1mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液；

（3）照2015年版中國(guó)藥典四部0502薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各3μl，分別點(diǎn)于同一硅膠g薄層板上，以體積比為12:1:1的乙酸乙酯-甲酸-水為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴以1wt％的三氯化鋁-乙醇溶液，置紫外光燈365nm下檢視。

供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，tlc薄層圖譜見(jiàn)圖1，待測(cè)樣品為側(cè)柏葉。由圖1可見(jiàn)，8批側(cè)柏葉中均檢出槲皮苷，且斑點(diǎn)清晰，分離度良好。

實(shí)施例2

一種側(cè)柏葉tlc鑒別方法，步驟包括：

（1）取待測(cè)樣品粉末0.5g，置具塞錐形瓶中，，加70％甲醇10ml，超聲30min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?ml溶解，作為供試品溶液；

（2）取槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，加乙醇配制為0.05mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液；

（3）照2015年版中國(guó)藥典四部0502薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠g薄層板上，以體積比為10:1:1的乙酸乙酯-甲酸-水為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴以1wt％的三氯化鋁-乙醇溶液，置紫外光燈365nm下檢視。

供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，tlc薄層圖譜見(jiàn)圖2，待測(cè)樣品為側(cè)柏葉。由圖2可見(jiàn)，8批側(cè)柏葉中均檢出槲皮苷，且斑點(diǎn)清晰，分離度良好。

實(shí)施例3

一種側(cè)柏葉tlc鑒別方法，步驟包括：

（1）取待測(cè)樣品粉末1.5g，置具塞錐形瓶中，，加70％甲醇30ml，超聲30min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?ml溶解，作為供試品溶液；

（2）取槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，加乙醇配制為0.15mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液；

（3）照中國(guó)藥典四部0502薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各4μl，分別點(diǎn)于同一硅膠g薄層板上，以體積比為14:1:1的乙酸乙酯-甲酸-水為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴以1wt％的三氯化鋁-乙醇溶液，置紫外光燈365nm下檢視。

供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，tlc薄層圖譜見(jiàn)圖3，待測(cè)樣品為側(cè)柏葉。由圖3可見(jiàn)，8批側(cè)柏葉中均檢出槲皮苷，且斑點(diǎn)清晰，分離度良好。

對(duì)比例1：2015版中國(guó)藥典

取樣品（同實(shí)施例1）粉末3g，置索氏提取器中，加乙醚適量，加熱，回流至提取液無(wú)色，棄去乙醚液，藥渣揮干乙醚，加70％乙醇50ml，加熱回流1小時(shí)，趁熱濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5ml使溶解，加鹽酸3ml，加熱水解30分鐘，立即冷卻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，用水洗滌3次，每次10ml。水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?ml溶解作為供試品溶液。另取槲皮素對(duì)照品，加乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（2015年版中國(guó)藥典四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液3μl，分別點(diǎn)于同一硅膠g薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:2:1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1％三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。tlc薄層圖譜見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，9批側(cè)柏葉中均檢出槲皮素，且斑點(diǎn)清晰，分離度良好。

對(duì)比例2

將步驟（2）對(duì)照品槲皮苷替換為槲皮素,其余步驟同實(shí)施例1；tlc薄層圖譜見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，8批側(cè)柏葉在槲皮素相應(yīng)位置均未檢出相同顏色的熒光斑點(diǎn)，因此可以斷定側(cè)柏葉中不含槲皮素成分。

對(duì)比例3

將步驟（1）70％甲醇20ml替換為乙醇20ml，其余步驟同實(shí)施例1；tlc薄層圖譜見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)，8批側(cè)柏葉在槲皮苷相應(yīng)位置均檢出相同顏色的熒光斑點(diǎn)。因此認(rèn)為改法中甲醇和乙醇均可作為提取溶劑。

結(jié)果分析

由實(shí)施例1-3可見(jiàn)，本發(fā)明方法快速、簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，易操作，受影響因素小，重現(xiàn)性好；有效減少了有機(jī)試劑的用量，一方面減少危險(xiǎn)性，另一方面節(jié)約了成本。采用hplc法對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，側(cè)柏葉中含有槲皮苷成分，不含槲皮素成分，因此本方法建立的以槲皮苷為對(duì)照品用于側(cè)柏葉的tlc鑒定合理可行。

實(shí)施例及對(duì)比例結(jié)果分析：（1）新建方法與藥典法比較可見(jiàn)，并未影響槲皮苷的鑒別，新建方法的斑點(diǎn)清晰，分離良好。

（2）與藥典法比較，采用槲皮苷為對(duì)照品進(jìn)行鑒別更適宜于鑒別側(cè)柏葉，因側(cè)柏葉中含有槲皮苷不含槲皮素成分，從理論上講更適于側(cè)柏葉的鑒別，因此專(zhuān)屬性更強(qiáng)。

（3）該法與藥典法比較，所用側(cè)柏葉樣品由3g降到1g，明顯節(jié)約了側(cè)柏葉用量。

綜上所述，本發(fā)明方法具有現(xiàn)有側(cè)柏葉鑒別方法不可比擬的突出優(yōu)點(diǎn)，可用于替代現(xiàn)行藥典法等用于側(cè)柏葉的tlc鑒別。