本發(fā)明屬于中藥分析及中藥材含量測(cè)定領(lǐng)域，具體涉及一種遠(yuǎn)志藥材指紋圖譜及指標(biāo)性成分含量測(cè)定的方法。

背景技術(shù)：

遠(yuǎn)志polygalatenuifoliawilld.，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，并被視為養(yǎng)命要藥。性溫，味苦、辛，具有安神益智、祛痰消腫等功效。經(jīng)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志藥材的主要有效成分包括皂苷類、糖酯類、口山酮類及生物堿類等，具有抑菌、抗炎、提高認(rèn)知、改善記憶能力、抗老年癡呆、抗抑郁、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用。

中藥材藥效的強(qiáng)弱與藥材質(zhì)量的優(yōu)劣密切相關(guān)，而藥材質(zhì)量的優(yōu)劣與藥材中所含主要化學(xué)成分含量的高低緊密相關(guān)。中藥材中多種已知或未知的化學(xué)成分，通過(guò)多條途徑作用于多靶點(diǎn)發(fā)揮其藥理作用。目前關(guān)于遠(yuǎn)志藥材的定性分析，主要為指紋圖譜分析，但之前建立的方法耗時(shí)較長(zhǎng)，損耗試劑較多，不利于高通量分析，對(duì)于復(fù)雜成分的指認(rèn)也不充分；對(duì)遠(yuǎn)志藥材中化學(xué)成分的定量分析，主要集中于個(gè)別成分為指標(biāo)的測(cè)定，單一指標(biāo)成分難以準(zhǔn)確、全面地體現(xiàn)中藥材的內(nèi)在質(zhì)量，中藥多指標(biāo)質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)模式需要有各種成分的對(duì)照品，但部分中藥對(duì)照品分離難度大、單體不穩(wěn)定、難以供應(yīng)或供應(yīng)價(jià)格高等問(wèn)題的存在，使其不能滿足中藥質(zhì)量監(jiān)控和新藥研發(fā)等方面的需求，目前遠(yuǎn)志藥材中已測(cè)定含量的化合物數(shù)量較少。故針對(duì)上述復(fù)雜成分指認(rèn)不充分以及定量化學(xué)成分較少等缺陷，本發(fā)明提供一種遠(yuǎn)志藥材指紋圖譜及指標(biāo)性成分含量測(cè)定的方法，該方法能夠較全面地對(duì)遠(yuǎn)志藥材中化合物進(jìn)行定性及定量分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種遠(yuǎn)志藥材指紋圖譜及指標(biāo)性成分含量測(cè)定的方法，該方法能夠較全面地對(duì)遠(yuǎn)志藥材中化合物進(jìn)行定性及定量分析。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種遠(yuǎn)志藥材指紋圖譜及指標(biāo)性成分的含量測(cè)定方法，步驟如下：

步驟1：采用超高效液相(ultraperformanceliquidchromatography，uplc)全波長(zhǎng)可見(jiàn)紫外檢測(cè)法，建立遠(yuǎn)志藥材的指紋圖譜；

混合對(duì)照品溶液的制備：分別稱取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，定容至lancerin、sibiricaxanthoneb、glomeratosea、7-o-methylmangiferin、polygalaxanthoneiii終濃度為1-100μg/ml，sibiricosea5、sibiricosea6、tenuifolisidec終濃度為100-300μg/ml，3，6′-disinapoylsucrose、tenuifolisidea終濃度為300-500μg/ml，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液，并置于4℃冰箱中備用；

供試品溶液的制備：取遠(yuǎn)志藥材粉碎并過(guò)藥典三號(hào)篩，取遠(yuǎn)志藥材粉末約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密移取70％甲醇溶液20ml，稱定重量，超聲處理30min(功率500w，頻率40khz)，放至室溫，再稱定重量，用70％甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.22μm微孔濾膜，即得；

指紋圖譜的測(cè)定：分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各2-10μl，注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖，采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》生成遠(yuǎn)志藥材指紋圖譜；

其中，色譜條件如下：

色譜柱：uplcc18柱或t3柱；

流動(dòng)相：流動(dòng)相a為乙腈，流動(dòng)相b為體積濃度為0.1-1.0％的甲酸水溶液；

洗脫梯度：0-3min，5-10％a；3-6min，10-12％a；6-16min，12-22％a；16-17min，22％a；17-22min，22-27％a；22-25min，27-32％a；25-27min，32-35％a；27-30min，35％a；30-36min，35-40％a；36-37min，40-100％a；37-39min，100-5％a。

進(jìn)樣量：2-10μl；

柱溫：20-40℃；

流速：0.2-0.5ml/min；

檢測(cè)波長(zhǎng)：290-330nm；

步驟2：利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)步驟1中指紋圖譜的色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，確定紫外檢測(cè)共有的指紋峰及非共有峰，其中液相色譜條件同步驟1，質(zhì)譜條件如下：

離子源：電噴霧離子源(esi)；掃描方式：正負(fù)離子同時(shí)掃描；噴霧電壓：3.5kv；鞘氣流速：35psi(1psi≈6.9kpa)；輔助氣流速：10psi；毛細(xì)管溫度：320℃；探頭加溫器溫度：300℃；最大噴霧電流：100a；s-lens分辨率：55；掃描范圍：m/z100-2000；質(zhì)量分辨率：70000；

步驟3：從步驟2中指認(rèn)出的23個(gè)共有峰中篩選出8個(gè)指標(biāo)性成分(sibiricosea5、sibiricosea6、sibiricaxanthoneb、glomeratosea、polygalaxanthoneiii、3，6′-disinapoylsucrose、tenuifolisidea、tenuifolisidec)，從15個(gè)非共有峰中篩選出2個(gè)指標(biāo)性成分(lancerin、7-o-methylmangiferin)，采用超高效液相全波長(zhǎng)可見(jiàn)紫外檢測(cè)法對(duì)上述10個(gè)指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定；

測(cè)定方法為：分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各2-10μl，注入超高效液相色譜儀，確定各待測(cè)成分的色譜峰，并將混合對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，建立10個(gè)指標(biāo)性成分的線性回歸方程，分別計(jì)算供試品溶液中如上所述10個(gè)化合物的含量；

其中，色譜條件同步驟1。

進(jìn)一步，步驟1和3中流動(dòng)相b為體積濃度為0.1％的甲酸水溶液；進(jìn)樣量：2μl；柱溫：40℃；流速：0.4ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320nm。

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明通過(guò)uplc“指紋圖譜定性+指標(biāo)性成分定量”的方式，從整體和關(guān)鍵組分兩方面共同實(shí)現(xiàn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的提升，不僅全面而特定定量的確定了產(chǎn)品的質(zhì)量可控性，而且由于uplc技術(shù)的引入，大大縮短了現(xiàn)有的普遍采用hplc技術(shù)的測(cè)定時(shí)間，使得遠(yuǎn)志藥材指紋圖譜的復(fù)雜性表征得以實(shí)現(xiàn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提供的7批遠(yuǎn)志藥材指紋圖譜及標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；其中樣品1-7編號(hào)見(jiàn)表1，r為對(duì)照指紋圖譜；

圖2為遠(yuǎn)志樣品的液質(zhì)色譜圖；圖中：a：紫外色譜圖；b：正離子模式下總離子流色譜圖；c：負(fù)離子模式下總離子流色譜圖；

圖3為混合對(duì)照品溶液的uplc色譜圖；

圖4為遠(yuǎn)志藥材供試品溶液的uplc色譜圖；

圖3、圖4中：1為sibiricosea5，2為sibiricosea6，3為lancerin，4為sibiricaxanthoneb，5為glomeratosea，6為7-o-methylmangiferin，7為polygalaxanthoneiii，8為3，6′-disinapoylsucrose，9為tenuifolisidea，10為tenuifolisidec)

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本方法，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

為了更好地理解本發(fā)明內(nèi)容，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

步驟1：采用超高效液相全波長(zhǎng)可見(jiàn)紫外檢測(cè)法，建立遠(yuǎn)志藥材的指紋圖譜；1.試驗(yàn)材

料、儀器與試劑

試驗(yàn)材料：所用遠(yuǎn)志藥材樣本是從山西省不同產(chǎn)地收集到的7批遠(yuǎn)志藥材全根，用手揉搓，抽去木心，得到遠(yuǎn)志筒，粉碎，過(guò)藥典三號(hào)篩，備用。試驗(yàn)材料具體信息見(jiàn)表1。

表1遠(yuǎn)志樣品信息表

儀器：超高效液相色譜系統(tǒng)(waters公司acquityuplc，包括真空脫氣機(jī)、二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、tuv檢測(cè)器)，電子天平(cpa225d，德國(guó)sartorius公司)，milli-q超純水系統(tǒng)(美國(guó)millipore公司)，超聲波清洗器(kq-500dv，昆山市超聲儀器有限公司)，中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2008a版。

試劑：乙腈(色譜純，fisher公司)，甲酸(色譜純，fisher公司)，超純水(milli-q制備)，甲醇(國(guó)產(chǎn)分析純)。

2.混合對(duì)照品溶液的制備

分別稱取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，定容至lancerin、sibiricaxanthoneb、glomeratosea、7-o-methylmangiferin、polygalaxanthoneiii終濃度為1-100μg/ml，sibiricosea5、sibiricosea6、tenuifolisidec終濃度為100-300μg/ml，3，6′-disinapoylsucrose、tenuifolisidea終濃度為300-500μg/ml的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得，并置于4℃冰箱中備用；

3.供試品溶液的制備

取遠(yuǎn)志藥材粉碎并過(guò)藥典三號(hào)篩，取遠(yuǎn)志藥材粉末約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密移取70％甲醇溶液20ml，稱定重量，超聲處理30min(功率500w，頻率40khz)，放至室溫，再稱定重量，用70％甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.22μm微孔濾膜，即得；

4.指紋圖譜的測(cè)定

精密吸取供試品溶液2μl，注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖，即得指紋圖譜；

其中，色譜條件如下：

色譜柱：phenomenexkinetexc18(100×2.1mm，2.6μm)色譜柱

流動(dòng)相：a為乙腈，流動(dòng)相b為體積濃度為0.1％的甲酸水溶液；

梯度洗脫：0-3min，5-10％a；3-6min，10-12％a；6-16min，12-22％a；16-17min，22％a；17-22min，22-27％a；22-25min，27-32％a；25-27min，32-35％a；27-30min，35％a；30-36min，35-40％a；36-37min，40-100％a；37-39min，100-5％a；

溫度：40℃；

流速：0.4ml/min；

色譜圖光譜采集范圍：190-400nm。

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2008a版”軟件對(duì)7批遠(yuǎn)志藥材uplc指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，確定共有峰32個(gè)(如圖1所示)，由于3，6′-disinapoylsucrose在各批次遠(yuǎn)志中均有出現(xiàn)，分離度良好且峰面積較大，故選擇3，6′-disinapoylsucrose(9號(hào)峰)作為參照峰(s)，以該參照峰計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，進(jìn)行指紋圖譜方法學(xué)考察，測(cè)定方法與步驟1中相同。結(jié)果顯示，同一樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間rsd＜0.15％，相對(duì)峰面積rsd＜0.98％，精密度良好；穩(wěn)定性考察各共有峰相對(duì)保留時(shí)間rsd＜0.42％，相對(duì)峰面積rsd＜1.83％；重復(fù)性考察各共有峰相對(duì)保留時(shí)間rsd＜0.35％，相對(duì)峰面積rsd＜2.10％。

7批遠(yuǎn)志樣品的uplc指紋圖譜見(jiàn)圖1，各產(chǎn)地遠(yuǎn)志藥材指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜比對(duì)，相似度介于0.927～0.971，結(jié)果見(jiàn)表2。

表27批遠(yuǎn)志藥材間的相似度計(jì)算結(jié)果(r為對(duì)照指紋圖譜)

步驟2：利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)步驟1中指紋圖譜的色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，確定紫外檢測(cè)共有的指紋峰；

1.試驗(yàn)材料、儀器與試劑

試驗(yàn)材料及試劑：同步驟1。

儀器：thermoscientificqexactivelc-ms，美國(guó)thermo；其他儀器同步驟1。

2.質(zhì)譜條件如下：

離子源：電噴霧離子源(esi)；掃描方式：正負(fù)離子同時(shí)掃描；噴霧電壓：3.5kv；鞘氣流速：35psi(1psi≈6.9kpa)；輔助氣流速：10psi；毛細(xì)管溫度：320℃；探頭加溫器溫度：300℃；最大噴霧電流：100a；s-lens分辨率：55；掃描范圍：m/z100-2000；質(zhì)量分辨率：70000；

用步驟1中色譜條件對(duì)7批遠(yuǎn)志藥材進(jìn)行uplc指紋圖譜分析。對(duì)各樣品的32個(gè)共有峰紫外光譜圖進(jìn)行對(duì)比分析，所得紫外圖譜如圖1所示。

采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》生成遠(yuǎn)志藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其中有32個(gè)共有峰，峰號(hào)依次記為1-32號(hào)。在指紋圖譜中，以3，6′-disinapoylsucrose(9號(hào)峰)為參照峰s峰，其中1、2、3、4、5、9、11、14號(hào)峰采用對(duì)照品色譜及質(zhì)譜保留行為進(jìn)行指認(rèn)，依次為sibiricosea5、sibiricosea6、sibiricaxanthoneb、glomeratosea、polygalaxanthoneiii、3，6′-disinapoylsucrose、tenuifolisidea、tenuifolisidec，由于化合物lancerin及7-o-methylmangiferin的含量較低，在指紋圖譜中沒(méi)有這兩個(gè)化合物的共有峰，可通過(guò)對(duì)照品色譜及質(zhì)譜保留行為，并依據(jù)參考文獻(xiàn)對(duì)兩個(gè)化合物進(jìn)行指認(rèn)。

從遠(yuǎn)志藥材總離子流圖可以看出(圖2)，其各成分峰在正、負(fù)離子條件下均有較高的響應(yīng)，并與紫外色譜圖對(duì)應(yīng)。

依據(jù)對(duì)照品色譜及質(zhì)譜保留行為，并參考文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)和色譜保留行為(色譜圖見(jiàn)圖2)，對(duì)32個(gè)共有峰中的23個(gè)進(jìn)行了鑒定(見(jiàn)表3)，包括14個(gè)糖酯類成分，6個(gè)皂苷類成分，以及3個(gè)口山酮類成分。同時(shí)參考文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)和色譜保留行為對(duì)遠(yuǎn)志樣品中其他15個(gè)非共有峰進(jìn)行了歸屬，包括9個(gè)糖酯類成分以及6個(gè)口山酮類成分，結(jié)果見(jiàn)表4，。

表3遠(yuǎn)志指紋圖譜共有峰的歸屬(負(fù)離子模式)

表4基于液質(zhì)指認(rèn)的遠(yuǎn)志指紋圖譜中非共有峰的歸屬(負(fù)離子模式)

步驟3：從步驟2中指認(rèn)的23個(gè)共有峰中篩選出8個(gè)指標(biāo)性成分(sibiricosea5、sibiricosea6、sibiricaxanthoneb、glomeratosea、polygalaxanthoneiii、3，6′-disinapoylsucrose、tenuifolisidea、tenuifolisidec)，從15個(gè)非共有峰中篩選出2個(gè)指標(biāo)性成分(lancerin、7-o-methylmangiferin)，采用超高效液相全波長(zhǎng)可見(jiàn)紫外檢測(cè)法對(duì)上述10個(gè)指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定。

1.試驗(yàn)材料、儀器與試劑同步驟1。

2.混合對(duì)照品溶液及供試品溶液的制備同步驟1。

3.指標(biāo)性成分的含量測(cè)定

分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各2μl，注入超高效液相色譜儀，按步驟1中色譜條件分別對(duì)混合對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，確定各待測(cè)成分的色譜峰，并將混合對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，建立10個(gè)指標(biāo)性成分的線性回歸方程，分別計(jì)算供試品溶液中sibiricosea5、sibiricosea6、lancerin、sibiricaxanthoneb、glomeratosea、7-o-methylmangiferin、polygalaxanthoneiii、3，6′-disinapoylsucrose、tenuifolisidea、tenuifolisidec10個(gè)指標(biāo)性成分的含量，其中，10個(gè)指標(biāo)性成分的線性回歸方程見(jiàn)表5。

表5遠(yuǎn)志藥材中10種指標(biāo)性成分的線性回歸方程及線性范圍

其中，x為相應(yīng)成分在相應(yīng)檢測(cè)波長(zhǎng)處檢測(cè)得到的吸光度

4.精密度試驗(yàn)精密量取步驟1中混合對(duì)照品溶液2μl，按步驟1中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄上述10個(gè)化合物的色譜峰面積，并計(jì)算10個(gè)化合物保留時(shí)間及峰面積rsd值，保留時(shí)間的rsd值分別為0.20％、0.26％、0.30％、0.33％、0.35％、0.32％、0.34％、0.29％、0.26％、0.33％；峰面積的rsd值分別為0.41％、0.59％、0.84％、0.61％、0.87％、0.80％、0.38％、0.70％、0.91％、0.55％，表明儀器精密度良好。

5.穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批樣品(3號(hào))，按步驟1中備樣方法平行制備6份，室溫下放置，按步驟1中色譜條件分別在0、2、4、8、12、18、24h時(shí)進(jìn)樣分析，計(jì)算10個(gè)化合物保留時(shí)間及峰面積的rsd值，保留時(shí)間的rsd值分別為0.62％、0.60％、0.52％、0.43％、0.42％、0.41％、0.36％、0.21％、0.17％、0.16％；峰面積的rsd值分別為0.86％、0.95％、1.63％、0.60％、1.50％、0.48％、0.48％、0.45％、0.84％、0.34％，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

6.重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品(3號(hào))，按步驟1中備樣方法平行制備6份，按步驟1中色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算10個(gè)化合物保留時(shí)間及質(zhì)量分?jǐn)?shù)rsd值，保留時(shí)間的rsd值分別為0.57％、0.56％、0.47％、0.55％、0.49％、0.50％、0.46％、0.30％、0.28％、0.33％；質(zhì)量分?jǐn)?shù)的rsd值分別為1.43％、1.22％、2.00％、0.70％、1.99％、1.67％、2.99％、1.08％、0.88％、1.22％，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

7.加樣回收率試驗(yàn)取已測(cè)定的3號(hào)樣品6份，每份為0.1g，分成3組，每組3份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入相當(dāng)于樣品成分量50％、100％、150％的各對(duì)照品溶液，按步驟1中備樣方法制備供試品溶液，按步驟1中色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算10種成分的加樣回收率，平均回收率分別為98.45％、99.17％、95.76％、95.72％、95.44％、92.29％、91.85％、99.18％、96.11％、94.91％；rsd分別為0.96％、1.78％、1.68％、1.77％、1.72％、1.70％、0.82％、1.38％、1.16％、1.82％，符合2015版《中國(guó)藥典》中《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》的要求。

8.樣品含量測(cè)定按步驟1中備樣方法制備7批供試品溶液，按步驟1中色譜條件分別測(cè)定7批遠(yuǎn)志樣品的10種成分的含量，并計(jì)算每批樣品10種成分的總含量。7批遠(yuǎn)志藥材中10個(gè)指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6，混合對(duì)照品的色譜圖如圖3所示，遠(yuǎn)志樣品的色譜圖如圖4所示。

表67批遠(yuǎn)志中10種化學(xué)成分的含量

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。