本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢驗(yàn)領(lǐng)域，主要用于特殊醫(yī)用配方食品的脂肪酸含量測定，可提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
背景技術(shù)：
：特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品，劑型多為混懸液或粉劑，產(chǎn)品基質(zhì)不均一，成分復(fù)雜，在含量測定時(shí)均需要不同程度的前處理過程；且本方法屬于脂肪酸甲酯的含量測定，種類有37種之多，這對色譜柱類型、色譜條件、前處理、操作人員的水平等要求都是比較困難的，這些對于結(jié)果數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性都會產(chǎn)生一定影響。現(xiàn)有特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的脂肪酸含量測定方法主要為氣相法，主要來源于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測定》（gb5009.168-2016），該方法為《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品通則》（gb29922-2013）中脂肪酸含量測定的規(guī)定方法，且為2016年最新更新方法。該標(biāo)準(zhǔn)中主要介紹了3種前處理方法，其中水解-提取法適用于食品中脂肪酸含量的測定；酯交換法適用于游離脂肪酸含量不大于2%的油脂樣品的脂肪酸含量測定；乙酰氯-甲醇法適用于含水量小于5%的乳粉和無水奶油樣品的脂肪酸含量測定。前處理主要流程如下：堿水解法：稱取均勻試樣適量，移入到250ml平底燒瓶中，加入約100mg焦性沒食子酸，加入幾粒沸石，再加入2ml95%乙醇和4ml水，混勻，加入氨水5ml，混勻。將燒瓶放入70℃~80℃水浴中水解20min。每5min震蕩一下燒瓶，使粘附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后，取出燒瓶冷卻至室溫。脂肪提取：水解后的試樣，加入10ml95%乙醇，混勻。將燒瓶中的水解液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用50ml乙醚石油醚混合液沖洗燒瓶和塞子，沖洗液并入分液漏斗中，加蓋。振搖5min，靜置10min。將醚層提取液收集到250ml燒瓶中。按照以上步驟重復(fù)提取水解液3次，最后用乙醚石油醚混合液沖洗分液漏斗，并收集到250ml燒瓶中。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘留物為脂肪提取物。脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化：在脂肪提取物中加入2%氫氧化鈉甲醇溶液8ml，連接回流冷凝器，80℃±1℃水浴上回流，直至油滴消失。從回流冷凝器上端加入7ml15%三氟化硼甲醇溶液，在80℃±1℃水浴中繼續(xù)回流2min。用少量水沖洗回流冷凝器。停止加熱，從水浴上取下燒瓶，迅速冷卻至室溫。準(zhǔn)確加入10ml~30ml正庚烷，振搖2min，再加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層。吸取上層正庚烷提取液大約5ml，至25ml試管中，加入大約3g~5g無水硫酸鈉，振搖1min，靜置5min，吸取上層溶液到進(jìn)樣瓶中待測定。測定過程：色譜參考條件聚二氰丙基硅氧烷強(qiáng)極性固定相（柱長100m，內(nèi)徑0.25mm，膜厚0.2μm），進(jìn)樣器溫度270℃，檢測器溫度280℃，程序升溫from100℃（13min）to180℃（6min）at10℃/min，to200℃（20min）at1℃/min，to230℃（10.5min）at4℃/min，載氣為氮?dú)?，分流?00:1，進(jìn)樣體積1.0μl。上機(jī)操作時(shí)，分別將脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)測定液及試樣測定液分別注入氣相色譜儀，以色譜峰峰面積定量。該方法存在的問題有：1.三氟化硼甲醇溶液有14%、10%、15%等濃度，14%和15%較常用，其中三氟化硼與甲醇以1:1的比例絡(luò)合，而三氟化硼在甲酯化的過程起到催化劑的作用，單獨(dú)用甲醇在短時(shí)間內(nèi)無法甲酯化皂化脂肪酸，在脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化采用氫氧化鈉甲醇溶液-三氟化硼甲醇溶液體系，雖然縮短了部分脂肪酸甲酯化的時(shí)間，但三氟化硼存在毒性大、后續(xù)廢液處理等問題，且在操作過程中需要二次加液，給操作人員增加了不確定因素和安全隱患。2.色譜條件在實(shí)際測定種會因柱子廠家、填料或者不同儀器而有些許差別，且條件中未對載氣流速進(jìn)行說明，而在實(shí)際測定過程中，載氣流速的不同會直接影響幾個(gè)關(guān)鍵峰的分離效果。3.對37種脂肪酸甲酯目標(biāo)峰的定性研究是基于單個(gè)脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液和脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣并進(jìn)行匹配和核對，這種方式繁瑣且溶液量取工作量大，序列處理麻煩，且單標(biāo)溶液購買獲取困難，存儲要求嚴(yán)格，都可能影響后續(xù)樣品測定的準(zhǔn)確性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)問題，根據(jù)本發(fā)明方法測定的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的特點(diǎn)，采用的技術(shù)方案如下：一種同時(shí)測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中脂肪酸含量的方法，步驟如下：1)將待測特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品經(jīng)的樣品前處理后，備用；2)將經(jīng)過前處理的樣品以氣相色譜法進(jìn)行測定；色譜條件為：色譜柱：固定相為聚二氰丙基聚硅氧烷；載氣：氮?dú)?；載氣流速：0.4ml-0.6ml/min；進(jìn)樣口溫度：240℃-260℃；分流比：25-35:1-2；進(jìn)樣量：1.0μl；柱溫：初始溫度140℃，保持5分鐘，升溫速率3-5℃/min升溫至240℃，保持30分鐘；3）用fid檢測器；檢測脂肪酸甲酯的色譜峰面積。優(yōu)選地，所述的色譜條件為：色譜柱為：固定相為聚二氰丙基聚硅氧烷；載氣：氮?dú)?；載氣流速：0.5ml/min；進(jìn)樣口溫度：245-255℃；分流比：28-32:1；進(jìn)樣量：1.0μl；檢測器：fid檢測器；柱溫：初始溫度140℃，保持5分鐘，升溫速率3-5℃/min升溫至240℃，保持30分鐘。更優(yōu)選地，所述的色譜條件為：色譜柱為：固定相為聚二氰丙基聚硅氧烷；載氣：氮?dú)猓惠d氣流速：0.5ml/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；分流比：30:1；進(jìn)樣量：1.0μl；檢測器：fid檢測器；柱溫：初始溫度140℃，保持5分鐘，升溫速率4℃/min升溫至240℃，保持30分鐘。所述的前處理步驟如下：采用水解-提取法來進(jìn)行樣品前處理：精密量取1.0ml樣品放入25ml圓底燒瓶中，加8-12ml無水甲醇和0.1-0.8ml40-60g/l的強(qiáng)堿甲醇溶液，裝上回流冷凝器，通氮?dú)猓?0℃-90℃水浴鍋加熱30-60min，用水沖洗降溫后將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。用5-10ml正庚烷沖洗燒瓶后倒入分液漏斗，搖晃。加8-15ml200g/l氯化鈉溶液，劇烈搖晃分離，將有機(jī)層轉(zhuǎn)移至含有無水硫酸鈉的小瓶，靜置，過濾即得；混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液：取出適量脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)移至到10ml容量瓶中，用正庚烷稀釋定容，貯存于-10℃以下冰箱，有效期3個(gè)月。優(yōu)選地，所述的前處理?xiàng)l件為：精密量取1.0ml樣品放入25ml圓底燒瓶中，加8-12ml無水甲醇和0.1-0.3ml60g/l的強(qiáng)堿甲醇溶液，裝上回流冷凝器，通氮?dú)猓?8℃-85℃水浴鍋加熱30-40min，用水沖洗降溫后將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。用5-10ml正庚烷沖洗燒瓶后倒入分液漏斗，搖晃。加10-15ml200g/l氯化鈉溶液，劇烈搖晃分離，將有機(jī)層轉(zhuǎn)移至含有無水硫酸鈉的小瓶，靜置，過濾即得；混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液：取出適量脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)移至到10ml容量瓶中，用正庚烷稀釋定容，貯存于-10℃以下冰箱，有效期3個(gè)月。更優(yōu)選地，所述的前處理?xiàng)l件為：精密量取1.0ml樣品放入25ml圓底燒瓶中，加10ml無水甲醇和0.2ml60g/l的強(qiáng)堿甲醇溶液，裝上回流冷凝器，通氮?dú)猓?0℃水浴鍋加熱40min，用水沖洗降溫后將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。用5ml正庚烷沖洗燒瓶后倒入分液漏斗，搖晃。加10ml200g/l氯化鈉溶液，劇烈搖晃分離，將有機(jī)層轉(zhuǎn)移至含有無水硫酸鈉的小瓶，靜置，過濾即得；混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液：取出適量脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)移至到10ml容量瓶中，用正庚烷稀釋定容，貯存于-10℃以下冰箱，有效期3個(gè)月。優(yōu)選地，色譜條件中所述的色譜柱為cnwcd-2560色譜柱。優(yōu)選地，色譜條件中所述強(qiáng)堿甲醇溶液中的強(qiáng)堿為氫氧化鉀或氫氧化鈉。本發(fā)明的有益效果：現(xiàn)有前處理方法采用三氟化硼甲醇溶液，有14%、10%、15%等濃度，其中14%和15%較常用，三氟化硼與甲醇以1:1的比例絡(luò)合，三氟化硼在甲酯化的過程起到催化劑的作用，單獨(dú)用甲醇在短時(shí)間內(nèi)無法甲酯化皂化脂肪酸。本方法根據(jù)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的特點(diǎn)，采用無水甲醇-氫氧化鉀甲醇體系進(jìn)行脂化，后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下高溫加熱一定時(shí)間后，用正庚烷萃取沖洗，高濃度nacl溶液和無水硫酸鈉純化脫水后，進(jìn)行后續(xù)含量測定。本發(fā)明的前處理方法與現(xiàn)有國標(biāo)中的前處理方法（三氟化硼甲醇體系）相比，按照國標(biāo)中的前處理步驟所需的反應(yīng)時(shí)間為3h左右,本發(fā)明的前處理時(shí)間需約2h，縮短時(shí)間為1h。雖減少了前處理步驟，但結(jié)果卻較國標(biāo)方法好，部分脂肪酸甲酯的含量高于國標(biāo)方法。采用試劑種類少，毒性小，不需二次加液，安全可操作性高，有效的保護(hù)了操作人員，同時(shí)也保證了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性；另外本方法針對的測定樣品類型屬于特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品，組分組成和基底較普通食品復(fù)雜，蛋白質(zhì)含量高，且本方法測定樣品時(shí)，既可以對蛋白質(zhì)的進(jìn)行預(yù)沉淀，又保證了里面油脂的皂化和脂化過程順利進(jìn)行。本發(fā)明中的前處理方法流程簡便易行，耗時(shí)較短，樣品經(jīng)處理后，經(jīng)溶劑轉(zhuǎn)移定容進(jìn)行氣相色譜的測定。與國家標(biāo)準(zhǔn)中推薦參數(shù)相比，本發(fā)明的測定方法對測定過程中的氣相色譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，根據(jù)柱子類型、出峰時(shí)間調(diào)整了程序升溫的梯度，使其中待測的37種脂肪酸能夠到達(dá)很好的分離效果，并且保證了檢測效率，同時(shí)縮短了單針的運(yùn)行時(shí)間，適宜的參數(shù)對儀器也起到更好的維護(hù)作用，有效的降低了rsd值，保證試樣測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，測定數(shù)據(jù)真實(shí)穩(wěn)定可靠。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例對本
發(fā)明內(nèi)容進(jìn)一步說明，但下述內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。在不背離本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例1分別精密量取1.0ml特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品樣品impact及自制品各兩份，分別放入25ml圓底燒瓶中，加10ml無水甲醇和0.2ml60g/l氫氧化鉀甲醇溶液，裝上回流冷凝器，通氮?dú)猓?0℃水浴鍋加熱40min，用水沖洗降溫后將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。用5ml正庚烷沖洗燒瓶后倒入分液漏斗，搖晃。加10ml200g/l氯化鈉溶液，劇烈搖晃分離，將有機(jī)層轉(zhuǎn)移至含有無水硫酸鈉的小瓶，靜置，過濾即得?；旌现舅峒柞?biāo)準(zhǔn)溶液：取出適量脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)移至到10ml容量瓶中，用正庚烷稀釋定容，貯存于-10℃以下冰箱，有效期3個(gè)月。色譜條件：色譜柱：cnwcd-2560（100m×0.25mm×0.20μm）；載氣：氮?dú)猓惠d氣流速：0.5ml/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；分流比：30:1；進(jìn)樣量：1.0μl；檢測器：fid檢測器；柱溫：140℃（5min）to240℃（30min）at4℃/min。試樣溶液的測定分別準(zhǔn)確吸取1.0μl脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100ppm）及試樣測定次數(shù)不少于兩次，以色譜峰面積定量。試樣中各脂肪酸的含量計(jì)算xi=(asi×ffame-fai)/(∑astdi×ffame-fai)式中xi：試樣中某個(gè)脂肪酸占總脂肪酸的百分比，%；asi：試樣中測定液中各脂肪酸甲酯的峰面積；ffame-fai:各脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化為脂肪酸的換算系數(shù)；∑astdi：標(biāo)準(zhǔn)測定液中各脂肪酸甲酯的峰面積之和。以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果表示，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。本實(shí)施例針對impact樣品進(jìn)行含量測定，結(jié)果如下。經(jīng)過測定，以信噪比為10為定量限，結(jié)果如下：脂肪酸簡稱impact-1impact-2averagersd%自制品-1自制品-2averagersd%c4：06.586.266.423.527.257.857.555.62c6：01.851.941.8953.36----c8：017.718.5418.123.2819.618.519.054.08c10：013.914.2314.0651.6613.214.8148.08c11：0--------c12：00.1430.1560.14956.150.1420.160.1518.43c13：0--------c14：03.533.1273.32858.563.243.653.4458.42c14：1--------c15：00.3070.270.28859.07----c15：1--------c16：04.894.3694.62957.963.873.953.911.45c16：12.992.652.828.532.812.582.6956.03c17：00.2890.2580.27358.010.1810.1980.18956.34c17：10.1210.1060.11359.35----c18：02.492.72.5955.722.492.852.679.53c18：1n9t--------c18：1n9c12.714.613.659.8413.612.513.055.96c18：2n6t--------c18：2n6c14.813.0513.9258.89----c20：00.1390.1280.13355.83----c18：3n60.1230.1070.1159.84----c20：10.4540.4020.4288.590.3280.3750.35159.45c18：3n30.9630.8920.92755.410.8530.9010.8773.87c21：0--------c20：20.8750.9390.9074.990.5970.6670.6327.83c22：0--------c20：3n6--------c23：00.1050.09440.09977.52----c22：1--------c20：3n3--------c20：4n60.6730.6940.68352.170.5890.5820.58550.85c18：2n60.2940.2570.27559.500.1320.1440.1386.15c24：0--------epa9.088.8878.98351.525.274.925.0954.86c24：1n90.1430.1250.1349.50----dha7.966.937.4459.786.466.576.5151.19由上表可知，本發(fā)明的方法能夠快速準(zhǔn)確測出樣品中37種脂肪酸含量，方法穩(wěn)定性好（rsd均小于10%)，可操作性高，結(jié)果可信度高。由于現(xiàn)在國家對于特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中脂肪酸甲酯的各含量均沒有非常明確的含量要求，只有大體范圍，因此，本方法中為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，采用加標(biāo)回收率、重復(fù)性進(jìn)行方法驗(yàn)證。本實(shí)施例中，為了確認(rèn)本方法的可靠和準(zhǔn)確性，同時(shí)進(jìn)行了加標(biāo)回收率方法學(xué)驗(yàn)證部分了脂肪酸甲酯，加入方式為：取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入按照處方量的80%、100%和120%的單一脂肪酸甲酯對照溶液，分別平行制備3份，混勻后進(jìn)樣。結(jié)果如下：脂肪酸簡稱c4：0c8：0c10：0c18：1n9c18：2n6cc18：3n3epadha80%-192.1496.8794.16102.6595.1292.1491.4685.4680%-290.5798.0498.2101.2591.0293.0189.4190.2180%-389.3297.9593.2498.6592.1494.7392.2488.22100%-190.8492.5199.6199.6794.5590.1692.1190.47100%-290.9597.0291.2497.2399.3692.189.3485.14100%-388.4694.1392.5196.0194.594.8291.8986.34120%-192.8696.4794.7196.5793.2294.6490.1492.13120%-291.9295.2492.5898.0797.192.5892.8790.54120%-392.191.9598.3199.8693.2895.6190.1689.49平均回收率91.0295.5894.9598.8894.4893.3191.0788.67rsd%1.572.373.172.222.691.881.452.82通過上表結(jié)果可知，rsd%值均滿足小于10%要求，表明本發(fā)明方法的穩(wěn)定性較好，準(zhǔn)確度高。對比例1本對比例中分別采用本發(fā)明實(shí)施例1的前處理方法和國家標(biāo)準(zhǔn)中推薦的前處理方式進(jìn)行測定，色譜條件為本發(fā)明中實(shí)施例1條件，針對與實(shí)施例1中相同的impact樣品進(jìn)行含量測定，結(jié)果如下：脂肪酸簡稱impact-1impact-2averagersd%impact-1(國標(biāo)法）impact-2（國標(biāo)法）averagersd%c4：06.586.266.423.526.257.857.0516.05c6：01.851.941.8953.36----c8：017.718.5418.123.2819.618.519.054.08c10：013.914.2314.0651.6613.214.8148.08c11：0--------c12：00.1430.1560.14956.150.1420.160.1518.43c13：0--------c14：03.533.1273.32858.563.033.653.3413.13c14：1--------c15：00.3070.270.28859.07----c15：1--------c16：04.894.3694.62957.963.873.953.911.45c16：12.992.652.828.532.812.362.58512.31c17：00.2890.2580.27358.010.1810.1980.18956.34c17：10.1210.1060.11359.35----c18：02.492.72.5955.722.492.852.679.53c18：1n9t--------c18：1n9c12.714.613.659.8413.612.513.055.96c18：2n6t--------c18：2n6c14.813.0513.9258.89----c20：00.1390.1280.13355.83----c18：3n60.1230.1070.1159.84----c20：10.4540.4020.4288.590.3280.40.36413.99c18：3n30.9630.8920.92755.410.8530.9540.90357.90c21：0--------c20：20.8750.9390.9074.990.5970.6670.6327.83c22：0--------c20：3n6--------c23：00.1050.09440.09977.52----c22：1--------c20：3n3--------c20：4n60.6730.6940.68352.170.5890.5820.58550.85c18：2n60.2940.2570.27559.500.1230.2440.183546.63c24：0--------epa9.088.8878.98351.525.274.925.0954.86c24：1n90.1430.1250.1349.50----dha7.966.937.4459.785.466.576.01513.05結(jié)果顯示，經(jīng)過國標(biāo)方法測定的rsd%值總體高于本發(fā)明方法，有些含量少的脂肪酸甲酯甚至未被檢出，產(chǎn)生漏檢。本發(fā)明法前處理方法相對國標(biāo)操作步驟少，相對穩(wěn)定，結(jié)果可信度高。雖然前述內(nèi)容已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作出的不偏離本發(fā)明精神的修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁12