本發(fā)明主要涉及植物有效成份的提取、純化和含量測(cè)定的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種賽檸檬石榴皮中類黃酮檢測(cè)的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

石榴是新疆特色水果之一，石榴果實(shí)具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，含有豐富的碳水化合物、粗纖維、灰分元素，其中vc含量高達(dá)11mg/100g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蘋果和梨，同時(shí)石榴具有良好的抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、消食化積、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防癌癥、抗衰老、降血脂、延緩食品發(fā)生氧化、增強(qiáng)食欲和益壽延年等功效。石榴的這些藥用價(jià)值主要功效因子是黃酮類化合物，黃酮類化合物對(duì)人體有多種生理功能且不良反應(yīng)少，是一類安全可靠、成本低、來源廣的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有較大的開發(fā)和應(yīng)用前景。但石榴可食部分只占鮮石榴的40％，而賽檸檬石榴皮占石榴總重超過30％，所以將石榴副產(chǎn)物賽檸檬石榴皮開發(fā)再利用，具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

類黃酮又稱黃酮類化合物，是植物中提取出可食用小分子量多酚物質(zhì)的一類總稱，結(jié)構(gòu)以c6-c3-c6為母體，廣泛存在于水果、蔬菜、堅(jiān)果、種子和莖皮中，是植物體內(nèi)最重要的次生代謝產(chǎn)物之一，也是人類膳食不可缺少的組成部分，研究表明，類黃酮具有抑制癌細(xì)胞、抑制腫瘤、抗氧化、抗炎、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、抗病毒、抗菌等多種生理活性，是目前植物化學(xué)研究的熱點(diǎn)成分之一。

石榴新品種賽檸檬，是由新疆農(nóng)科院園藝所與和田地區(qū)策勒縣林業(yè)站于1999年對(duì)策勒縣石榴資源調(diào)查優(yōu)選而成，于2002年12月通過新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)作物品種登記委員會(huì)審定命名。該品種的主要特點(diǎn)是高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)，結(jié)果早，綜合園藝形狀好，適應(yīng)范圍較廣，適宜于塔里木盆地南疆的生態(tài)條件，可在和田和喀什地區(qū)栽培，由于該品種品質(zhì)好的特點(diǎn)，極具開發(fā)價(jià)值。

雖然石榴中的類黃酮研究開展較早，但已往對(duì)類黃酮研究主要集中在定性和總量測(cè)定方面，且都大量集中在石榴汁、石榴花、石榴葉方面。目前的類黃酮檢測(cè)方法對(duì)賽檸檬石榴皮中單種類黃酮的檢測(cè)受類黃酮純度影響較大、檢測(cè)準(zhǔn)確度和精確度較低，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，利用高效液相色譜法測(cè)定賽檸檬石榴皮中蘆丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和異鼠李素這5種類黃酮含量的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前類黃酮檢測(cè)方法對(duì)賽檸檬石榴皮中單種類黃酮的檢測(cè)受類黃酮純度影響較大、檢測(cè)準(zhǔn)確度和精確度較低，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，利用高效液相色譜法測(cè)定賽檸檬石榴皮中蘆丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和異鼠李素這5種類黃酮含量的研究尚未見相關(guān)報(bào)道的技術(shù)問題，本發(fā)明旨在于提供一種測(cè)定賽檸檬石榴皮中五種類黃酮的方法，提取過程確保了賽檸檬石榴皮提取的類黃酮得率，有效保證賽檸檬石榴皮提取的類黃酮純度，經(jīng)純化和利用高效液相色譜法測(cè)定賽檸檬石榴皮中蘆丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和異鼠李素這5種類黃酮含量，與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)比，得出一致色譜圖，通過計(jì)算分離度r>>1.5，雜質(zhì)無干擾，分離效果好，檢測(cè)時(shí)間短，在21min內(nèi)出峰完全，且方法可行性高，在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，各類線性關(guān)系好，決定系數(shù)均達(dá)0.999以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(rsd)分別為1.239％，1.428％，1.937％，1.677％，1.461％，回收率分別為95.7％，104.6％，101.1％，101.5％，127.9％，精密度rsd均小于3％，重復(fù)性和穩(wěn)定性rsd均小于2％，可行性高，對(duì)賽檸檬石榴副產(chǎn)物的進(jìn)一步開發(fā)提供有效的檢測(cè)手段，在植物深加工領(lǐng)域具有廣泛的實(shí)用性和開發(fā)價(jià)值。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:

本發(fā)明具體提供一種測(cè)定賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)的方法，具體采用以下技術(shù)步驟：

(1)黃酮類化合物的提?。簩①悪幟适衿は磧?，50℃-60℃下用鼓風(fēng)干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，過60目-100目篩；稱取1.000g賽檸檬石榴皮粉末置于250ml錐形瓶中，加24ml87％乙醇，56℃-62℃超聲30min-45min，超聲功率120w-150w，抽濾，溶解濾餅，再用24ml87％乙醇溶解超聲30min-45min，合并兩次濾液，減壓回收溶劑至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，棄去醚層，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作為提取液備用。

(2)純化：將提取液與d101大孔吸附樹脂以1：1-1：10的料液比g/ml、純化溫度為20℃-50℃，上柱ph值為1.0-5.0的條件下純化，用蒸餾水洗脫除雜后，用甲醇洗脫出黃酮類化合物，收集洗脫液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)hplc色譜條件測(cè)定：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確秤取蘆丁1.5mg、槲皮苷0.6mg、槲皮素4mg、山奈酚1.6mg、異鼠李素3mg；分別加入3ml、1.2ml、8ml、3.2ml、6ml甲醇溶解得到濃度為0.5mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)混合液，準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，其中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.0025mg/ml、0.006mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml，槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml、0.025mg/ml、0.03mg/ml，山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml，異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml，每次吸樣量為20μl，經(jīng)過高效液相色譜檢測(cè)，以峰面積為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

黃酮類化合物含量的測(cè)定：將步驟(2)純化后提取液過0.22μm有機(jī)膜，進(jìn)樣量20μl，用高效液相色譜儀檢測(cè)，色譜柱采用c18柱，流動(dòng)相為甲醇和甲酸，其比例范圍為40：60-60：40，甲醇的濃度為98％-100％，甲酸的濃度為0.2％-2％；流動(dòng)相經(jīng)0.45μm濾膜過濾，并經(jīng)超聲波脫氣，流速：0.5ml/min-1.0ml/min，進(jìn)樣量20μl，柱溫30℃-40℃，運(yùn)行5min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)采用280mm或320mm或360mm，將色譜圖積分后記錄峰面積，利用各自標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素的質(zhì)量濃度。

優(yōu)選的，本發(fā)明提供的純化步驟中料液比g/ml為1：2-1：10。

優(yōu)選的，本發(fā)明提供的純化步驟中上柱ph值為2.0-4.0。

優(yōu)選的，本發(fā)明提供的純化步驟中純化溫度為25℃-45℃。

優(yōu)選的，本發(fā)明提供的純化步驟中料液比g/ml為1：5，上柱ph值為4.0，純化溫度為30℃。

優(yōu)選的，本發(fā)明提供的黃酮類化合物的提取步驟中超聲溫度為59℃，超聲時(shí)間37.5min，超聲功率135w。

通過實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案，可以達(dá)到以下有益效果:

本發(fā)明提供的一種測(cè)定賽檸檬石榴皮中五種類黃酮的方法，提取過程確保了賽檸檬石榴皮提取的類黃酮得率，有效保證賽檸檬石榴皮提取的類黃酮純度，經(jīng)純化和利用高效液相色譜法測(cè)定賽檸檬石榴皮中蘆丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和異鼠李素這5種類黃酮含量，與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)比，得出一致色譜圖，通過計(jì)算分離度r>>1.5，雜質(zhì)無干擾，分離效果好，檢測(cè)時(shí)間短，在21min內(nèi)出峰完全，且方法可行性高，在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，各類線性關(guān)系好，決定系數(shù)均達(dá)0.999以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(rsd)分別為1.239％，1.428％，1.937％，1.677％，1.461％，回收率分別為95.7％，104.6％，101.1％，101.5％，127.9％，精密度rsd均小于3％，重復(fù)性和穩(wěn)定性rsd均小于2％，可行性高，對(duì)賽檸檬石榴副產(chǎn)物的進(jìn)一步開發(fā)提供有效的檢測(cè)手段，在植物深加工領(lǐng)域具有廣泛的實(shí)用性和開發(fā)價(jià)值。

附圖說明

圖1顯示為本發(fā)明提供的5種類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品hplc色譜圖。

圖2顯示為本發(fā)明提供的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

圖3顯示為本發(fā)明提供的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

圖4顯示為本發(fā)明提供的槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

圖5顯示為本發(fā)明提供的山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

圖6顯示為本發(fā)明提供的異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

圖7顯示為本發(fā)明提供的5種類黃酮樣品hplc色譜圖。

圖8顯示為本發(fā)明提供的柱液的ph值對(duì)樹脂靜態(tài)吸附量的影響圖。

圖9顯示為本發(fā)明提供的料液比對(duì)d-101大孔吸附樹脂吸附能力的影響圖。

圖10顯示為本發(fā)明提供的溫度樹脂靜態(tài)吸附量的影響圖。

具體實(shí)施方式

下面，舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例，本發(fā)明中，未經(jīng)說明的％為體積百分比。

本發(fā)明采用的賽檸檬石榴采集于新疆喀什市，采集時(shí)間為2015年10月，將樣品洗凈后取皮，剔除褐變及腐爛部分果皮，置于40℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干，用研磨機(jī)粉碎，過100目篩，置于干燥器中避光保存?zhèn)溆?。蘆丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚、異鼠李素(純度≥98％)，所有標(biāo)準(zhǔn)品為hplc級(jí)，購(gòu)買自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。d101大孔吸附樹脂，甲醇(色譜純)；甲酸(色譜純)，購(gòu)買自sigma公司。

本發(fā)明采用的設(shè)備有高效液相色譜儀：agilent1260，包括在線脫氣機(jī)，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，紫外檢測(cè)器，色譜工作站：色譜柱agilentporoshell120ec-c18柱(250mm×4.6mm，4μm)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(re1100-pro，scilogex)、恒溫電熱油浴鍋(df-101s,金壇市醫(yī)療儀器廠)、磁力攪拌機(jī)(rctbasic,ika)、超聲波清洗機(jī)(sk7200h，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)、研磨粉碎機(jī)(a11basic，ika)、均質(zhì)機(jī)(t10，ika)、萬分之一電子分析天平(ml204,mettlertdedo)、離心機(jī)(lxt-ⅱb,上海安亭科學(xué)儀器廠)、干燥箱(dzf-6050，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、攪拌機(jī)(hr1724，philips)、循環(huán)水式多用真空泵(shb-ⅲ，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、純水儀(akhl-ⅲ-24a，艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水儀)。

本發(fā)明中選用的所有材料、試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。

實(shí)施例一：測(cè)定賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)的方法

本發(fā)明具體提供一種測(cè)定賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)的方法，具體采用以下技術(shù)步驟：

(1)黃酮類化合物的提取：將賽檸檬石榴皮洗凈，50℃-60℃下用鼓風(fēng)干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，過60目-100目篩；稱取1.000g賽檸檬石榴皮粉末置于250ml錐形瓶中，加24ml87％乙醇，56℃-62℃超聲30min-45min，超聲功率120w-150w，抽濾，溶解濾餅，再用24ml87％乙醇溶解超聲30min-45min，合并兩次濾液，減壓回收溶劑至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，棄去醚層，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作為提取液備用。

(2)純化：將提取液與d101大孔吸附樹脂以1：1-1：10的料液比g/ml、純化溫度為20℃-50℃，上柱ph值為1.0-5.0的條件下純化，用蒸餾水洗脫除雜后，用甲醇洗脫出黃酮類化合物，收集洗脫液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)hplc色譜條件測(cè)定：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確秤取蘆丁1.5mg、槲皮苷0.6mg、槲皮素4mg、山奈酚1.6mg、異鼠李素3mg；分別加入3ml、1.2ml、8ml、3.2ml、6ml甲醇溶解得到濃度為0.5mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)混合液，準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，其中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.0025mg/ml、0.006mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml，槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml、0.025mg/ml、0.03mg/ml，山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml，異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.008mg/ml、0.012mg/ml、0.016mg/ml，每次吸樣量為20μl，經(jīng)過高效液相色譜檢測(cè)，以峰面積為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

黃酮類化合物含量的測(cè)定：將步驟(2)純化后提取液過0.22μm有機(jī)膜，進(jìn)樣量20μl，用高效液相色譜儀檢測(cè)，色譜柱采用c18柱，流動(dòng)相為甲醇和甲酸，其比例范圍為40：60-60：40，甲醇的濃度為98％-100％，甲酸的濃度為0.2％-2％；流動(dòng)相經(jīng)0.45μm濾膜過濾，并經(jīng)超聲波脫氣，流速：0.5ml/min-1.0ml/min，進(jìn)樣量20μl，柱溫30℃-40℃，運(yùn)行5min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)采用280mm或320mm或360mm，將色譜圖積分后記錄峰面積，利用各自標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素的質(zhì)量濃度。

實(shí)施例二：測(cè)定賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)的方法

將賽檸檬石榴皮洗凈，50℃下用鼓風(fēng)干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，過60目篩；稱取1.000g賽檸檬石榴皮粉末置于250ml錐形瓶中，加24ml87％乙醇，56℃超聲30min，超聲功率120w,抽濾，溶解濾餅，再用24ml87％乙醇溶解超聲30min，合并兩次濾液，減壓回收溶劑至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，棄去醚層，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作為提取液；將提取液與d101大孔吸附樹脂以1：1的料液比g/ml、純化溫度為20℃，上柱ph值為1.0的條件下純化，用蒸餾水洗脫除雜后，用甲醇洗脫出黃酮類化合物，收集洗脫液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，按照?shí)施例一提供的方法繪制5種類黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，將純化后提取液過0.22μm有機(jī)膜，進(jìn)樣量20μl，用高效液相色譜儀檢測(cè)，色譜柱采用c18柱，流動(dòng)相為甲醇和甲酸，其比例范圍為40：60，甲醇的濃度為98％，甲酸的濃度為0.2％；流動(dòng)相經(jīng)0.45μm濾膜過濾，并經(jīng)超聲波脫氣，流速：0.5ml/min，進(jìn)樣量20μl，柱溫30℃，運(yùn)行5min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)采用280mm，將色譜圖積分后記錄峰面積，利用各自標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素的質(zhì)量濃度。

實(shí)施例三：測(cè)定賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)的方法

將賽檸檬石榴皮洗凈，60℃下用鼓風(fēng)干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，過100目篩；稱取1.000g賽檸檬石榴皮粉末置于250ml錐形瓶中，加24ml87％乙醇，62℃超聲45min，超聲功率150w，抽濾，溶解濾餅，再用24ml87％乙醇溶解超聲45min，合并兩次濾液，減壓回收溶劑至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，棄去醚層，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作為提取液；將提取液與d101大孔吸附樹脂以1：10的料液比g/ml、純化溫度為50℃，上柱ph值為5.0的條件下純化，用蒸餾水洗脫除雜后，用甲醇洗脫出黃酮類化合物，收集洗脫液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫凑諏?shí)施例一提供的方法繪制5種類黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，將純化后提取液過0.22μm有機(jī)膜，進(jìn)樣量20μl，用高效液相色譜儀檢測(cè)，色譜柱采用c18柱，流動(dòng)相為甲醇和甲酸，其比例范圍為60：40，甲醇的濃度為100％，甲酸的濃度為2％；流動(dòng)相經(jīng)0.45μm濾膜過濾，并經(jīng)超聲波脫氣，流速：1.0ml/min，進(jìn)樣量20μl，柱溫40℃，運(yùn)行5min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)采用360mm，將色譜圖積分后記錄峰面積，利用各自標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素的質(zhì)量濃度。

實(shí)施例四：測(cè)定賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)的方法

將賽檸檬石榴皮洗凈，58℃下用鼓風(fēng)干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，過90目篩；稱取1.000g賽檸檬石榴皮粉末置于250ml錐形瓶中，加24ml87％乙醇，57℃超聲35min，超聲功率130w，抽濾，溶解濾餅，再用24ml87％乙醇溶解超聲41min，合并兩次濾液，減壓回收溶劑至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，棄去醚層，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作為提取液；將提取液與d101大孔吸附樹脂以1：2的料液比g/ml、純化溫度為25℃，上柱ph值為2.0的條件下純化，用蒸餾水洗脫除雜后，用甲醇洗脫出黃酮類化合物，收集洗脫液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，按照?shí)施例一提供的方法繪制5種類黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，將純化后提取液過0.22μm有機(jī)膜，進(jìn)樣量20μl，用高效液相色譜儀檢測(cè)，色譜柱采用c18柱，流動(dòng)相為甲醇和甲酸，其比例范圍為50：60，甲醇的濃度為100％，甲酸的濃度為1.8％；流動(dòng)相經(jīng)0.45μm濾膜過濾，并經(jīng)超聲波脫氣，流速：0.7ml/min，進(jìn)樣量20μl，柱溫35℃，運(yùn)行5min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)采用320mm，將色譜圖積分后記錄峰面積，利用各自標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素的質(zhì)量濃度。

實(shí)施例五：測(cè)定賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)的方法

將賽檸檬石榴皮洗凈，55℃下用鼓風(fēng)干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，過80目篩；稱取1.000g賽檸檬石榴皮粉末置于250ml錐形瓶中，加24ml87％乙醇，61℃超聲42min，超聲功率140w，抽濾，溶解濾餅，再用24ml87％乙醇溶解超聲32min，合并兩次濾液，減壓回收溶劑至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，棄去醚層，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作為提取液；將提取液與d101大孔吸附樹脂以1：5的料液比g/ml、純化溫度為45℃，上柱ph值為4.0的條件下純化，用蒸餾水洗脫除雜后，用甲醇洗脫出黃酮類化合物，收集洗脫液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，按照?shí)施例一提供的方法繪制5種類黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，將純化后提取液過0.22μm有機(jī)膜，進(jìn)樣量20μl，用高效液相色譜儀檢測(cè)，色譜柱采用c18柱，流動(dòng)相為甲醇和甲酸，其比例范圍為70：60，甲醇的濃度為98％，甲酸的濃度為1.2％；流動(dòng)相經(jīng)0.45μm濾膜過濾，并經(jīng)超聲波脫氣，流速：0.9ml/min，進(jìn)樣量20μl，柱溫32℃，運(yùn)行5min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)采用360mm，將色譜圖積分后記錄峰面積，利用各自標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素的質(zhì)量濃度。

實(shí)施例六：測(cè)定賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)的方法

將賽檸檬石榴皮洗凈，52℃下用鼓風(fēng)干燥箱干燥至含水量小于8％，粉碎，過70目篩；稱取1.000g賽檸檬石榴皮粉末置于250ml錐形瓶中，加24ml87％乙醇，59℃超聲40min，超聲功率135w，抽濾，溶解濾餅，再用24ml87％乙醇溶解超聲37min，合并兩次濾液，減壓回收溶劑至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，棄去醚層，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作為提取液；將提取液與d101大孔吸附樹脂以1：7的料液比g/ml、純化溫度為35℃，上柱ph值為3.0的條件下純化，用蒸餾水洗脫除雜后，用甲醇洗脫出黃酮類化合物，收集洗脫液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，按照?shí)施例一提供的方法繪制5種類黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，將純化后提取液過0.22μm有機(jī)膜，進(jìn)樣量20μl，用高效液相色譜儀檢測(cè)，色譜柱采用c18柱，流動(dòng)相為甲醇和甲酸，其比例范圍為50：40，甲醇的濃度為98％，甲酸的濃度為0.8％；流動(dòng)相經(jīng)0.45μm濾膜過濾，并經(jīng)超聲波脫氣，流速：0.6ml/min，進(jìn)樣量20μl，柱溫38℃，運(yùn)行5min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)采用280mm，將色譜圖積分后記錄峰面積，利用各自標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素的質(zhì)量濃度。

實(shí)施例七：5種類黃酮物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

附圖1為5種類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品hplc色譜圖。準(zhǔn)確秤取蘆丁1.5mg、槲皮苷0.6mg、槲皮素4mg、山奈酚1.6mg、異鼠李素3mg；分別加入3ml、1.2ml、8ml、3.2ml、6ml甲醇溶解得到濃度為0.5mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)混合液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成不同質(zhì)量濃度的溶液(0.05mg/ml、0.04mg/ml、0.03mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml)每次吸樣量為20μl，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別依次參見附圖2、3、4、5、6。

由附圖2得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝2.83870*10-9x-0.000151643相關(guān)系數(shù)0.9990。

由附圖3得到槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝3.313960*10-9x-0.000141678相關(guān)系數(shù)0.9991。

由附圖4得到槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝2.127470*10-9x+0.000352118相關(guān)系數(shù)0.9991。

由附圖5得到山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝1.310520*10-9x+0.000220729相關(guān)系數(shù)0.9994。

由附圖6得到異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝2.404460*10-9x+0.000121731相關(guān)系數(shù)0.9997。

表明對(duì)蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素在一定濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與樣品量成線性關(guān)系。附圖7為5種類黃酮樣品hplc色譜圖。采用樣品加標(biāo)回收，準(zhǔn)確稱取5種類黃酮含量已知的賽檸檬石榴皮粉末、6份，分別向其中定量添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按色譜條件進(jìn)樣20μl，根據(jù)測(cè)定結(jié)果中5種單體黃酮的含量計(jì)算相應(yīng)的回收率，結(jié)果為未加標(biāo)樣品濃度分別為：0.0032mg/ml，0.0294mg/ml，0.0004mg/ml，0.0002mg/ml，0.0001mg/ml；加標(biāo)量濃度為：0.0075mg/ml，0.0025mg/ml，0.004mg/ml，0.004mg/ml，0.004mg/ml；加標(biāo)后樣品濃度分別為：0.0096mg/ml，0.1065mg/ml，0.0046mg/ml，0.0034mg/ml，0.0.37mg/ml。使用以下公式對(duì)加標(biāo)回收率進(jìn)行計(jì)算：加標(biāo)回收率＝(加標(biāo)試樣測(cè)定值-試樣測(cè)定值)÷加標(biāo)量×100％；加標(biāo)回收率為：95.7％，104.6％，101.1％，101.5％，127.9％，分離度r>>1.5(r＝2(tr2-tr1)/(y1+y2)，其中，tr表示保留時(shí)間，y表示峰寬)，精密度對(duì)應(yīng)rsd為1.25％，1.19％，1.80％，0.82％，0.19％，重復(fù)性對(duì)應(yīng)rsd為0.99％，1.20％，0.87％，1.86％，1.32％，穩(wěn)定性對(duì)應(yīng)rsd為0.45％，0.63％，1.23％，1.02％，1.34％。

實(shí)施例八：測(cè)定賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)的方法的優(yōu)化

分別采用如下不同的方案測(cè)定賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)：

方案1：超聲溫度56℃，超聲時(shí)間30min，超聲功率120w，料液比1:1，g/ml，純化溫度20℃，上柱ph值1.0。

方案2：超聲溫度62℃，超聲時(shí)間45min，超聲功率150w，料液比1:10，g/ml，純化溫度50℃，上柱ph值5.0。

方案3：超聲溫度57℃，超聲時(shí)間35min，超聲功率130w，料液比1:2，g/ml，純化溫度25℃，上柱ph值2.0。

方案4：超聲溫度61℃，超聲時(shí)間42min，超聲功率140w，料液比1:5，g/ml，純化溫度45℃，上柱ph值4.0。

方案5：超聲溫度59℃，超聲時(shí)間40min，超聲功率135w，料液比1:7，g/ml，純化溫度35℃，上柱ph值3.0。

將上述提供的五個(gè)不同方案分別按照實(shí)施例一提供的方法測(cè)定賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)：

1.正交優(yōu)化賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)測(cè)定方法

設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，分別探究a：超聲溫度、b：超聲時(shí)間和c：超聲功率對(duì)賽檸檬石榴皮中黃酮類化合物提取率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1：正交試驗(yàn)因素與水平表

正交優(yōu)化賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)測(cè)定方法試驗(yàn)結(jié)果及分析見表2。

表2：正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

通過比較各指標(biāo)的極差，各影響因素主次順序?yàn)?，即為賽檸檬石榴皮?種類黃酮物質(zhì)測(cè)定方法主要影響因素是超聲溫度，其次是超聲時(shí)間和超聲功率，根據(jù)表2中各指標(biāo)的k1、k2和k3值及趨勢(shì)圖的結(jié)果，確定各因素最佳水平組合為，即賽檸檬石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)測(cè)定方法為：超聲溫度56℃-62℃，超聲時(shí)間30min-45min,超聲功率120w-150w；優(yōu)選的，超聲溫度59℃，超聲時(shí)間37.5min,超聲功率135w。

2.提取物純化的影響因素優(yōu)選：

1)柱液的ph值對(duì)樹脂靜態(tài)吸附量的影響

分別取100ml濃度為2g/l的黃酮溶液，調(diào)節(jié)不同ph值，加入5g預(yù)處理好的濕樹脂，靜態(tài)吸附10h，測(cè)定樹脂靜態(tài)吸附量，考察不同ph值對(duì)類黃酮溶液的影響，參考說明書附圖8，結(jié)果表明ph值為4.0最佳。

2)料液比對(duì)d-101大孔吸附樹脂吸附能力的影響

定量稱取處理過的干樹脂2.00g，裝入6只100ml具塞錐形瓶中，按吸附料液比為1:2，1:5，1:10，1:15，1:20，1:25(黃酮類物質(zhì)溶液：大孔吸附樹脂，mg/l)依次加入黃酮類物質(zhì)(ph值為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證最佳值)，恒溫振蕩(30℃，轉(zhuǎn)速為150r/min)24h，過濾去濾液，測(cè)出濾液中黃酮類物質(zhì)的含量，計(jì)算吸附率，參考說明書附圖9，比較得到最佳料液比為1：5最佳。

3)溫度對(duì)樹脂靜態(tài)吸附量的影響

取2g/l的黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液各100ml，加入5g已預(yù)處理好的濕樹脂，控制溫度為25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，靜態(tài)吸附(搖床振蕩)10h，測(cè)定樹脂靜態(tài)吸附量，考察溫度對(duì)類黃酮溶液的影響，參考說明書附圖10，結(jié)果表明溫度為30℃最佳。

綜上所述本發(fā)明提供的一種測(cè)定賽檸檬石榴皮中五種類黃酮的方法，提取過程確保了賽檸檬石榴皮提取的類黃酮得率，有效保證賽檸檬石榴皮提取的類黃酮純度，經(jīng)純化和利用高效液相色譜法測(cè)定賽檸檬石榴皮中蘆丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和異鼠李素這5種類黃酮含量，與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)比，得出一致色譜圖，通過計(jì)算分離度r>>1.5，雜質(zhì)無干擾，分離效果好，檢測(cè)時(shí)間短，在21min內(nèi)出峰完全，且方法可行性高，在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，各類線性關(guān)系好，決定系數(shù)均達(dá)0.999以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(rsd)分別為1.239％，1.428％，1.937％，1.677％，1.461％，回收率分別為95.7％，104.6％，101.1％，101.5％，127.9％，精密度rsd均小于3％，重復(fù)性和穩(wěn)定性rsd均小于2％，可行性高，對(duì)賽檸檬石榴副產(chǎn)物的進(jìn)一步開發(fā)提供有效的檢測(cè)手段，在植物深加工領(lǐng)域具有廣泛的實(shí)用性和開發(fā)價(jià)值。

如上所述，即可較好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明,上述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種改變和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明確定的保護(hù)范圍內(nèi)。