本發(fā)明屬于藥物分析技術領域，具體涉及一種側(cè)柏葉tlc快速鑒別方法。

背景技術：

側(cè)柏葉又名柏葉、叢柏葉、扁柏、云片柏等，是醫(yī)家所重視的治血良藥。中醫(yī)認為側(cè)柏葉味苦，性微寒，無毒，入心、肝、大腸經(jīng)。具有涼血、止血、祛內(nèi)濕、散腫毒之功?？芍瓮卵⒈浅鲅?、尿血、血痢、崩漏、風濕痛、咳嗽、燙傷等癥。根據(jù)科學研究表明，側(cè)柏葉含大量的揮發(fā)油，油中主要成分為側(cè)柏烯、小茴香酮等，葉中還含有鉀、鈉、磷、氮、鈣、鎂、錳和鋅等多種微量元素。藥理實驗表明，側(cè)柏葉煎劑能夠明顯的縮短出血時間及凝血時間，除此以外，還有鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、鎮(zhèn)靜等作用。相關實驗表明，側(cè)柏葉對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、卡他球菌、白喉桿菌、傷寒桿菌等均有很好的抑制作用，有烏須發(fā)、止血、止咳喘的功效。

目前，對中藥材的理化鑒別方法，主要包括熒光法，微量升華法，顯色，沉淀、泡沫反應，鈣鹽、鈉鹽等鑒別反應，薄層色譜法（tlc）等。其中，由于tlc法處理簡單，成本低，可同時對多個成分進行比較，不需使用復雜儀器，應用范圍最為廣泛。如現(xiàn)行2015年版中國藥典側(cè)柏葉項下收載了法定的側(cè)柏葉tlc鑒別方法，但由于該法中采用的索氏提取步驟，至少需6小時，加熱回流步驟也需要1小時，實際操作過程中存在操作步驟繁瑣，操作時間長、有機試劑用量多導致成本較高等缺點，無法滿足實際應用中快速、簡便的需求。因此，建立一種快速、準確，高效的側(cè)柏葉tlc鑒別方法是很有必要的。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中存在的上述問題，提供一種側(cè)柏葉tlc快速鑒別方法，具有操作簡單、快速、準確，高效、成本低廉、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，可用于對側(cè)柏葉藥材及飲片質(zhì)量快速檢測。

本發(fā)明技術方案如下：

一種側(cè)柏葉tlc快速鑒別方法，步驟包括：

（1）取待測樣品粉末2～4g，加水20～30ml，加鹽酸2～4ml，加乙酸乙酯30～50ml，水浴加熱回流水解20～40min，趁熱濾過，濾液置分液漏斗，分液，取乙酸乙酯層，水洗3次，每次10ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇4～6ml溶解，作為供試品溶液；

（2）另取槲皮素標準品，加乙醇配制為0.05～0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液；

（3）薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液和對照品溶液各2～4μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，以體積比為（4:2:1）～（6:2:1）的甲苯-乙酸乙酯-甲酸的上層溶液為展開劑展開，取出，晾干，噴以1wt％的三氯化鋁-乙醇溶液，置紫外光燈365nm下檢視。

優(yōu)選地，步驟（1）中，各原料用量為待測樣品粉末3g、水25ml、鹽酸3ml、乙酸乙酯40ml、甲醇5ml。

優(yōu)選地，步驟（1）中，水浴加熱回流水解30min。

優(yōu)選地，步驟（2）中，加乙醇配制為0.1mg/ml的溶液。

優(yōu)選地，步驟（3）中，吸取供試品溶液和對照品溶液各3μl，甲苯-乙酸乙酯-甲酸的體積比為5:2:1。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述的薄層色譜法試驗為2015年版中國藥典四部0502薄層色譜法。

所述側(cè)柏葉tlc快速鑒別方法，供試品色譜中，在與對照品色譜相對應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，則待測樣品為側(cè)柏葉。

側(cè)柏葉的止血有效成分通常認為是槲皮素和鞣質(zhì)，實際上，本發(fā)明通過實驗表明側(cè)柏葉中沒有槲皮素，只有槲皮苷，現(xiàn)有檢測方法中，也都是將槲皮苷水解成槲皮素后進行鑒定?，F(xiàn)有技術中，以藥典收載的側(cè)柏葉tlc鑒別方法為例，是將側(cè)柏葉中所含葉綠素成分進行提取后，再對其所含黃酮類成分槲皮苷進行酸水解，水解成槲皮素，再用乙酸乙酯萃取，水洗，濃縮后進行鑒定。由于其樣品制備過程涉及索氏提取，耗時至少6h，且以乙醚為提取液，操作具一定的危險性和不適性，黃酮類成分提取、水解共計耗時1.5h。本發(fā)明方法將黃酮類成分提取和水解步驟合并，直接用水、鹽酸、乙酸乙酯加熱回流提取樣品，不需要索氏提取等步驟，只需30min，亦能將槲皮苷水解成槲皮素，加之葉綠素成分的存在，使得tlc圖譜中反映的樣品的信息量較藥典法更為詳細，效果更好，因此本發(fā)明方法更適合于側(cè)柏葉的tlc鑒定。

本發(fā)明技術方案相對于現(xiàn)有技術有益效果為：

1、高效、便捷、重現(xiàn)性好：①節(jié)約時間：該法較藥典法省去藥典中索氏提取（至少6h）、加熱回流1h的步驟，整體可將鑒定時間縮短4/5。②節(jié)省試劑：上述步驟中的有機試劑均可節(jié)省，尤其是減少了乙醚的使用，減少操作過程的不適性和危險性。③重現(xiàn)性好：該法相對簡單、易操作，具有較強的專屬性和良好的重現(xiàn)性。

2、色譜清晰，各斑點分離良好：色譜圖斑點清晰，信息量大，供試品色譜中各斑點分離好，重現(xiàn)性好。用該方法鑒別側(cè)柏葉，快速、準確，高效。

附圖說明

圖1為實施例1側(cè)柏葉tlc鑒別圖譜，圖中1-4,6-9均為側(cè)柏葉，5-槲皮素對照品；

圖2為實施例2側(cè)柏葉tlc鑒別圖譜，圖中1-4,6-9均為側(cè)柏葉，5-槲皮素對照品；

圖3為實施例3側(cè)柏葉tlc鑒別圖譜，圖中1-4,6-9均為側(cè)柏葉，5-槲皮素對照品；

圖4為對比例1側(cè)柏葉tlc鑒別圖譜，圖中1-5,7-10均為側(cè)柏葉，6-槲皮素對照品；

圖5為對比例2側(cè)柏葉tlc鑒別圖譜，圖中1-4,6-9均為側(cè)柏葉，5-槲皮素對照品；

圖6為對比例3側(cè)柏葉tlc鑒別圖譜，圖中1-4,6-9均為側(cè)柏葉，5-槲皮素對照品。

具體實施方式

下面通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明方案及有益效果。

實施例1

一種側(cè)柏葉tlc快速鑒別方法，步驟包括：

（1）取待測樣品粉末3g，加水25ml，加鹽酸3ml，加乙酸乙酯40ml，水浴加熱回流水解30min，趁熱濾過，濾液置分液漏斗，分液，取乙酸乙酯層，水洗3次，每次10ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇5ml溶解，作為供試品溶液；

（2）另取槲皮素標準品，加乙醇配制為0.1mg/ml的溶液，作為對照品溶液；

（3）照2015年版中國藥典四部0502薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液和對照品溶液各3μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，以體積比為5:2:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸的上層溶液為展開劑展開，取出，晾干，噴以1wt％的三氯化鋁-乙醇溶液，置紫外光燈365nm下檢視。

供試品色譜中，在與對照品色譜相對應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，tlc薄層圖譜見圖1，待測樣品為側(cè)柏葉。由圖1可見，8批側(cè)柏葉中均檢出槲皮素，且斑點清晰，分離度良好。

實施例2

一種側(cè)柏葉tlc快速鑒別方法，步驟包括：

（1）取待測樣品粉末2g，加水20ml，加鹽酸2ml，加乙酸乙酯30ml，水浴加熱回流水解20min，趁熱濾過，濾液置分液漏斗，分液，取乙酸乙酯層，水洗3次，每次10ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇4ml溶解，作為供試品溶液；

（2）另取槲皮素標準品，加乙醇配制為0.05mg/ml的溶液，作為對照品溶液；

（3）照2015年版中國藥典四部0502薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液和對照品溶液各2μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，以體積比為4:2:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸的上層溶液為展開劑展開，取出，晾干，噴以1wt％的三氯化鋁-乙醇溶液，置紫外光燈365nm下檢視。

供試品色譜中，在與對照品色譜相對應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，tlc薄層圖譜見圖1，待測樣品為側(cè)柏葉。由圖2可見，8批側(cè)柏葉中均檢出槲皮素，且斑點清晰，分離度良好。

實施例3

一種側(cè)柏葉tlc快速鑒別方法，步驟包括：

（1）取待測樣品粉末4g，加水30ml，加鹽酸4ml，加乙酸乙酯50ml，水浴加熱回流水解40min，趁熱濾過，濾液置分液漏斗，分液，取乙酸乙酯層，水洗3次，每次10ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇6ml溶解，作為供試品溶液；

（2）另取槲皮素標準品，加乙醇配制為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液；

（3）照2015年版中國藥典四部0502薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液和對照品溶液各3μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，以體積比為6:2:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸的上層溶液為展開劑展開，取出，晾干，噴以1wt％的三氯化鋁-乙醇溶液，置紫外光燈365nm下檢視。

供試品色譜中，在與對照品色譜相對應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，tlc薄層圖譜見圖1，待測樣品為側(cè)柏葉。由圖3可見，8批側(cè)柏葉中均檢出槲皮素，且斑點清晰，分離度良好。

對比例1：2015版中國藥典

取樣品（同實施例1）粉末3g，置索氏提取器中，加乙醚適量，加熱，回流至提取液無色，棄去乙醚液，藥渣揮干乙醚，加70％乙醇50ml，加熱回流1小時，趁熱濾過，濾液蒸干，殘渣加水25ml使溶解，加鹽酸3ml，加熱水解30分鐘，立即冷卻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，用水洗滌3次，每次10ml。水浴蒸干，殘渣加甲醇5ml溶解作為供試品溶液。另取槲皮素對照品，加乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2015年版中國藥典四部通則0502）試驗，吸取上述供試品溶液和對照品溶液3μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:2:1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1wt％三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。tlc薄層圖譜見圖4。由圖4可見，9批側(cè)柏葉中均檢出槲皮素，斑點清晰，分離度良好。

對比例2

取樣品（同實施例1）粉末3g，加水25ml加鹽酸3ml，加熱水解30分鐘，立即冷卻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，用水洗滌3次，每次10ml。水浴蒸干，殘渣加甲醇5ml溶解作為供試品溶液。另取槲皮素對照品，加乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2015年版中國藥典四部通則0502）試驗，吸取上述供試品溶液和對照品溶液3μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:2:1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1wt％三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。tlc薄層圖譜見圖5。由圖5可見，8批側(cè)柏葉中對應槲皮素處，斑點清晰，但頂端葉綠素斑點未檢出。

對比例3

將步驟（1）乙酸乙酯替換為石油醚，其余步驟同實施例1；tlc薄層圖譜見圖6。由圖6可見，9批側(cè)柏葉相應位置未檢出任何斑點，僅檢出槲皮素對照品斑點。

結(jié)果分析

由實施例1-3可見，本發(fā)明方法快速、簡便、耗時短，易操作，受影響因素小，重現(xiàn)性好。采用hplc法對本發(fā)明方法進行驗證發(fā)現(xiàn)，本方法可快速實現(xiàn)側(cè)柏葉中槲皮苷的水解過程中對水解產(chǎn)物槲皮素成分的有效富集，因此可用于側(cè)柏葉的tlc鑒定。

實施例及對比例結(jié)果分析：本發(fā)明方法與現(xiàn)有的藥典等其他方法比較可見，并未影響槲皮素的鑒別，且本發(fā)明方法的斑點更為清晰，信息量大（與藥典法比較，色譜圖中rf值較小的斑點為側(cè)柏葉中葉綠素類成分），專屬性強，分離良好，因此本發(fā)明方法具有現(xiàn)有側(cè)柏葉鑒別方法不可比擬的突出優(yōu)點，可用于替代現(xiàn)行藥典法等用于側(cè)柏葉的tlc鑒別。