本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)甲狀腺癌的方法，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)甲狀腺癌。

背景技術(shù)：

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，傳統(tǒng)上分為甲狀腺分化性癌、甲狀腺未分化癌和甲狀腺髓樣癌，分化性癌又分為乳頭狀癌和濾泡型腺癌，甲狀腺未分化癌比較少見(jiàn)且預(yù)后極差，甲狀腺髓樣癌來(lái)源于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞(c細(xì)胞)，屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的一種，在多發(fā)性2型內(nèi)分泌瘤中約25％的患者伴有甲狀腺髓樣癌。近年來(lái)，我國(guó)甲狀腺癌高發(fā)，已成為增長(zhǎng)速度最快的惡性腫瘤，發(fā)病率10年增長(zhǎng)了近5倍。甲狀腺癌尤其好發(fā)于中青年女性，女性和男性比例為3：1，已成近20年來(lái)我國(guó)癌癥譜中女性惡性腫瘤上升速度最快的腫瘤。如今在一、二線城市的女性群體中，該病發(fā)病率基本位列三甲，有的甚至已躍居榜首。

目前，確診甲狀腺癌的主要手段主要是甲狀腺細(xì)胞穿刺、術(shù)中病理冰凍及術(shù)后石蠟病理切片，甲狀腺細(xì)胞穿刺雖然能達(dá)到確診的意義，但由于陽(yáng)性率低而限制了它在臨床上的推廣，所以臨床實(shí)際確診甲狀腺癌的方法主要還是依靠術(shù)中冰凍或術(shù)后石蠟切片。除此之外，在甲狀腺癌血清學(xué)方面，雖然對(duì)甲狀腺癌腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)展的很快，但至今還沒(méi)有一種在臨床上得到一致的認(rèn)可，說(shuō)明對(duì)甲狀腺癌腫瘤標(biāo)志物的研究仍然處于初步階段，值得進(jìn)一步發(fā)展。

研究表明，脂質(zhì)代謝與組織病變有非常直接的聯(lián)系，也包括甲狀腺機(jī)能紊亂。目前，通過(guò)核磁共振，maldi/ms或者gc/ms，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)少許與甲狀腺癌相關(guān)的脂質(zhì)。其中，對(duì)脂肪酸的研究表明，良性甲狀腺瘤的患者c14:0,c16:1n7,c18:1n9,c20:1n9,c18:3n3顯著降低，c16:0,c20:3n6,c20:4n6，c22:6n3顯著升高；惡性腫瘤患者表現(xiàn)出c14:0,c16:0，c18:3n3升高，而c20:3n6降低的趨勢(shì)。另外，也有研究利用數(shù)學(xué)模型結(jié)合脂質(zhì)組學(xué)，開(kāi)始尋找腫瘤標(biāo)志物。他們利用pls-da模型，發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)醇，膽固醇，膽堿以及27種脂肪酸，在甲狀腺癌良性和惡性人群中，體現(xiàn)明顯的差異。

但是，目前為止，還沒(méi)有出現(xiàn)能夠利用這些標(biāo)志物準(zhǔn)確預(yù)測(cè)甲狀腺癌的預(yù)測(cè)模型，尤其是針對(duì)中國(guó)人群的甲狀腺癌預(yù)測(cè)模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)甲狀腺癌的方法，能夠快捷、準(zhǔn)確、高效地預(yù)測(cè)甲狀腺癌。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種針對(duì)中國(guó)人群的利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)甲狀腺癌的方法。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一組針對(duì)中國(guó)人群的與甲狀腺癌密切相關(guān)的化合物。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了以下技術(shù)方案：

一種利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)甲狀腺癌的方法，其中，主要包括以下步驟：

步驟1、篩選出正常人組群和甲狀腺癌組群之間的差異性化合物r1-r9，分別為：

r1:pg(17:0/14:1)；

r2:ps(o-20:0/18:1)；

r3:pc(16:0/18:2)；

r4:bacteriohopane-,32,33,34-triol-35-cyclitolguanine；

r5:pc(16:0/20:4)；

r6:tg(16:0/16:1/20:2)；

r7:pc(16:0/18:1)；

r8:ps(o-18:0/17:0)；

r9:ps(p-18:0/22:2)；

步驟2、利用邏輯回歸模型3進(jìn)行計(jì)算，得到tc值，所述邏輯回歸模型3的計(jì)算公式為：

tc＝1.8002-2.2815*r1-2.3474*r4+2.8573*r9；

步驟3、根據(jù)所得tc值進(jìn)行判斷，tc＝0為否；tc＝1為是。

優(yōu)選的是，步驟1中利用opls-da模型對(duì)差異性化合物進(jìn)行篩選，然后將vip>1的排名前9位變量的數(shù)據(jù)提取出來(lái)即得r1-r9。

優(yōu)選的是，步驟1中篩選的具體方法為：

步驟1.1將樣品進(jìn)行超高效液相色譜和質(zhì)譜分析，得到脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，將正常人組群和甲狀腺癌組群分別計(jì)為ck及jc；

步驟1.2對(duì)脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作，利用opls-da模型對(duì)ck及jc進(jìn)行s-plot分布得到s形曲線，并進(jìn)行強(qiáng)制分組，計(jì)算影響ck及jc分組的變量重要性，即得vip值；

步驟1.3按照vip值大于5的標(biāo)準(zhǔn)得到15個(gè)化合物，并將該15個(gè)化合物作為與甲狀腺癌相關(guān)度最高的差異性化合物；

步驟1.4將所得15個(gè)化合物按照vip值大小從高到低排列，取前9位，即得步驟1中所述差異性化合物ri-r9。

優(yōu)選的是，步驟2中tc值或者用邏輯回歸模型2進(jìn)行計(jì)算，所述邏輯回歸模型2的計(jì)算公式為：

tc＝1.6361-12.5962*r+0.4081*r2-0.962*r3-1.7675*r4+0.7317*r5-7.3848*r6+15.9658*r7+0.494*r8+2.5964*r9。

優(yōu)選的是，步驟2中tc值或者用邏輯回歸模型1進(jìn)行計(jì)算，所述邏輯回歸模型1的計(jì)算公式為：

tc＝1.6054-13.4331*r1-2.4503*r4+0.9397*r5+9.5919*r7+3.3108*r9。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

本發(fā)明通過(guò)篩選，首次發(fā)現(xiàn)與甲狀腺癌相關(guān)的一組化合物，即與甲狀腺癌相關(guān)的脂質(zhì)生物標(biāo)志物，并通過(guò)構(gòu)建邏輯回歸模型，得到根據(jù)這些脂質(zhì)標(biāo)志物預(yù)測(cè)甲狀腺癌的方法，快捷方便，準(zhǔn)確度高。通過(guò)aic值初步判斷，并進(jìn)行roc曲線繪制，auc值達(dá)到0.872。

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中所述的opls-da模型的s-plot分布圖；

圖2為本發(fā)明中利用opls-da模型對(duì)ck和jc進(jìn)行強(qiáng)制分組的結(jié)果；

圖3為本發(fā)明中用來(lái)考察篩選出的化合物的火山圖；

圖4為本發(fā)明中roc曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語(yǔ)并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。

一種利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)甲狀腺癌的方法，其中，主要包括以下步驟：

步驟1、篩選出正常人組群和甲狀腺癌組群之間的差異性化合物r1-r9，分別為：

r1:pg(17:0/14:1)；

r2:ps(o-20:0/18:1)；

r3:pc(16:0/18:2)；

r4:bacteriohopane-,32,33,34-triol-35-cyclitolguanine；

r5:pc(16:0/20:4)；

r6:tg(16:0/16:1/20:2)；

r7:pc(16:0/18:1)；

r8:ps(o-18:0/17:0)；

r9:ps(p-18:0/22:2)。

步驟2、利用邏輯回歸模型1進(jìn)行計(jì)算，得到tc值，所述邏輯回歸模型3的計(jì)算公式為：

tc＝1.8002-2.2815*r1-2.3474*r4+2.8573*r9；

經(jīng)過(guò)roc曲線繪制，模型3的auc值為0.872，準(zhǔn)確度高達(dá)87.2％。

步驟3、根據(jù)所得tc值進(jìn)行判斷，tc＝0為否；tc＝1為是。r1-r9均為檢測(cè)樣品中該脂質(zhì)的含量值。

步驟1中利用opls-da模型對(duì)差異性化合物進(jìn)行篩選，然后將vip>1的排名前9位變量的數(shù)據(jù)提取出來(lái)即得r1-r9。

步驟1中篩選的具體方法為：

步驟1.1將樣品進(jìn)行超高效液相色譜和質(zhì)譜分析，得到脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，將正常人組群和甲狀腺癌組群分別計(jì)為ck及jc。

步驟1.2對(duì)脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作，利用opls-da模型對(duì)ck及jc進(jìn)行s-plot分布得到s形曲線，并進(jìn)行強(qiáng)制分組，計(jì)算影響ck及jc分組的變量重要性，即得vip值。

步驟1.3按照vip值大于5的標(biāo)準(zhǔn)得到15個(gè)化合物，并將該15個(gè)化合物作為與甲狀腺癌相關(guān)度最高的差異性化合物。

步驟1.4將所得15個(gè)化合物按照vip值大小從高到低排列，取前9位，即得步驟1中所述差異性化合物r1-r9。

步驟2中tc值或者用邏輯回歸模型2進(jìn)行計(jì)算，所述邏輯回歸模型2的計(jì)算公式為：tc＝1.6361-12.5962*r+0.4081*r2-0.962*r3-1.7675*r4+0.7317*r5-7.3848*r6+15.9658*r7+0.494*r8+2.5964*r9。

經(jīng)過(guò)roc曲線繪制，模型2的auc值為0.864，準(zhǔn)確度為86.4％。

步驟2中tc值或者用邏輯回歸模型1進(jìn)行計(jì)算，所述邏輯回歸模型1的計(jì)算公式為：

tc＝1.6054-13.4331*r1-2.4503*r4+0.9397*r5+9.5919*r7+3.3108*r9。

經(jīng)過(guò)roc曲線繪制，模型1的auc值為0.866，準(zhǔn)確度為86.6％。

實(shí)施例1

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象(均選自中國(guó)人)：16位正常人，64位甲狀腺癌患者，抽取靜脈血5ml。準(zhǔn)確量取100μl的血液，加入0.9ml的提取液(100％異丙醇)，轉(zhuǎn)入2ml離心管(必須是進(jìn)口離心管，塑料不易溶于有機(jī)溶劑中；axygen品牌)中，漩渦振蕩10s以上，超聲10min，然后在-20度冰箱中冷凍1小時(shí)，取出后在室溫下漩渦振蕩，用冷凍離心機(jī)10000rpm離心10min，然后去上清液1ml并過(guò)0.22μm的有機(jī)相濾膜到玻璃進(jìn)樣品種，保存在冰箱中待測(cè)。

2.主要儀器

2.1.1冷凍離心機(jī)：型號(hào)d3024r，scilogex公司，美國(guó)

2.1.2漩渦振蕩器：型號(hào)mx-s，scilogex公司，美國(guó)

2.1.3高分辨質(zhì)譜儀：esi-qtof/ms；型號(hào)：xevog2-sq-tof；廠家：waters

2.1.4超高效液相色譜：uplc；型號(hào)：acquityuplci-class系統(tǒng)；廠家：waters

2.1.4數(shù)據(jù)采集軟件：masslynx4.1；廠家：waters

2.1.5分析鑒定軟件：progenesisqi；廠家：waters

2.1.6作圖軟件：ezinfo；hemi；simca-p

3.主要試劑

甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨、亮氨酸腦啡肽、甲酸鈉。廠家均為fisher。

4.實(shí)驗(yàn)設(shè)置

以提取液(100％異丙醇)作為空白對(duì)照(blank)樣品；從每個(gè)樣品的進(jìn)樣品種取出100μl混合到新的進(jìn)樣品種作為質(zhì)控(qc)樣品；正式樣品按照每組樣品間隔進(jìn)樣，例如先是blank1，然后是qc1，然后是w1，然后是w2這個(gè)順序，然后再進(jìn)行下一輪進(jìn)樣。

液相方法

色譜柱：acquityuplccshc18column,1.7μm,1mmx50mm,1/pkg[186005292]；

柱溫：55度

流速：0.4ml/min

流動(dòng)相：a：acn/h2o(60％/40％)，含有10mm甲酸銨和0.1％甲酸

b：ipa/acn(90％/10％)，含有10mm甲酸銨和0.1％甲酸

(注：acn為乙腈，ipa為異丙醇)

進(jìn)樣體積：0.2μl

洗脫程序：

質(zhì)譜方法

數(shù)據(jù)采集方式：mse；分子量掃描范圍：50-1500m/z；分辨率模式(輪廓圖)。

正負(fù)離子模式各采集一次。

離子源：電噴霧電離源(esi)

毛細(xì)管電壓：3kv

錐孔電壓為：25v

碰撞能：15-60v

源溫度：120度

脫溶劑溫度：500度

錐孔氣體速度：50l/h

脫溶劑氣體速度：500l/h

掃描時(shí)間：0.2s

使用亮氨酸腦啡肽(m/z556.2771，正離子；554.2615，負(fù)離子)進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。使用甲酸鈉進(jìn)行校正。

脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析

progenesisqi軟件(waters,massachusetts,usa)用于結(jié)果分析，抽提非靶向脂質(zhì)分子的特征峰，進(jìn)行比對(duì)和篩選。同時(shí)，用qc(quantifyingcontrol)和blank(空白)來(lái)篩選背景數(shù)據(jù)。最終的數(shù)據(jù)，導(dǎo)入ezinfo3.0，并進(jìn)行principalcomponentanalysis(pca)分析,orthogonalsignalcorrectionpartialleastsquarediscriminationanalysis(opls-da)建模,variableimportanceinprojection(vip)的計(jì)算，同時(shí)得到火山圖(coefficientsvs.vipspots)，如圖3所示。其中，邏輯回歸模型以及roc曲線(如圖4)通過(guò)r語(yǔ)言進(jìn)行建設(shè)和繪制。

結(jié)果描述

正常人群與甲狀腺癌人群脂質(zhì)差異物質(zhì)的鑒定。

我們首先建立opls-da模型，對(duì)正常人(ck)和甲狀腺癌(jc)組群進(jìn)行分類，并研究造成他們出現(xiàn)差異的原因。我們看到在opls-da模型中，利用相關(guān)性(correlation)和協(xié)方差(covarience)的p值作出的s-plot形成了非常好的s形曲線，如圖1所示。利用opls-da將兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行強(qiáng)制分組，結(jié)果如圖2所示。計(jì)算影響ck和jc分組的變量重要性，即vip(variableimportanceinprojection)值。一共篩選到308個(gè)化合物，他們的vip值大于1；我們挑選vip>5，貢獻(xiàn)率大的15個(gè)化合物，如表1所示。

表1.變量重要性投影

我們通過(guò)vip>1篩選出來(lái)的化合物在s-plot上用紅色方框標(biāo)出，發(fā)現(xiàn)他們均勻的分布在兩側(cè)。同時(shí)，我們利用火山圖，來(lái)考察篩選出的化合物的分布，如圖3所示，發(fā)現(xiàn)篩選出來(lái)的化合物都分布在火山圖的外圍。這些結(jié)果都說(shuō)明，借由opls-da模型，我們成功篩選出造成ck和jc差異的化合物。

建立邏輯回歸模型以及roc曲線。我們對(duì)脂質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作(rproject：scale)。然后將vip>1的排名前9位變量的數(shù)據(jù)提取出來(lái)，建立邏輯回歸模型和roc曲線。

公式中，tc：是否患有腫瘤，0為否，1為是

r1:pg(17:0/14:1)

r2:ps(o-20:0/18:1)

r3:pc(16:0/18:2)

r4:bacteriohopane-,32,33,34-triol-35-cyclitolguanine

r5:pc(16:0/20:4)

r6:tg(16:0/16:1/20:2)

r7:pc(16:0/18:1)

r8:ps(o-18:0/17:0)

r9:ps(p-18:0/22:2)

模型3：tc＝1.8002-2.2815*r1-2.3474*r4+2.8573*r9

aic:57.484

signif.codes:‘***’0.001；‘**’0.01；‘*’0.05；‘.’0.1；

模型2：

tc＝1.6361-12.5962*r+0.4081*r2-0.962*r3-1.7675*r4+0.7317*r5-7.3848*r6+15.9658*r7+0.494*r8+2.5964*r9

aic:65.973

signif.codes:‘***’0.001；‘**’0.01；‘*’0.05；‘.’0.1；

模型1：

tc＝1.6054-13.4331*r1-2.4503*r4+0.9397*r5+9.5919*r7+3.3108*r9

aic:58.782

signif.codes:‘***’0.001；‘**’0.01；‘*’0.05；‘.’0.1；

針對(duì)以上三個(gè)邏輯回歸模型，進(jìn)行roc曲線繪制，如圖4所示，模型1為m1，auc值達(dá)到0.866；模型2為m2，auc值為0.864；模型3為m3，auc值達(dá)到0.872。我們發(fā)現(xiàn)模型3最靠近左上角定點(diǎn)，同時(shí)auc值最高，最終，確定模型3為基于脂質(zhì)指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)糖尿病血脂異常較好的預(yù)測(cè)模型。也可以根據(jù)所測(cè)樣品數(shù)據(jù)情況，選擇模型1或者模型2進(jìn)行計(jì)算預(yù)測(cè)，或者優(yōu)先選擇模型3進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)使用1和2模型進(jìn)行輔助驗(yàn)證，協(xié)同分析預(yù)測(cè)。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開(kāi)如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。