本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)乳腺癌的方法，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)乳腺癌。

背景技術(shù)：

與其他大多數(shù)國(guó)家一樣，乳腺癌也成為了中國(guó)女性最常見的癌癥；每年中國(guó)乳腺癌新發(fā)數(shù)量和死亡數(shù)量分別占全世界的12.2％和9.6％。中國(guó)對(duì)全球的“貢獻(xiàn)率”逐步增加，主要?dú)w因于中國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位的提高和特殊的生育模式。

90年代以來(lái)，中國(guó)的乳腺癌發(fā)病率增長(zhǎng)速度是全球的兩倍多，城市地區(qū)尤為顯著。目前，乳腺癌是中國(guó)女性發(fā)病率最高的癌癥，癌癥死亡原因位居第六。截至2008年，中國(guó)總計(jì)169452例新發(fā)乳腺癌，44908例死于乳腺癌，分別占到全世界的12.2％和9.6％。如果這一趨勢(shì)保持不變，到2021年，中國(guó)乳腺癌患者將高達(dá)250萬(wàn)，發(fā)病率將從不到60例/10萬(wàn)女性(年齡在55歲到69歲之間)增加到超過(guò)100例/10萬(wàn)女性。

目前對(duì)乳腺癌的篩查，主要通過(guò)x線檢查。然而，中國(guó)57％的患者都在一個(gè)年齡段發(fā)作。這一結(jié)果也暗示乳腺x線檢查，不是非常有效的篩查手段，并且具有無(wú)法實(shí)施的障礙，包括：缺乏令人信服的成本效果分析數(shù)據(jù)；人群分布廣泛；器材設(shè)備缺乏；醫(yī)療保險(xiǎn)未覆蓋此項(xiàng)目。同時(shí)，中國(guó)還沒(méi)有全國(guó)范圍內(nèi)的篩查項(xiàng)目；所以，開發(fā)快速而且高效的乳腺癌生物標(biāo)志物，具有重要的意義和市場(chǎng)前景。

研究表明，脂質(zhì)代謝與組織病變有非常直接的聯(lián)系，也包括乳腺癌。迄今為止，利用脂質(zhì)和代謝組的分析手段，發(fā)現(xiàn)了39個(gè)代謝物與乳腺癌發(fā)生有關(guān),包括：黃嘌呤(xanthine),葡萄糖6-磷酸(glucose-6-phosphate),甘露糖-6-磷酸(mannose-6-phosphate),鳥嘌呤(guanine),腺嘌呤(adenine)等等。另外，研究也發(fā)現(xiàn)，大部分的磷脂含量在乳腺癌細(xì)胞中都顯著升高。特別地，磷脂酰絲氨酸phosphatidylserine(ps)18:0/20:4，磷脂酰肌醇phosphatidylinositol(pi)18:0/20:4，磷脂酰膽堿phosphatidylcholine(pc)18:0/20:4，在乳腺癌細(xì)胞中顯著增加；而磷脂酰乙醇胺phosphatidylethanolamine(pe)18:1/18:1和磷脂酰肌醇pi18:0/18:1顯著降低.

但是，目前為止，還沒(méi)有出現(xiàn)能夠利用這些標(biāo)志物準(zhǔn)確預(yù)測(cè)乳腺癌的預(yù)測(cè)模型，尤其是針對(duì)中國(guó)人群的乳腺癌預(yù)測(cè)模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)乳腺癌的方法，能夠快捷、準(zhǔn)確、高效地預(yù)測(cè)乳腺癌。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種針對(duì)中國(guó)人群的利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)乳腺癌的方法。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一組針對(duì)中國(guó)人群的與乳腺癌密切相關(guān)的化合物。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了以下技術(shù)方案：

一種利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)乳腺癌的方法，其中，主要包括以下步驟：

步驟1、篩選出正常人組群和乳腺癌組群之間vip值大于5的排名前9位的差異性化合物r1-r9，分別為表1所示：

表1

步驟2、利用邏輯回歸模型2進(jìn)行計(jì)算，得到tc值，所述邏輯回歸模型2的計(jì)算公式為：

tc＝3.564+6.135*r6+5.375*r7-1.814*r8-2.943*r9+1.151*r10；

步驟3、根據(jù)所得tc值進(jìn)行判斷，tc＝0為否；tc＝1為是。

優(yōu)選的是，步驟1中利用opls-da模型對(duì)差異性化合物進(jìn)行篩選，篩選條件vip>1。

優(yōu)選的是，步驟1中篩選的具體方法為：

步驟1.1將樣品進(jìn)行超高效液相色譜和質(zhì)譜分析，得到脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，將正常人組群和乳腺癌組群分別計(jì)為ck及rc；

步驟1.2對(duì)脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作，利用opls-da模型對(duì)ck及rc進(jìn)行s-plot分布得到s形曲線，并進(jìn)行強(qiáng)制分組，計(jì)算影響ck及rc分組的變量重要性，即得vip值；

步驟1.3按照vip值大于1的標(biāo)準(zhǔn)得到10個(gè)化合物，并將該10個(gè)化合物作為與乳腺癌相關(guān)度最高的差異性化合物；

步驟1.4將所得10個(gè)化合物按照vip值大小從高到低排列，取前9位，即得步驟1中所述差異性化合物r1-r9。

優(yōu)選的是，步驟2中tc值或者用邏輯回歸模型1進(jìn)行計(jì)算，所述邏輯回歸模型1的計(jì)算公式為：

tc＝-8.673-32.803*r1+19.399*r2+8.738*r3-20.88*r8+2.217*r9+1.607*r10。

優(yōu)選的是，步驟2中tc值或者用邏輯回歸模型3進(jìn)行計(jì)算，所述邏輯回歸模型3的計(jì)算公式為：

tc＝0.7564-2.6459*r8+2.524*r9+1.5554*r10。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

本發(fā)明通過(guò)篩選，首次發(fā)現(xiàn)與乳腺癌相關(guān)的一組化合物，即與乳腺癌相關(guān)的脂質(zhì)生物標(biāo)志物，并通過(guò)構(gòu)建邏輯回歸模型，得到根據(jù)這些脂質(zhì)標(biāo)志物預(yù)測(cè)乳腺癌的方法，快捷方便，準(zhǔn)確度高。通過(guò)aic值初步判斷，并進(jìn)行roc曲線繪制，auc值達(dá)到0.939。

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中所述的opls-da模型的s-plot分布圖；

圖2為本發(fā)明中利用opls-da模型對(duì)ck和rc進(jìn)行強(qiáng)制分組的結(jié)果；

圖3為本發(fā)明中用來(lái)考察篩選出的化合物的火山圖；

圖4為本發(fā)明中roc曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語(yǔ)并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。

一種利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)乳腺癌的方法，其中，主要包括以下步驟：

步驟1、篩選出正常人組群和乳腺癌組群之間vip值大于5的排名前9位的差異性化合物r1-r9，分別為表1所示。其中，所述vip值表示差異性的大小，所述r1-r9按照vip值從高到低順次排列。

表1

步驟2、利用邏輯回歸模型2進(jìn)行計(jì)算，得到tc值，所述邏輯回歸模型2的計(jì)算公式為：

tc＝3.564+6.135*r6+5.375*r7-1.814*r8-2.943*r9+1.151*r10；

經(jīng)過(guò)roc曲線繪制，模型2的auc值為0.939，準(zhǔn)確度高達(dá)93.9％。

步驟3、根據(jù)所得tc值進(jìn)行判斷，tc＝0為否；tc＝1為是。

繪制roc曲線，模型1所得auc值為0.939，即準(zhǔn)確度為93.9％，準(zhǔn)確度高。其中，公式中r1-r10均為測(cè)量樣品中各種脂質(zhì)的含量。

一個(gè)優(yōu)選方案中，步驟1中利用opls-da模型對(duì)差異性化合物進(jìn)行篩選，篩選條件vip>1。

一個(gè)優(yōu)選方案中，步驟1中篩選的具體方法為：

步驟1.1將樣品進(jìn)行超高效液相色譜和質(zhì)譜分析，得到脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，將正常人組群和乳腺癌組群分別計(jì)為ck及rc；

步驟1.2對(duì)脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作，利用opls-da模型對(duì)ck及rc進(jìn)行s-plot分布得到s形曲線，并進(jìn)行強(qiáng)制分組，計(jì)算影響ck及rc分組的變量重要性，即得vip值；

步驟1.3按照vip值大于1的標(biāo)準(zhǔn)得到10個(gè)化合物，并將該10個(gè)化合物作為與乳腺癌相關(guān)度最高的差異性化合物；

步驟1.4將所得10個(gè)化合物按照vip值大小從高到低排列，取前9位，即得步驟1中所述差異性化合物r1-r9。

一個(gè)優(yōu)選方案中，步驟2中tc值或者用邏輯回歸模型1進(jìn)行計(jì)算，繪制roc曲線，模型1所得auc值為0.939。所述邏輯回歸模型1的計(jì)算公式為：

tc＝-8.673-32.803*r1+19.399*r2+8.738*r3-20.88*r8+2.217*r9+1.607*r10。

經(jīng)過(guò)roc曲線繪制，模型1的auc值為0.907，準(zhǔn)確度90.7％。

一個(gè)優(yōu)選方案中，步驟2中tc值或者用邏輯回歸模型3進(jìn)行計(jì)算，繪制roc曲線，模型3所得auc值為0.899。所述邏輯回歸模型3的計(jì)算公式為：

tc＝0.7564-2.6459*r8+2.524*r9+1.5554*r10。

經(jīng)過(guò)roc曲線繪制，模型3的auc值為0.899，準(zhǔn)確度89.9％。

本發(fā)明通過(guò)篩選，首次發(fā)現(xiàn)與乳腺癌相關(guān)的一組化合物，即與乳腺癌相關(guān)的脂質(zhì)生物標(biāo)志物，并通過(guò)構(gòu)建邏輯回歸模型，得到根據(jù)這些脂質(zhì)標(biāo)志物預(yù)測(cè)乳腺癌的方法，快捷方便，準(zhǔn)確度高。通過(guò)aic值初步判斷，并進(jìn)行roc曲線繪制，auc值達(dá)到0.939。

實(shí)施例1

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象(均選自中國(guó)人)：14位正常人，28位乳腺癌患者，抽取靜脈血5ml。準(zhǔn)確量取100μl的血液，加入0.9ml的提取液(100％異丙醇)，轉(zhuǎn)入2ml離心管(進(jìn)口離心管，塑料不易溶于有機(jī)溶劑中；axygen品牌)中，漩渦振蕩10s以上，超聲10min，然后在-20度冰箱中冷凍1小時(shí)，取出后在室溫下漩渦振蕩，用冷凍離心機(jī)10000rpm離心10min，然后去上清液1ml并過(guò)0.22μm的有機(jī)相濾膜到玻璃進(jìn)樣品種，保存在冰箱中待測(cè)。

2.主要儀器

2.1.1冷凍離心機(jī)：型號(hào)d3024r，scilogex公司，美國(guó)

2.1.2漩渦振蕩器：型號(hào)mx-s，scilogex公司，美國(guó)

2.1.3高分辨質(zhì)譜儀：esi-qtof/ms；型號(hào)：xevog2-sq-tof；廠家：waters

2.1.4超高效液相色譜：uplc；型號(hào)：acquityuplci-class系統(tǒng)；廠家：waters

2.1.4數(shù)據(jù)采集軟件：masslynx4.1；廠家：waters

2.1.5分析鑒定軟件：progenesisqi；廠家：water

2.1.6作圖軟件：ezinfo；hemi；simca-p

3.主要試劑

甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨、亮氨酸腦啡肽、甲酸鈉。廠家均為fisher。

4.實(shí)驗(yàn)設(shè)置

以提取液(100％異丙醇)作為空白對(duì)照(blank)樣品；從每個(gè)樣品的進(jìn)樣品種取出100μl混合到新的進(jìn)樣品種作為質(zhì)控(qc)樣品；正式樣品按照每組樣品間隔進(jìn)樣，例如先是blank1，然后是qc1，然后是w1，然后是w2這個(gè)順序，然后再進(jìn)行下一輪進(jìn)樣。

液相方法

色譜柱：acquityuplccshc18column,1.7μm,1mmx50mm,1/pkg[186005292]；

柱溫：55度

流速：0.4ml/min

流動(dòng)相：

a：acn/h2o(60％/40％)，含有10mm甲酸銨和0.1％甲酸

b：ipa/acn(90％/10％)，含有10mm甲酸銨和0.1％甲酸

(注：acn為乙腈，ipa為異丙醇)

進(jìn)樣體積：0.2μl

洗脫程序：

質(zhì)譜方法

數(shù)據(jù)采集方式：mse；分子量掃描范圍：50-1500m/z；分辨率模式(輪廓圖)。

正負(fù)離子模式各采集一次。

離子源：電噴霧電離源(esi)

毛細(xì)管電壓：3kv

錐孔電壓為：25v

碰撞能：15-60v

源溫度：120度

脫溶劑溫度：500度

錐孔氣體速度：50l/h

脫溶劑氣體速度：500l/h

掃描時(shí)間：0.2s

使用亮氨酸腦啡肽(m/z556.2771，正離子；554.2615，負(fù)離子)進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。使用甲酸鈉進(jìn)行校正。

脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析

progenesisqi軟件(waters,massachusetts,usa)用于結(jié)果分析，抽提非靶向脂質(zhì)分子的特征峰，進(jìn)行比對(duì)和篩選。同時(shí)，用qc(quantifyingcontrol)和blank(空白)來(lái)篩選背景數(shù)據(jù)。最終的數(shù)據(jù)，導(dǎo)入ezinfo3.0，并進(jìn)行principalcomponentanalysis(pca)分析,orthogonalsignalcorrectionpartialleastsquarediscriminationanalysis(opls-da)建模,variableimportanceinprojection(vip)的計(jì)算，同時(shí)得到火山圖(coefficientsvs.vipspots)。其中，邏輯回歸模型以及roc曲線通過(guò)r語(yǔ)言進(jìn)行建設(shè)和繪制。

結(jié)果描述

正常人群與乳腺癌人群脂質(zhì)差異物質(zhì)的鑒定。

我們首先建立opls-da模型，對(duì)正常人(ck)和乳腺癌(rc)組群進(jìn)行分類，并研究造成他們出現(xiàn)差異的原因。我們看到在opls-da模型中，利用相關(guān)性(correlation)和協(xié)方差(covarience)的p值作出的s-plot形成了非常好的s形曲線，如圖1所示。

利用opls-da將兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行強(qiáng)制分組，如圖2所示。

計(jì)算影響ck和rc分組的變量重要性，即vip(variableimportanceinprojection)值。一共篩選到132個(gè)化合物，他們的vip值大于1；我們挑選vip>5，貢獻(xiàn)率大的10個(gè)化合物，如表2所示。

表2.變量重要性投影

我們通過(guò)vip>1篩選出來(lái)的化合物在s-plot上用紅色方框標(biāo)出，發(fā)現(xiàn)他們均勻的分布在兩側(cè)。同時(shí)，我們利用火山圖，如圖3所示，來(lái)考察篩選出的化合物的分布，如圖所示，發(fā)現(xiàn)篩選出來(lái)的化合物都分布在火山圖的外圍。這些結(jié)果都說(shuō)明，借由opls-da模型，我們成功篩選出造成ck和rc差異的化合物。

建立邏輯回歸模型以及roc曲線。

我們對(duì)脂質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作(rproject：scale)。然后將vip>1的排名前9位變量的數(shù)據(jù)提取出來(lái)，建立邏輯回歸模型和roc曲線。

公式中，tc：是否患有腫瘤，0為否，1為是

r1:pc(16:0/18:2)

r2:pe(p-20:0/22:6)

r3:pa(21:0/18:1)

r4:pa(p-16:0/21:0)

r5:pa(19:0/18:0)

r6:pc(16:0/18:1)

r7:sm(d18:1/24:1)

r8:sm(d18:1/16:0)

r9:ps(o-20:0/18:1)

r10:pe(22:0/18:4)

模型2：

tc＝3.564+6.135*r6+5.375*r7-1.814*r8-2.943*r9+1.151*r10

aic:35.898

signif.codes:‘***’0.001；‘**’0.01；‘*’0.05；‘.’0.1；

模型1：

tc＝-8.673-32.803*r1+19.399*r2+8.738*r3-20.88*r8+2.217*r9+1.607*r10

aic:39.564

signif.codes:‘***’0.001；‘**’0.01；‘*’0.05；‘.’0.1；

模型3：

tc＝0.7564-2.6459*r8+2.524*r9+1.5554*r10

aic:37.067

signif.codes:‘***’0.001；‘**’0.01；‘*’0.05；‘.’0.1；

針對(duì)以上三個(gè)邏輯回歸模型，進(jìn)行roc曲線繪制，如圖4所示，模型1為m1，auc值為0.907；模型2為m2，auc值為0.939；模型3為m3，auc值為0.899。我們發(fā)現(xiàn)模型2最靠近左上角定點(diǎn)，同時(shí)auc值最高，最終，確定模型2為基于脂質(zhì)指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)糖尿病血脂異常較好的預(yù)測(cè)模型。也可以根據(jù)所測(cè)樣品數(shù)據(jù)情況，選擇模型1或者模型3進(jìn)行計(jì)算預(yù)測(cè)，或者優(yōu)先選擇模型2進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)使用1和3模型進(jìn)行輔助驗(yàn)證，協(xié)同分析預(yù)測(cè)。

本發(fā)明利用opls-da模型，首次發(fā)現(xiàn)與乳腺癌相關(guān)的10個(gè)biomarker。利用邏輯回歸模型以及roc曲線，首次提出了基于脂質(zhì)生物標(biāo)志物的乳腺癌預(yù)測(cè)模型。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。