相關(guān)申請(qǐng)案

本申請(qǐng)案根據(jù)35u.s.c.§119(e)主張2014年12月31日提出申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第62/098,453號(hào)的權(quán)益，所述臨時(shí)申請(qǐng)案以全文引用方式并入本文中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明部分地提供用于制造超聲對(duì)比劑的新穎且經(jīng)改進(jìn)調(diào)配物以及超聲對(duì)比劑制劑自身。所述調(diào)配物的組成、制造方法和其使用方法比用于制造超聲對(duì)比劑的先前技術(shù)調(diào)配物更簡(jiǎn)單，且令人驚訝地更穩(wěn)健，包括在室溫下在延長(zhǎng)時(shí)間段中更穩(wěn)定。所述調(diào)配物可令人驚訝地在無(wú)復(fù)雜操作的情況下用于制造超聲對(duì)比劑。

本文提供這些新穎調(diào)配物、包含這些新穎調(diào)配物的試劑盒、使用這些調(diào)配物的方法(包括使用這些調(diào)配物制造超聲對(duì)比劑的方法)和脂質(zhì)封裝的氣體微球自身的組合物或制劑。這些新穎調(diào)配物包括本文更詳細(xì)闡述的非水性混合物。

在一個(gè)方面中，本文提供由dppa、dppc和peg5000-dppe于丙二醇和甘油和緩沖劑中的非水性混合物組成或基本上由其組成的組合物。

在另一方面中，本文提供由dppa、dppc和peg5000-dppe于丙二醇和緩沖劑中的非水性混合物組成或基本上由其組成的組合物。

在另一方面中，本文提供由dppa、dppc和peg5000-dppe于甘油和緩沖劑中的非水性混合物組成或基本上由其組成的組合物。

緩沖劑可為(但不限于)乙酸鹽緩沖劑(例如，乙酸鈉與乙酸的組合)、或苯甲酸鹽緩沖劑(例如，苯甲酸鈉與苯甲酸的組合)、或水楊酸鹽緩沖劑(例如，水楊酸鈉與水楊酸的組合)。

前述組合物可于無(wú)菌容器中提供，任選地含有全氟碳?xì)怏w，且進(jìn)一步任選地具有使用說(shuō)明，包括在全氟碳?xì)怏w存在下和任選地在水性稀釋劑存在下活化所述組合物以生成脂質(zhì)封裝的氣體微球的說(shuō)明。待活化的組合物可包含水性稀釋劑作為第二相且因此在活化前可為非均勻。

在另一方面中，本文提供包含dppa、dppc和peg5000-dppe于丙二醇和甘油中的非水性混合物和全氟碳?xì)怏w的組合物。

在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇對(duì)甘油的重量對(duì)重量對(duì)重量(w/w/w)比率在約1:50:50到約1:1000:1000或約1:100:100到約1:600:700的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇對(duì)甘油的w/w/w比率為約1:120:120到約1:400:400、或約1:120:120到約1:300:300或約1:120:120到約1:250:250。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇對(duì)甘油的w/w/w比率為約1:100:150到約1:150:200。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇對(duì)甘油的w/w/w比率為約1:250:300到約1:300:350。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇對(duì)甘油的w/w/w比率為約1:500:600到約1:600:700。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇對(duì)甘油的w/w/w比率為約1:138:168或約1:276:336或約1:552:673。

在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇對(duì)甘油的w/w/w比率為約0.75mg:103.5mg:126.2mg。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇對(duì)甘油的w/w/w比率為約0.375mg:103.5mg:126.2mg。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇對(duì)甘油的w/w/w比率為約0.1875mg:103.5mg:126.2mg。

在另一方面中，本文提供包含dppa、dppc和peg5000-dppe于丙二醇中的非水性混合物和全氟碳?xì)怏w的組合物。

在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇的w/w比率在約1:10到約1:2000、或約1:10到約1:1500、或約1:10到約1:1000、或約1:20到約1:2000、或約1:50到約1:1000、或約1:50到約1:600或約1:100到約1:600的范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇的w/w比率為約1:100到約1:200或約1:100到約1:150。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇的w/w比率為約1:200到約1:350或約1:250到約1:300。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇的w/w比率為約1:500到約1:600或約1:525到約1:575。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇的w/w比率為約1:138或約1:276或約1:552。

在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)丙二醇的w/w比率為約0.75mg:103.5mg或約0.375mg:103.5mg或約0.1875mg:103.5mg。

在另一方面中，本文提供包含dppa、dppc和peg5000-dppe于甘油中的非水性混合物和全氟碳?xì)怏w的組合物。

在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)甘油的w/w比率在約1:10到約1:2000、或約1:15到約1:1500、或約1:50到約1:1000、或約1:50到約1:7000或約1:100到約1:700的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)甘油的w/w比率為約1:100到約1:200或約1:125到約1:175。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)甘油的w/w比率為約1:250到約1:400或約1:300到約1:350。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)甘油的w/w比率為約1:550到約1:700或約1:650到約1:700。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)甘油的w/w比率為約1:168或約1:336或約1:673。

在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe(組合)對(duì)甘油的w/w比率為約0.75mg:126.2mg、或約0.375mg:126.2mg或約0.1875mg:126.2mg。

在其它方面中，本文提供包含前述組合物中的任一者的容器。

在一些實(shí)施例中，容器是單一室容器。

在一些實(shí)施例中，所述容器包含第一室和第二室，且其中非水性混合物在所述第一室中且全氟碳?xì)怏w在所述第二室中。

在其它方面中，本文提供包含第一室中之前述組合物中的任一者和第二室中的水性稀釋劑的容器。

在其它方面中，本文提供包含前述組合物中的任一者及水性稀釋劑的容器，其中非水性混合物是在第一室中提供，全氟碳?xì)怏w是在第二室中提供，且水性稀釋劑是在第三室中提供。

在一些實(shí)施例中，水性稀釋劑是水性鹽水溶液。在一些實(shí)施例中，水性稀釋劑是水性緩沖溶液。在一些實(shí)施例中，水性稀釋劑是水性緩沖鹽水溶液。

在另一方面中，本文提供包含呈固體形式的dppa、dppc和peg5000-dppe的混合物和全氟碳?xì)怏w的組合物。呈固體形式的dppa、dppc和peg5000-dppe的混合物可為摻和固體形式(例如，相對(duì)均勻脂質(zhì)混合物)，或其可為每一脂質(zhì)的固體形式的組合(例如，其可為或可不為均勻脂質(zhì)混合物)。在另一方面中，本文提供包含前述固體形式組合物的容器。在一些實(shí)施例中，容器是具有單一室的容器。在一些實(shí)施例中，容器是具有兩個(gè)室的容器，其中第一室包含呈固體形式的dppa、dppc和peg5000-dppe，且第二室包含全氟碳?xì)怏w。在一些實(shí)施例中，容器是具有兩個(gè)室的容器，其中第一室包含呈固體形式的dppa、dppc和peg5000-dppe和全氟碳?xì)怏w，且第二室包含(a)丙二醇、(b)丙二醇和甘油或(c)甘油。經(jīng)組合脂質(zhì)對(duì)丙二醇和/或?qū)Ω视偷膚/w/w比率可如上文所陳述。在一些實(shí)施例中，容器是具有三個(gè)室的容器，其中第一室包含呈固體形式的dppa、dppc和peg5000-dppe，第二室包含全氟碳?xì)怏w，且第三室包含(a)丙二醇、(b)丙二醇和甘油或(c)甘油。在一些實(shí)施例中，容器是具有包含水性稀釋劑的額外室的容器。

在另一方面中，本文提供包含脂質(zhì)封裝的氣體微球的組合物，所述微球包含dppa、dppc和peg5000-dppe和全氟碳?xì)怏w且在包含丙二醇和甘油的非水性溶液中。

在另一方面中，本文提供包含脂質(zhì)封裝的氣體微球的組合物，所述微球包含dppa、dppc和peg5000-dppe且在包含丙二醇的非水性溶液中。

在另一方面中，本文提供包含脂質(zhì)封裝的氣體微球的組合物，所述微球包含dppa、dppc和peg5000-dppe和全氟碳?xì)怏w且在包含甘油的非水性溶液中。

在一些實(shí)施例中，脂質(zhì)封裝的氣體微球具有在約1.0微米到約2.0微米范圍內(nèi)的平均直徑。在一些實(shí)施例中，脂質(zhì)封裝的氣體微球具有在約1.2微米到約2.0微米范圍內(nèi)的平均直徑。在一些實(shí)施例中，脂質(zhì)封裝的氣體微球具有約1.4微米到1.8微米的平均直徑。

在一些實(shí)施例中，脂質(zhì)封裝的氣體微球以大于10⁸/ml的濃度存在于組合物中。

各個(gè)實(shí)施例同樣適用于前述組合物且現(xiàn)將加以列舉。

在一些實(shí)施例中，非水性混合物包含少于5重量％水(即，水重量對(duì)脂質(zhì)和丙二醇和/或甘油的組合的重量)。在一些實(shí)施例中，非水性混合物包含1-4重量％水。在一些實(shí)施例中，非水性混合物包含少于1重量％水。

在一些實(shí)施例中，組合物不含鹽，意味著其可包含針對(duì)組合物中的脂質(zhì)的反荷離子但不含其它離子。脂質(zhì)反荷離子通常是陽(yáng)離子，例如鈉。因此，在一些實(shí)施例中，組合物不包含陰離子。在一些實(shí)施例中，組合物不含氯化鈉。在一些實(shí)施例中，組合物不含氯離子。

在一些實(shí)施例中，組合物進(jìn)一步包含緩沖劑。在一些實(shí)施例中，組合物進(jìn)一步包含非磷酸鹽緩沖劑。在一些實(shí)施例中，組合物進(jìn)一步包含乙酸鹽緩沖劑、或苯甲酸鹽緩沖劑或水楊酸鹽緩沖劑。

在一些實(shí)施例中，組合的dppa、dppc和peg5000-dppe是以約0.9mg到約8mg脂質(zhì)/ml非水性混合物、約0.9mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml非水性混合物、約2mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml非水性混合物或約2mg到約4mg脂質(zhì)/ml非水性混合物的濃度存在。在一些實(shí)施例中，組合的dppa、dppc和peg5000-dppe是以約0.94mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml非水性混合物、或約1.875mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml非水性混合物的濃度存在，包括約1.875mg到約3.75mg脂質(zhì)/ml非水性混合物和約3.75到約7.5mg脂質(zhì)/ml非水性混合物。在一些實(shí)施例中，dppa、dppc和peg5000-dppe是以約10:82:8(摩爾％)的比率存在。

在一些實(shí)施例中，當(dāng)在室溫下存儲(chǔ)約3個(gè)月時(shí)，單獨(dú)或與全氟碳?xì)怏w組合的非水性混合物包含少于5％雜質(zhì)。在一些實(shí)施例中，當(dāng)非水性混合物單獨(dú)或與全氟碳?xì)怏w組合存儲(chǔ)于室溫下時(shí)(即，當(dāng)組合物與存儲(chǔ)于室溫下時(shí))，所述非水性混合物包含的雜質(zhì)少于

在一些實(shí)施例中，全氟碳?xì)怏w是全氟丙烷氣體。

在一些實(shí)施例中，peg5000-dppe是mpeg5000-dppe。

在一些實(shí)施例中，組合物是在小瓶中提供。在一些實(shí)施例中，組合物是在實(shí)際體積小于或等于約3.8ml的小瓶中提供。

在一些實(shí)施例中，組合物是在具有v形底的小瓶中提供。在一些實(shí)施例中，組合物是在具有平底的小瓶中提供。在一些實(shí)施例中，組合物是在具有圓底的小瓶中提供。在一些實(shí)施例中，小瓶是玻璃小瓶。在一些實(shí)施例中，包含dppa、dppc和peg5000-dppe組合于丙二醇和甘油中的非水性混合物和全氟碳?xì)怏w的組合物是在2ml尼普洛(nipro)(惠頓(wheaton))小瓶中以約3.75mg/ml的脂質(zhì)濃度提供。在一些實(shí)施例中，包含dppa、dppc和peg5000-dppe組合于丙二醇和甘油中的非水性混合物和全氟碳?xì)怏w的組合物是在2ml肖特(schott)小瓶中以約3.75mg/ml的脂質(zhì)濃度提供。

在一些實(shí)施例中，組合物是在單一室容器中提供。在一些實(shí)施例中，組合物是在多室容器中提供。在一些實(shí)施例中，組合物是在第一室中提供且水性稀釋劑是在第二室中提供。水性稀釋劑可為鹽水溶液或其可不含鹽水。水性稀釋劑可為緩沖溶液或其可不含緩沖劑。水性稀釋劑可為緩沖鹽水溶液。

在另一方面中，本文提供于容器中包含前述組合物中的任一者的試劑盒。在一些實(shí)施例中，容器是單一室容器。

在一些實(shí)施例中，試劑盒包含第二容器。在一些實(shí)施例中，第二容器包含水性稀釋劑。在一些實(shí)施例中，第二容器是預(yù)填充注射器。

在一些實(shí)施例中，容器是多室容器。在一些實(shí)施例中，第一容器包含呈固體形式的脂質(zhì)(即，dppa、dppc和peg5000-dppe)，且第二容器包含丙二醇或甘油或丙二醇和甘油。第三容器可包含水性稀釋劑。

在一些實(shí)施例中，第一容器包含丙二醇中的脂質(zhì)，且第二容器包含甘油或水性稀釋劑?；蛘?，第二容器包含甘油且第三容器包含水性稀釋劑。

在一些實(shí)施例中，第一容器包含甘油中的脂質(zhì)，且第二容器包含丙二醇或水性稀釋劑?；蛘?，第二容器包含丙二醇且第三容器包含水性稀釋劑。

在一些實(shí)施例中，第一容器包含丙二醇和甘油中的脂質(zhì)，且第二容器包含水性稀釋劑。

在一些實(shí)施例中，試劑盒進(jìn)一步包含活化裝置，例如(但不限于)裝置。

根據(jù)本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，某些非水性混合物(即，某些這些經(jīng)改質(zhì)脂質(zhì)調(diào)配物)可用于作為非水性混合物或在簡(jiǎn)單添加水性稀釋劑后通過(guò)本文中稱作“活化”的過(guò)程生成脂質(zhì)封裝的氣體微球，不管組合溶液的均勻度如何。此是令人驚訝的，因?yàn)槟承┦惺蹖?duì)比劑是通過(guò)活化在過(guò)量水溶液中包含脂質(zhì)的預(yù)調(diào)配單相混合物來(lái)制造。在本發(fā)明之前認(rèn)為，在不在水溶液中預(yù)調(diào)配脂質(zhì)或不存在水溶液的情況下，無(wú)法生成適宜大小和數(shù)目的脂質(zhì)封裝的微球。

因此，在另一方面中，本文提供形成超聲對(duì)比劑的方法，其包含在全氟碳?xì)怏w存在下和在水性稀釋劑存在或不存在下活化前述非水性混合物中的任一者，以形成脂質(zhì)封裝的氣體微球。

在另一方面中，本文提供形成超聲對(duì)比劑的方法，其包含在全氟碳?xì)怏w存在下組合前述非水性混合物中的任一者與水性稀釋劑，及活化所述組合以形成脂質(zhì)封裝的氣體微球。可在使用或不使用攪動(dòng)或其它修改(例如，加熱等)下將水性稀釋劑添加至非水性混合物，且所述組合混合物可在全氟碳?xì)怏w存在下經(jīng)活化，不管其是單相混合物(即，脂質(zhì)相及水相已大體上混合和/或混合物表現(xiàn)為相對(duì)均勻)還是雙相混合物(即，脂質(zhì)相及水相尚未大體上混合和/或混合物不表現(xiàn)為相對(duì)均勻)。

在另一方面中，本文提供形成超聲對(duì)比劑的方法，其包含組合某些前述非水性混合物與單獨(dú)的丙二醇或丙二醇和水性稀釋劑(同時(shí)或連續(xù)地)，及在全氟碳?xì)怏w存在下活化所述組合以形成脂質(zhì)封裝的氣體微球。

在另一方面中，本文提供形成超聲對(duì)比劑的方法，其包含組合某些前述非水性混合物與單獨(dú)的甘油或甘油和水性稀釋劑(同時(shí)或連續(xù)地)，及在全氟碳?xì)怏w存在下活化所述組合以形成脂質(zhì)封裝的氣體微球。

非水性混合物在使用前可處于室溫下和/或可已存儲(chǔ)于室溫下?？稍谑覝叵麓鎯?chǔ)幾天至幾個(gè)月到幾年。

在一些實(shí)施例中，活化進(jìn)行20-45秒。在一些實(shí)施例中，活化進(jìn)行60-120秒。

在一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含在額外水性稀釋劑中稀釋脂質(zhì)封裝的氣體微球。

在一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含將脂質(zhì)封裝的氣體微球投與需要超聲對(duì)比成像的個(gè)體。

在一些實(shí)施例中，組合物在小瓶中。在一些實(shí)施例中，組合物在注射器中。在一些實(shí)施例中，組合物在單一室容器中。在一些實(shí)施例中，組合物在多室容器中。

在其它方面中，本文提供檢測(cè)和/或測(cè)量本文所述組合物中的任一者中的雜質(zhì)含量的方法。所述方法尤其可用于評(píng)價(jià)組合物的完整性，且可用于確定組合物適于使用或應(yīng)丟棄。可針對(duì)本文所述組合物的新近制造批次實(shí)施所述方法，或可針對(duì)在制造后已運(yùn)輸或存儲(chǔ)一段時(shí)間的批次實(shí)施所述方法。

所述方法包含檢測(cè)和識(shí)別樣品的組份。在一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含任選地在檢測(cè)和識(shí)別之前基于物理化學(xué)性質(zhì)(例如(但不限于)電荷及親脂性)分離各組份。在一些實(shí)施例中，在檢測(cè)之前實(shí)施分離且在分離之前用鹽水稀釋樣品。在一些實(shí)施例中，將樣品混合直到獲得均勻溶液為止?；谖锢砘瘜W(xué)性質(zhì)的分離技術(shù)為業(yè)內(nèi)已知且包括(但不限于)hplc，例如反相hplc。然后使用例如(但不限于)荷電氣溶膠檢測(cè)(cad)的技術(shù)檢測(cè)雜質(zhì)并任選地測(cè)量。在另一實(shí)施例中，在分離后可使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)(elsd)。此一檢測(cè)的實(shí)例更詳細(xì)地闡述于本文中。

本文將更詳細(xì)地闡述本發(fā)明的這些和其它方面及實(shí)施例。

附圖說(shuō)明

圖1.脂質(zhì)摻合物/丙二醇(lb/pg)調(diào)配物對(duì)的穩(wěn)定性。

圖2.脂質(zhì)摻合物/丙二醇/甘油(lb/pg/g)調(diào)配物對(duì)的穩(wěn)定性。

圖3.脂質(zhì)摻合物/丙二醇/甘油/緩沖劑(lb/pg/g/緩沖劑)調(diào)配物對(duì)的穩(wěn)定性。

具體實(shí)施方式

根據(jù)本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)，用于生成待用作超聲波成像劑的脂質(zhì)封裝的氣體微球的脂質(zhì)調(diào)配物可維持在室溫下，包括在室溫下維持延長(zhǎng)時(shí)間段，而無(wú)顯著降解。先前認(rèn)為，待用于相同目的的脂質(zhì)調(diào)配物必須存儲(chǔ)于4℃下以避免降解。根據(jù)本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)，將這些經(jīng)改質(zhì)脂質(zhì)調(diào)配物在室溫下存儲(chǔ)幾個(gè)月產(chǎn)生少于5％雜質(zhì)，此含量少于在室溫下存儲(chǔ)相同時(shí)間段時(shí)當(dāng)前市售超聲對(duì)比劑中存在的含量。

重要的是，將這些經(jīng)改質(zhì)脂質(zhì)調(diào)配物(稱為含脂質(zhì)非水性混合物)存儲(chǔ)在室溫下(包括長(zhǎng)期存儲(chǔ)在室溫下)對(duì)其形成供用作超聲對(duì)比劑的微球的能力無(wú)負(fù)面影響，如由形成大小及數(shù)量與當(dāng)前市售超聲對(duì)比劑相當(dāng)?shù)奈⑶虻哪芰λC明。因此，至少在此增強(qiáng)穩(wěn)定性方面，這些經(jīng)改質(zhì)脂質(zhì)調(diào)配物比某些市售脂質(zhì)調(diào)配物更穩(wěn)健。

本文所述的新穎脂質(zhì)調(diào)配物比某些現(xiàn)有調(diào)配物更易于使用，此至少部分是由于其無(wú)需冷凍。與此相比，某些當(dāng)前市售脂質(zhì)調(diào)配物在其存儲(chǔ)階段中必須始終冷凍，但隨后在室溫下投與患者。此意味著，所述調(diào)配物必須首先從約4℃升溫至到約室溫才可使用。與此相比，本文提供的經(jīng)改質(zhì)脂質(zhì)調(diào)配物可基本上“現(xiàn)成的”使用，而無(wú)需等待升溫至室溫所需的時(shí)間段。此使得這些改質(zhì)調(diào)配物更易于使用且也有助于其在(例如)緊急情況中直接使用。

另外，由于經(jīng)改質(zhì)脂質(zhì)調(diào)配物固有地更穩(wěn)健性質(zhì)，其完整性在使用前(包括例如在運(yùn)輸和存儲(chǔ)期間)受損的機(jī)率較低。在當(dāng)前實(shí)踐中，如果某些市售調(diào)配物已在室溫下存儲(chǔ)任一較長(zhǎng)時(shí)間段，那么所述調(diào)配物的質(zhì)量可能有問(wèn)題，且因此可能需要被丟棄。對(duì)于新穎調(diào)配物，最終用戶無(wú)需擔(dān)心調(diào)配物的歷史或處理。因此，除了增加易用性外，由于完整性問(wèn)題，經(jīng)改質(zhì)脂質(zhì)調(diào)配物的浪費(fèi)也應(yīng)較少。

這些經(jīng)改質(zhì)脂質(zhì)調(diào)配物打算用作超聲對(duì)比劑或用作其中間體。因此，且如本文所述，在與氣體一起提供時(shí)，其可經(jīng)活化以形成具有或不具有水性稀釋劑的脂質(zhì)封裝的氣體微球。此外，在使用水性稀釋劑時(shí)，所述調(diào)配物可在簡(jiǎn)單添加水性稀釋劑后活化，而無(wú)需預(yù)調(diào)配或預(yù)混合非水性混合物及水性稀釋劑。作為實(shí)例，添加水性稀釋劑可產(chǎn)生不均勻或二相混合物，且此二相混合物可經(jīng)活化。某些市售超聲對(duì)比劑是作為于水性基質(zhì)中調(diào)配的預(yù)調(diào)配、相對(duì)均勻的單相脂質(zhì)混合物來(lái)提供，且以此基本上經(jīng)水性調(diào)配的形式活化。與此相比，本文提供的經(jīng)改質(zhì)脂質(zhì)調(diào)配物可以其非水性形式活化或可在簡(jiǎn)單添加水性稀釋劑后活化，而無(wú)需將脂質(zhì)及水性稀釋劑預(yù)調(diào)配或使混合物均勻。此反過(guò)來(lái)意味著，脂質(zhì)調(diào)配物體積在活化時(shí)(和運(yùn)送及存儲(chǔ)時(shí))可明顯較小，且如果需要可在即將使用前將其稀釋。此還意味著，調(diào)配物完整性較不可能受損，因?yàn)榭稍诓惶砑铀韵♂寗┑那闆r下活化，且隨后如果不使用調(diào)配物，簡(jiǎn)單地將調(diào)配物存儲(chǔ)以供將來(lái)使用即可。如果相反的非水性混合物必須與水溶液組合以活化，則在此情況下將失去此類型的靈活性，且將不得不丟棄所述調(diào)配物，再次導(dǎo)致不必要的浪費(fèi)。

因此，本發(fā)明部分地基于意外且驚人的發(fā)現(xiàn)，即用于制造自身適合作為超聲對(duì)比劑的脂質(zhì)封裝的氣體微球的脂質(zhì)當(dāng)于非水性混合物中調(diào)配時(shí)可在室溫下存儲(chǔ)延長(zhǎng)時(shí)間段而無(wú)顯著降解。非水性混合物可包含丙二醇、或甘油、或丙二醇和甘油的混合物。重要的是，本文提供的脂質(zhì)調(diào)配物產(chǎn)生尤其在微球濃度和大小方面(此二者影響微球的聲學(xué)性質(zhì))與當(dāng)前市售超聲對(duì)比劑所產(chǎn)生者相當(dāng)?shù)闹|(zhì)封裝的氣體微球。所述脂質(zhì)調(diào)配物對(duì)于在室溫下存儲(chǔ)(包括長(zhǎng)期存儲(chǔ))比更穩(wěn)健且更不敏感。

是由fda批準(zhǔn)用于具有次最優(yōu)超聲波心動(dòng)圖的個(gè)體以使左心室腔不透明并改進(jìn)左心室心內(nèi)膜緣的描繪的超聲對(duì)比劑。是在小瓶中提供，所述小瓶包含于水溶液中以10:82:8摩爾％比率包含dppa、dppc及mpeg5000-dppe的單相溶液及包含全氟丙烷氣體的頂隙。在將其投與個(gè)體之前，通過(guò)機(jī)械振蕩活化(下文中稱作“經(jīng)活化”)?；罨瘜?dǎo)致形成足夠數(shù)目的平均直徑為1.1到3.3微米的脂質(zhì)封裝的氣體微球。然而，必須冷凍直到即將使用前為止。此尤其限制其尤其在存儲(chǔ)階段期間在缺少適當(dāng)冷凍的環(huán)境中的實(shí)用性。

本文尤其提供用于制造脂質(zhì)封裝的氣體微球的組合物及脂質(zhì)封裝的氣體微球自身的組合物及用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供制造所述微球的方法。

存儲(chǔ)調(diào)配物

這些新穎調(diào)配物包含一或多種脂質(zhì)與丙二醇(pg)、或甘油(g)或丙二醇和甘油(pg/g)的非水性混合物。根據(jù)本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)，這些調(diào)配物與先前使用現(xiàn)有超聲對(duì)比劑調(diào)配物可能的時(shí)間段相比可在較高溫度下存儲(chǔ)更長(zhǎng)時(shí)間段，而無(wú)顯著降解。因此，這些組合物可用于更寬范圍的環(huán)境中而無(wú)需特別擔(dān)心在使用前如何處理調(diào)配物。

這些新穎調(diào)配物的增強(qiáng)穩(wěn)定性展示于實(shí)例中，其中顯示丙二醇或丙二醇和甘油中的脂質(zhì)調(diào)配物可維持3個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間，同時(shí)降解少于在維持在室溫下的調(diào)配物中所觀察者。實(shí)例展示，這些調(diào)配物可存儲(chǔ)約3-6個(gè)月而無(wú)顯著降解。

脂質(zhì)于丙二醇、或甘油、或丙二醇和甘油中的非水性混合物打算為具有少于或等于5重量％水(即，水重量對(duì)脂質(zhì)與丙二醇和/或甘油的組合的重量)的混合物。在一些情況下，非水性混合物包含少于5％水(w/w)、1-4％水(w/w)、1-3％水(w/w)、2-3％水(w/w)或1-2％水(w/w)。在一些情況下，非水性混合物包含少于1％水(w/w)。水含量可在制造結(jié)束時(shí)(且在長(zhǎng)期存儲(chǔ)之前)測(cè)量，或其可在存儲(chǔ)(包括長(zhǎng)期存儲(chǔ))之后且即將使用之前測(cè)量。

非水性混合物也可無(wú)鹽，此意味著其不含除脂質(zhì)反荷離子以外的任何鹽。更特定地且作為實(shí)例，例如dppa和dppe等脂質(zhì)通常作為鈉鹽提供。如本文所用，無(wú)鹽非水性混合物可包含所述反荷離子(例如，如果使用dppa和/或dppe，則為鈉)，但其不含其它離子。在一些情況下，非水性混合物不含氯化鈉或氯化物。

非水性混合物可包含緩沖劑。緩沖劑可為乙酸鹽緩沖劑、苯甲酸鹽緩沖劑或水楊酸鹽緩沖劑，但其并不限于此。在一些情況下，非磷酸鹽緩沖劑由于其在本文所提供的非水性混合物中的溶解曲線而是優(yōu)選的。在一些情況下，可使用磷酸鹽緩沖劑(例如，在添加水性稀釋劑后或與其同時(shí))。

在一些實(shí)施例中，非水性混合物包含以下物質(zhì)、由其組成或基本上由其組成：(a)一或多種脂質(zhì)，(b)丙二醇、或甘油或丙二醇/甘油，及(c)非磷酸鹽緩沖劑。所述非水性混合物可與例如全氟碳?xì)怏w等氣體一起提供，或其可單獨(dú)提供(即，在氣體不存在下)。所述非水性混合物可以單次使用量和/或在具有或不具有氣體的單次使用容器中提供。所述容器通常將無(wú)菌。

非磷酸鹽緩沖劑可為(但不限于)乙酸鹽緩沖劑、苯甲酸鹽緩沖劑、水楊酸鹽緩沖劑、二乙醇胺緩沖劑、三乙醇胺緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑、碳酸鹽緩沖劑、谷氨酸鹽緩沖劑、琥珀酸鹽緩沖劑、蘋果酸鹽緩沖劑、酒石酸鹽緩沖劑、戊二酸鹽緩沖劑、烏頭緩沖劑、檸檬酸緩沖劑、乙酸緩沖劑、乳酸鹽緩沖劑、甘油酸鹽緩沖劑、葡糖酸鹽緩沖劑及tris緩沖劑。在一些情況下，緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可熟練地確定并最優(yōu)化每種緩沖劑類型的緩沖劑濃度。

如本文所用，室溫意指15-30℃溫度，包括18-25℃及20-25℃及其間的所有溫度。室溫可受控(例如，維持恒溫)以處于所述溫度下，但其并不限于此。

脂質(zhì)

這些新穎調(diào)配物包含一種且通常一種以上脂質(zhì)。如本文所用，“脂質(zhì)”或“總脂質(zhì)”或“組合脂質(zhì)”意指脂質(zhì)混合物。

脂質(zhì)可以其個(gè)別固態(tài)(例如，粉末化)形式提供?；蛘?，脂質(zhì)可作為脂質(zhì)摻合物提供。制造脂質(zhì)摻合物的方法包括那些闡述于美國(guó)專利第8,084,056號(hào)及公開pct申請(qǐng)案wo99/36104中者。如本文所用，脂質(zhì)摻合物打算表示兩種或更多種脂質(zhì)，其已經(jīng)摻和而產(chǎn)生比原本通過(guò)簡(jiǎn)單混合呈其個(gè)別粉末化形式的脂質(zhì)可得到者更均勻的脂質(zhì)混合物。脂質(zhì)摻合物通常呈粉末形式。脂質(zhì)摻合物可經(jīng)由水性懸浮-凍干工藝或使用有機(jī)溶劑的有機(jī)溶劑溶解-沉淀工藝制得。在水性懸浮-凍干工藝中，將所要脂質(zhì)在升溫下懸浮于水中，且然后通過(guò)凍干來(lái)濃縮。

有機(jī)溶劑溶解方法涉及以下步驟：

(a)使所要脂質(zhì)(例如，dppa、dppc和mpeg5000dppe)與第一非水性溶劑是統(tǒng)接觸。此系統(tǒng)通常是溶劑組合，例如chcl3/meoh、ch2cl2/meoh和甲苯/meoh。優(yōu)選地，第一非水性溶劑是甲苯與甲醇的混合物。可希望使脂質(zhì)溶液升溫至足以實(shí)現(xiàn)完全溶解的溫度。此一溫度優(yōu)選為約25℃到75℃，更優(yōu)選約35℃到65℃。溶解后，可通過(guò)熱過(guò)濾或冷卻到室溫且然后過(guò)濾來(lái)去除未溶解的外來(lái)物質(zhì)?？墒褂靡阎^(guò)濾方法(例如，重力過(guò)濾、真空過(guò)濾或加壓過(guò)濾)。

(b)然后將溶液濃縮為濃稠凝膠/半固體。濃縮優(yōu)選通過(guò)真空蒸餾來(lái)實(shí)施。也可使用其它濃縮溶液的方法，例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。此步驟的溫度優(yōu)選為約20℃到60℃，更優(yōu)選30℃到50℃。

(c)然后將濃稠凝膠/半固體分散于第二非水性溶劑中。優(yōu)選在接近環(huán)境溫度(例如，15-30℃)下使混合物漿化?？捎玫诙撬匀軇┦悄切┦怪|(zhì)從經(jīng)過(guò)濾溶液沉淀者。第二非水性溶劑優(yōu)選為甲基叔丁基醚(mtbe)。可使用其它醚和醇。

(d)然后收集在添加第二非水性溶劑后產(chǎn)生的固體。優(yōu)選地，用另一部分的第二非水性溶劑(例如，mtbe)洗滌所收集固體。收集可優(yōu)選在環(huán)境溫度下經(jīng)由真空過(guò)濾或離心實(shí)施。收集后，優(yōu)選將固體在真空中在約20-60℃的溫度下干燥。

美國(guó)專利第8,084,056號(hào)及公開pct申請(qǐng)案wo99/36104中關(guān)于生成脂質(zhì)摻合物的方法的內(nèi)容以引用方式并入本文中。

有機(jī)溶劑溶解-沉淀工藝出于多種原因優(yōu)選超過(guò)水性懸浮/凍干工藝，如美國(guó)專利第8,084,056號(hào)及公開pct申請(qǐng)案wo99/36104中所概述，包括使用有機(jī)溶解方法所得的均勻分布的脂質(zhì)固體。

或者，脂質(zhì)可作為個(gè)別粉末來(lái)提供，所述粉末一起或個(gè)別地直接溶于丙二醇、甘油或丙二醇/甘油中以形成非水性混合物。

如本文所用，脂質(zhì)溶液是包含脂質(zhì)混合物的溶液。類似地，脂質(zhì)調(diào)配物是包含一或多種脂質(zhì)的調(diào)配物。脂質(zhì)可為陽(yáng)離子、陰離子或中性脂質(zhì)。脂質(zhì)可具有天然、合成或半合成來(lái)源，包括例如脂肪酸、氟化脂質(zhì)、中性脂肪、磷脂、油、氟化油、糖脂、表面活性劑(surfaceactiveagent)(表面活性劑(surfactant)和氟表面活性劑)、脂肪族醇、蠟、萜烯和類固醇。

至少一種脂質(zhì)可為磷脂，且因此脂質(zhì)摻合物可稱為磷脂摻合物。如本文所用，磷脂是含有油性(疏水)烴鏈且具有極性(親水)含磷頭基的脂肪物質(zhì)。磷脂是兩親性的。其在水性介質(zhì)中自發(fā)形成邊界和封閉的囊泡。

優(yōu)選地，所有脂質(zhì)均為磷脂，優(yōu)選1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酯酰膽堿(dppc)；1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酸(dppa)；和1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(dppe)。dppa和dppe可作為單鈉鹽形式提供。

在一些情況下，脂質(zhì)組份可經(jīng)改質(zhì)以降低微球與周圍環(huán)境(包括活體內(nèi)環(huán)境)的反應(yīng)性，由此延長(zhǎng)其半衰期。具有脂質(zhì)的聚合物(例如幾丁質(zhì)、玻尿酸、聚乙烯基吡咯烷酮或聚乙二醇(peg))也可用于此目的。偶聯(lián)到peg的脂質(zhì)在本文中稱作聚乙二醇化脂質(zhì)。優(yōu)選地，聚乙二醇化脂質(zhì)為dppe-peg或dspe-peg。

脂質(zhì)與例如peg等聚合物的偶聯(lián)可通過(guò)多種鍵或鍵聯(lián)來(lái)完成，例如(但不限于)酰胺、氨基甲酸酯、胺、酯、醚、硫醚、硫酰胺和二硫化物(硫酯)鍵聯(lián)。

peg上的末端基團(tuán)可為(但不限于)羥基-peg(ho-peg)(或其反應(yīng)性衍生物)、羧基-peg(cooh-peg)、甲氧基-peg(mpeg)或另一低碳數(shù)烷基(例如如在異丙氧基peg或叔丁氧基peg中)、氨基peg(nh2peg)或硫醇(sh-peg)。

peg的分子量可從約500到約10000變化，包括約1000到約7500和約1000到約5000。在一些重要實(shí)施例中，peg的分子量為約5000。因此，dppe-peg5000或dspe-peg5000是指附接有分子量為約5000的peg聚合物的dppe或dspe。

聚乙二醇化脂質(zhì)相對(duì)于脂質(zhì)溶液中的脂質(zhì)總量的百分比以摩爾計(jì)為約2％到約20％或介于約2％到約20％之間。在各個(gè)實(shí)施例中，聚乙二醇化脂質(zhì)相對(duì)于脂質(zhì)總量的百分比為5摩爾％到約15摩爾％或介于5摩爾％到約15摩爾％之間。

優(yōu)選地，脂質(zhì)為1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(dppc)、1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酸單鈉鹽(dppa)和n-(聚乙二醇5000氨甲酰基)-1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺單鈉鹽(peg5000-dppe)。聚乙二醇5000氨甲酰基可為甲氧基聚乙二醇5000氨甲?；Ｔ谝恍┲匾獙?shí)施例中，脂質(zhì)可為dppa、dppc和peg5000-dppe中的一者、兩者或所有三者。peg5000-dppe可為mpeg5000-dppe或ho-peg5000-dppe。

眾多種脂質(zhì)(如闡述于昂格爾(unger)等人的美國(guó)專利第5,469,854號(hào)中者)可用于本發(fā)明方法中。適宜脂質(zhì)包括(例如)脂肪酸、溶血性脂質(zhì)、氟化脂質(zhì)、磷酸膽堿，例如與血小板活化因子(paf)結(jié)合者(阿文蒂極性脂質(zhì)公司(avantipolarlipids),阿拉巴斯特(alabaster),亞拉巴馬州(ala.))，包括1-烷基-2-乙?；?sn-甘油3-磷酸膽堿和1-烷基-2-羥基-sn-甘油3-磷酸膽堿；具有飽和和不飽和脂質(zhì)二者的磷酯酰膽堿，包括二油?；柞ヵＤ憠A；二肉豆蔻?；?磷酯酰膽堿；二(十五?；?磷酯酰膽堿；二月桂?；柞ヵＤ憠A；1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酯酰膽堿(dppc)；二硬脂?；柞ヵＤ憠A(dspc)；和二花生四烯?；柞ヵＤ憠A(dapc)；磷脂酰乙醇胺，例如二油酰基-磷脂酰乙醇胺、1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(dppe)和二硬脂?；?磷脂酰乙醇胺(dspe)；磷脂?；z氨酸；磷脂酰基甘油，包括二硬脂酰基磷脂酰基甘油(dspg)；磷脂酰肌醇；神經(jīng)鞘脂，例如鞘磷脂；糖脂，例如神經(jīng)節(jié)苷脂gm1和gm2；糖脂；硫脂；鞘糖脂；磷脂酸，例如1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酸(dppa)和二硬脂酰基磷脂酸(dspa)；棕櫚酸；硬脂酸；花生四烯酸；和油酸。

其它適宜脂質(zhì)包括磷酯酰膽堿，例如二油?；柞ヵＤ憠A、二肉豆蔻?；柞ヵＤ憠A、二棕櫚?；柞ヵＤ憠A(dppc)和二硬脂?；柞ヵＤ憠A；磷脂酰乙醇胺，例如二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)、二油?；字Ｒ掖及芳皀-琥珀酰基-二油?；字Ｒ掖及?；磷脂?；z氨酸；磷脂?；?甘油；神經(jīng)鞘脂；糖脂，例如神經(jīng)節(jié)苷脂gm1；糖脂；硫脂；鞘糖脂；磷脂酸，例如二棕櫚?；字?dppa)；棕櫚酸脂肪酸；硬脂酸脂肪酸；花生四烯酸脂肪酸；月桂酸脂肪酸；肉豆蔻酸脂肪酸；月桂烯酸脂肪酸；抹香鯨酸脂肪酸；肉豆蔻油酸脂肪酸；棕櫚油酸脂肪酸；巖芹酸脂肪酸；油酸脂肪酸；異月桂酸脂肪酸；異肉豆蔻酸脂肪酸；異棕櫚酸脂肪酸；異硬脂酸脂肪酸；膽固醇及膽固醇衍生物，例如膽固醇半琥珀酸酯、膽固醇硫酸酯和(4'-三甲基銨基)-丁酸膽固醇基酯；聚氧乙烯脂肪酸酯；聚氧乙烯脂肪酸醇；聚氧乙烯脂肪酸醇醚；聚氧乙基化失水山梨醇脂肪酸酯；甘油聚乙二醇羥基硬脂酸酯；甘油聚乙二醇蓖麻醇酸酯；乙氧基化大豆固醇；乙氧基化蓖麻油；聚氧乙烯-聚氧丙烯脂肪酸聚合物；聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯；12-(((7'-二乙基氨基香豆素-3-基)-羰基)-甲基氨基)-十八烷酸；n-[12-(((7'-二乙基氨基-香豆素-3-基)-羰基)-甲基-氨基)十八?；鵠-2-氨基-棕櫚酸；1,2-二油酰基-sn-甘油；1,2-二棕櫚酰基-sn-3-琥珀?；视?；1,3-二棕櫚?；?2-琥珀?；?甘油；和1-十六烷基-2-棕櫚?；?甘油磷酸乙醇胺和棕櫚?；甙腚装彼?；月桂基三甲基溴化銨(月桂基-＝十二烷基-)；鯨蠟基三甲基溴化銨(鯨蠟基-＝十六烷基-)；肉豆蔻基三甲基溴化銨(肉豆蔻基-＝十四烷基-)；烷基二甲基芐基氯化銨，例如其中烷基為c12、c14或c16烷基；芐基二甲基十二烷基溴化銨；芐基二甲基十二烷基氯化銨、芐基二甲基十六烷基溴化銨；芐基二甲基十六烷基氯化銨；芐基二甲基十四烷基溴化銨；芐基二甲基十四烷基氯化銨；鯨蠟基二甲基乙基溴化銨；鯨蠟基二甲基乙基氯化銨；鯨蠟基溴化吡啶鎓；鯨蠟基氯化吡啶鎓；n-[1-2,3-二油?；趸?-丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(dotma)；1,2-二油?；趸?3-(三甲基銨基)丙烷(dotap)；和1,2-二油?；?e-(4'-三甲基銨基)-丁?；?sn-甘油(dotb)。

在一些使用dppa、dppc和dppe的實(shí)施例中，其摩爾百分比可為約77-90摩爾％dppc、約5-15摩爾％dppa和約5-15摩爾％dppe，包括dppe-peg5000。每一脂質(zhì)的優(yōu)選比率包括闡述于實(shí)例部分中者，例如6.0比53.5比40.5(dppa:dppc:mpeg5000-dppe)的重量％比率或10比82比8(10:82:8)(dppa:dppc:mpeg5000-dppe)的摩爾％比率。

打算用于長(zhǎng)期室溫存儲(chǔ)的非水性混合物中的脂質(zhì)濃度可視實(shí)施例而變化。在一些情況下，脂質(zhì)濃度可在約0.1mg到約20mg/ml非水性混合物的范圍內(nèi)，包括約0.9mg到約10mg/ml非水性混合物和約0.9mg到約7.5mg/ml非水性混合物。在一些實(shí)施例中，脂質(zhì)濃度可在約0.94mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml非水性混合物的范圍內(nèi)，包括約1.875mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml非水性混合物或約3.75mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml非水性混合物。在一些情況下，脂質(zhì)濃度為約0.94mg到約1.875mg/ml非水性混合物、約1.875mg到約3.75mg/ml非水性混合物或約3.75mg到約7.5mg總脂質(zhì)/ml非水性混合物。

作為實(shí)例脂質(zhì)濃度可在約0.1mg到約10mg脂質(zhì)/ml丙二醇/甘油(組合)的范圍內(nèi)，包括約1mg到約5mg脂質(zhì)/ml丙二醇/甘油(組合)。在一些情況下，脂質(zhì)濃度為約0.94mg到約3.75mg脂質(zhì)/ml丙二醇/甘油(組合)。

作為另一實(shí)例，脂質(zhì)濃度可在約0.1mg到約20mg脂質(zhì)/ml丙二醇的范圍內(nèi)，包括約1mg到約10mg脂質(zhì)/ml丙二醇、或約2mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml丙二醇或約3.75mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml丙二醇。在一些實(shí)施例中，脂質(zhì)濃度為約1.875mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml丙二醇，包括約3.75mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml丙二醇。

作為再一實(shí)例，脂質(zhì)濃度可在約0.1mg到約20mg脂質(zhì)/ml甘油的范圍內(nèi)，包括約1mg到約10mg脂質(zhì)/ml甘油、或約2mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml甘油或約3.75mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml甘油。在一些情況下，脂質(zhì)濃度為約1.875mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml甘油，包括約3.75mg到約7.5mg脂質(zhì)/ml甘油。

與市售超聲對(duì)比劑脂質(zhì)調(diào)配物相比，使用較低量脂質(zhì)生成仍可用作超聲對(duì)比劑的脂質(zhì)封裝的氣體微球組合物的能力是有益的，因?yàn)槠浣档涂蓮膯我恍∑客杜c個(gè)體的脂質(zhì)(及其它成份)的最大量，由此減小個(gè)體意外過(guò)量用藥的機(jī)率。

丙二醇在室溫下是液體，在20℃下密度為1.035g/ml。甘油在室溫下是液體，在20℃下密度為1.26g/ml。

能長(zhǎng)期室溫存儲(chǔ)的非水性混合物的總體積可視最終所要用途而不同。作為實(shí)例，體積可在約0.05ml到約10ml、或約0.1ml到約10ml、或約0.1ml到約5ml、或約0.25ml到約5ml、或約0.5ml到約1ml或約0.1ml到約1.0ml的范圍內(nèi)。

應(yīng)理解，這些非水性混合物通常將如下文所述在活化之前和/或在投與個(gè)體之前經(jīng)例如水溶液稀釋?？傁♂尪瓤蔀榧s1倍到約100倍，包括約5倍到約30倍，包括約5倍、約10倍、約20倍和約50倍。

在一些實(shí)施例中，包含脂質(zhì)、丙二醇和甘油的脂質(zhì)調(diào)配物可在活化之前稀釋約5倍。在一些實(shí)施例中，包含脂質(zhì)和丙二醇的脂質(zhì)調(diào)配物可在活化之前稀釋約10倍。在一些實(shí)施例中，包含脂質(zhì)和甘油的脂質(zhì)調(diào)配物可在活化之前稀釋約10倍。之后，經(jīng)稀釋組合物可進(jìn)一步稀釋約1倍到約50倍，包括約10倍到約50倍，包括約10倍。

因此，上文所提及的脂質(zhì)、丙二醇和甘油濃度將在稀釋后改變。例如，在稀釋度為約10倍的情況下，最終調(diào)配物中的脂質(zhì)濃度降低至上文所述濃度的約1/10。丙二醇和/或甘油濃度將發(fā)生類似降低。

氣體

非水性混合物可與氣體一起提供。例如，非水性混合物可與氣體接觸提供，或其可與氣體提供于同一容器或外殼中但不與氣體接觸(即，非水性混合物及氣體可在物理上彼此分離)。

在此之前尚未得知或預(yù)計(jì)，這些非水性混合物可在室溫下在與例如全氟碳?xì)怏w等氣體接觸的情況下穩(wěn)定長(zhǎng)期存儲(chǔ)。也未得知或預(yù)計(jì)，這些非水性混合物可經(jīng)活化以形成脂質(zhì)封裝的氣體微球。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這些非水性混合物中的某些可用于形成具有足夠數(shù)目及足夠大小(如例如表示為直徑)以在臨床上可用的微球。

氣體優(yōu)選在本文提供的脂質(zhì)調(diào)配物(例如非水性混合物)中大體上不可溶。氣體可為不溶性氟化氣體，例如六氟化硫或全氟碳?xì)怏w。全氟碳?xì)怏w的實(shí)例包括全氟丙烷、全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷?？捎糜诒景l(fā)明微球中的氣體的實(shí)例闡述于美國(guó)專利第5,656,211號(hào)中且以引用方式并入本文中。在重要實(shí)施例中，氣體是全氟丙烷。

氣體實(shí)例包括(但不限于)六氟丙酮、異丙基乙炔、丙二烯、四氟丙二烯、三氟化硼、1,2-丁二烯、1,3-丁二烯、1,2,3-三氯丁二烯、2-氟-1,3-丁二烯、2-甲基-1,3丁二烯、六氟-1,3-丁二烯、丁二炔、1-氟丁烷、2-甲基丁烷、十氟丁烷(全氟丁烷)、十氟異丁烷(全氟異丁烷)、1-丁烯、2-丁烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、全氟-1-丁烯、全氟-1-丁烯、全氟-2-丁烯、4-苯基-3-丁烯-2-酮、2-甲基-1-丁烯-3-炔、硝酸丁酯、1-丁炔、2-丁炔、2-氯-1,1,1,4,4,4-六氟-丁炔、3-甲基-1-丁炔、全氟-2-丁炔、2-溴-丁醛、羰基硫、巴豆腈、環(huán)丁烷、甲基環(huán)丁烷、八氟環(huán)丁烷(全氟環(huán)丁烷)、全氟異丁烷、3-氯環(huán)戊烯、環(huán)丙烷、1,2-二甲基環(huán)丙烷、1,1-二甲基環(huán)丙烷、乙基環(huán)丙烷、甲基環(huán)丙烷、聯(lián)乙炔、3-乙基-3-甲基二氮雜環(huán)丙烷、1,1,1-三氟重氮乙烷、二甲基胺、六氟二甲基胺、二甲基乙基胺、雙-(二甲基膦)胺、2,3-二甲基-2-降冰片烷、全氟-二甲基胺、二甲基氧鎓氯化物、1,3-二氧雜環(huán)戊烷-2-酮、1,1,1,1,2-四氟乙烷、1,1,1-三氟乙烷、1,1,2,2-四氟乙烷、1,1,2-三氯-1,2,2-三氟乙烷、1,1-二氯乙烷、1,1-二氯-1,2,2,2-四氟乙烷、1,2-二氟乙烷、1-氯-1,1,2,2,2-五氟乙烷、2-氯-1,1-二氟乙烷、1-氯-1,1,2,2-四氟-乙烷、2-氯-1,1-二氟乙烷、氯乙烷、氯五氟乙烷、二氯三氟乙烷、氟乙烷、硝基五氟乙烷、亞硝基五氟-乙烷、全氟乙烷、全氟乙基胺、乙基乙烯基醚、1,1-二氯乙烯、1,1-二氯-1,2-二氟-乙烯、1,2-二氟乙烯、甲烷、三氟甲烷磺酰氯、三氟甲烷磺酰氟、(五氟硫基)三氟甲烷、溴-二氟-亞硝基甲烷、溴-氟甲烷、溴-氯-氟甲烷、溴-三氟甲烷、氯-二氟-硝基甲烷、氯-二硝基甲烷、氯-氟甲烷、氯-三氟甲烷、氯-二氟甲烷、二溴-二氟甲烷、二氯-二氟甲烷、二氯-氟甲烷、二氟甲烷、二氟-碘甲烷、二硅基甲烷、氟甲烷、碘甲烷碘-三氟甲烷、硝基-三氟甲烷、亞硝基-三氟甲烷、四氟甲烷、三氯-氟甲烷、三氟甲烷、三氟甲基硫氯、2-甲基丁烷、甲基醚、甲基異丙基醚、乳酸甲酯、亞硝酸甲酯、甲基硫化物、甲基乙烯基醚、新戊烷、氮?dú)?n2)、一氧化二氮、1,2,3-十九烷三甲酸2-羥基三甲酯、1-壬烯-3-炔、氧氣(o2)、氧氣17(¹⁷o2)、1,4-戊二烯、正戊烷、十二氟戊烷(全氟戊烷)、十四氟己烷(全氟己烷)、全氟異戊烷、全氟新戊烷、4-氨基-4-甲基-2-戊酮、1-戊烯、2-戊烯{順式}、2-戊烯{反式}、1-戊烯-3-溴、全氟-1-戊烯、四氯鄰苯二甲酸、2,3,6-三甲基哌啶、丙烷、1,1,1,2,2,3-六氟丙烷、1,2-環(huán)氧基丙烷、2,2二氟丙烷、2-氨基丙烷、2-氯丙烷、七氟-1-硝基丙烷、七氟-1-亞硝基丙烷、全氟丙烷、丙烯、丙基-1,1,1,2,3,3-六氟-2,3二氯、1-氯-丙烯、氯丙烯{反式}、2-氯-丙烯、3-氟-丙烯、全氟丙烯、丙炔、3,3,3-三氟丙炔、3-氟苯乙烯、六氟化硫、硫(二)-十氟(s2f10)、2,4-二氨基甲苯、三氟乙腈、三氟甲基過(guò)氧化物、三氟甲基硫化物、六氟化鎢、乙烯基乙炔、乙烯基醚、氖、氦、氪、氙(尤其富銣超極化氙氣)、二氧化碳、氦和空氣。

氟化氣體(換句話說(shuō)，含有一或多個(gè)氟分子的氣體，例如六氟化硫)、氟碳?xì)怏w(換句話說(shuō)，為氟化碳或氣體的氟化氣體)和全氟碳?xì)怏w(換句話說(shuō)，全氟化的氟碳?xì)怏w，例如全氟丙烷和全氟丁烷)是優(yōu)選的。

由于在產(chǎn)生期間納入空氣，氣體(例如全氟碳?xì)怏w)通常在室溫下是以低于其一般濃度存在。預(yù)期在約一個(gè)大氣壓下，全氟丙烷在存于包含非水性混合物和氣體頂隙的小瓶中時(shí)的濃度為約6.52mg/ml。如業(yè)內(nèi)已知的其它氣體的濃度會(huì)由于在產(chǎn)生期間納入空氣而經(jīng)類似稀釋。

本發(fā)明涵蓋，不論與例如全氟碳?xì)怏w等氣體接觸還是物理分離，本文所提供的非水性混合物可存儲(chǔ)在約4℃到約40℃、約4℃到約30℃、約4℃到約25℃、約10℃到約40℃、約15℃到約40℃或約15℃到約30℃范圍內(nèi)的溫度下。

本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋，不論與例如全氟碳?xì)怏w等氣體接觸還是物理分離，本文所提供的非水性混合物可存儲(chǔ)約1個(gè)月到約6個(gè)月、約1個(gè)月到約1年或約1個(gè)月到約2年。因此，作為非限制性實(shí)例，不論與例如全氟碳?xì)怏w等氣體接觸還是物理分離，本文所提供的非水性混合物可在介于約15℃到約30℃范圍內(nèi)的溫度下存儲(chǔ)約1個(gè)月到約2年。

容器及室配置

非水性混合物可在容器(或外殼)中提供。容器可為單一室或多室容器，例如(但不限于)雙室容器。

在一些實(shí)施例中，容器是小瓶。小瓶可由任一材料制得，包括(但不限于)玻璃或塑料。玻璃可為醫(yī)藥級(jí)玻璃。容器可經(jīng)塞子(例如橡膠塞)密封。在一些實(shí)施例中，容器是0.5-10ml容器。容器可為1-5ml容器、或1或2ml容器。所述體積是指通常置入容器中的液體的體積(稱為液體填充體積)。此是與容器的整個(gè)內(nèi)部體積相比，所述內(nèi)部體積可高于所述液體填充體積。液體填充體積和內(nèi)部體積的實(shí)例如下：具有2.9ml內(nèi)部體積的肖特2ml(液體填充體積)小瓶；具有4.5ml內(nèi)部體積的肖特3ml(液體填充體積)小瓶；和具有1.2ml內(nèi)部體積的惠頓1ml(液體填充體積)v形小瓶。

如在本發(fā)明上下文中將理解，容器的內(nèi)部體積可由非水性混合物及氣體占據(jù)。適宜容器的實(shí)例是惠頓2ml玻璃小瓶(可自例如尼普洛購(gòu)得，目錄號(hào)2702,b33ba,2cc,13mm，i型，燧石管瓶)，其具有約3.75ml的實(shí)際內(nèi)部體積。適宜塞子的實(shí)例是韋斯特(west)灰色丁基凍干(butyllyo)矽化塞(目錄號(hào)v50,4416/50,13mm)。適宜密封件的實(shí)例是韋斯特翻轉(zhuǎn)式(flip-off)鋁密封件(目錄號(hào)3766，白色，13mm)。容器優(yōu)選無(wú)菌和/或在引入脂質(zhì)溶液和/或氣體后經(jīng)滅菌，如公開的pct申請(qǐng)案wo99/36104中所述。

在一些實(shí)施例中，容器是平底容器，例如平底小瓶。適宜小瓶包括平底硼硅酸鹽小瓶，包括惠頓小瓶。在一些實(shí)施例中，容器是非平底容器或小瓶。在一些實(shí)施例中，容器是v形底容器，例如v形底小瓶。在一些實(shí)施例中，容器是圓底容器，例如圓底小瓶。在一些實(shí)施例中，容器具有收斂式壁，使得其底部表面積(或底部表面直徑)小于其頂部(開口)表面積(或直徑)或小于其之間的任一直徑(例如，體直徑)。為明晰起見(jiàn)，v形底容器或小瓶具有收斂式壁，且其底部表面積顯著小于其頂部或體表面積中的任一者。

在一些實(shí)施例中，容器是注射器。非水性混合物可于預(yù)填充注射器中、任選地與氣體物理接觸來(lái)提供。

在一些實(shí)施例中，容器是單一室容器，例如小瓶。在此一單一室中，非水性混合物及氣體若存在，可彼此物理接觸。

在一些實(shí)施例中，容器包含兩個(gè)或更多個(gè)室。兩個(gè)室的內(nèi)容物例如在存儲(chǔ)期間彼此物理分離。然而，在使用時(shí)，兩個(gè)室的內(nèi)容物組合并摻和。因此，容器進(jìn)一步包含屏障，所述屏障物理分離第一室與第二室的內(nèi)容物，但最終可經(jīng)“去除”以組合彼等內(nèi)容物。本發(fā)明涵蓋去除所述屏障的任何可能方式，包括壓力、機(jī)械穿刺或穿孔、溶解等。

雙室裝置(例如雙室注射器或雙室管)為業(yè)內(nèi)已知且可自市場(chǎng)購(gòu)得。非限制性實(shí)例包括維特(vetter)雙室注射器及紐派克(neopak)雙室管。

在一些實(shí)施例中，由一或多種脂質(zhì)、丙二醇、或甘油、或丙二醇/甘油及非磷酸鹽緩沖劑組成或基本上由其組成的非水性混合物是在例如單一室容器等容器中提供。此一混合物可提供有或不提供有例如全氟碳?xì)怏w等氣體。若與氣體一起提供，則所述氣體可與非水性混合物在同一室中或在多室容器的單獨(dú)室中，如下文所提供。

容器可具有兩個(gè)室，其中第一室包含含有丙二醇和甘油或丙二醇或甘油中的脂質(zhì)(例如dppa、dppc和peg5000-dppe)的非水性混合物，且第二室包含氣體，例如全氟碳?xì)怏w。非水性混合物可包含緩沖劑，例如非磷酸鹽緩沖劑。

在另一實(shí)施例中，容器可具有兩個(gè)室，其中第一室包含

(i)非水性混合物，其包含

(a)脂質(zhì)，例如dppa、dppc和peg5000-dppe，及

(b)丙二醇和甘油或丙二醇或甘油，且

(ii)氣體，例如全氟碳?xì)怏w，且第二室包含水性稀釋劑。

非水性混合物可包含緩沖劑，例如非磷酸鹽緩沖劑?；蛘?，水溶液可包含緩沖劑，例如磷酸鹽緩沖劑。

在另一實(shí)施例中，容器可具有兩個(gè)室，其中第一室包含

(i)非水性混合物，其包含

(a)脂質(zhì)，例如dppa、dppc和peg5000-dppe，及

(b)丙二醇和甘油或丙二醇或甘油，且

第二室包含

(i)水性稀釋劑，及

(ii)氣體，例如全氟碳?xì)怏w。

在另一實(shí)施例中，容器可具有至少三個(gè)室，其中第一室包含含有丙二醇或甘油或丙二醇和甘油中的dppa、dppc和peg5000-dppe的非水性混合物，第二室包含氣體(例如全氟碳?xì)怏w)，且第三室包含水溶液。

在另一實(shí)施例中，容器可包含第一室，其包含含有脂質(zhì)及丙二醇的非水性混合物；和第二室，其包含甘油。在另一實(shí)施例中，容器可包含第一室，其包含含有脂質(zhì)及甘油的非水性混合物；和第二室，其包含丙二醇。

水性稀釋劑可包含鹽，例如(但不限于)氯化鈉，且因此可被視為鹽水溶液。水性稀釋劑可包含緩沖劑，例如磷酸鹽緩沖劑，且因此可被視為緩沖水性稀釋劑。水性稀釋劑可為緩沖鹽水溶液。非水性混合物可包含緩沖劑，例如非磷酸鹽緩沖劑，其實(shí)例提供于本文中。非水性混合物及水性稀釋劑可均包含緩沖劑。在典型實(shí)施例中，非水性混合物或水性稀釋劑包含緩沖劑，或二者皆不包含緩沖劑。緩沖劑濃度將視所用緩沖劑類型而變，如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可理解且其可熟練確定。非水性脂質(zhì)調(diào)配物中的緩沖劑濃度可在約1mm到約100mm的范圍內(nèi)。在一些情況下，緩沖劑濃度可為約1mm到約50mm、或約1mm到約20mm、或約1mm到約10mm、或約1mm到約5mm，包括約5mm。

通常欲靜脈內(nèi)投與個(gè)體(包括人類個(gè)體)的最終調(diào)配物的ph可在4-8范圍內(nèi)或在4.5-7.5范圍內(nèi)。在一些情況下，所述ph可在約6到約7.5范圍內(nèi)，或在6.2到約6.8范圍內(nèi)。在其它情況下，ph可為約6.5(例如，6.5+/-0.5或+/-0.3)。在一些情況下，ph可在5到6.5的范圍內(nèi)或在5.2到6.3的范圍內(nèi)或在5.5到6.1的范圍內(nèi)或在5.6到6的范圍內(nèi)或在5.65到5.95的范圍內(nèi)。在另一情況下，ph可在約5.7到約5.9的范圍內(nèi)(例如，所述范圍的任一端點(diǎn)或兩個(gè)端點(diǎn)+/-0.1或+/-0.2或+/-0.3)。在另一情況下，ph可為約5.8(例如，5.8+/-0.15或5.8+/-0.1)。

在一些實(shí)施例中，水性稀釋劑包含甘油、緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖劑)、鹽及水。此一水性稀釋劑可與缺少甘油的非水性混合物一起使用。在一些實(shí)施例中，脂質(zhì)溶液進(jìn)一步以8:1的重量比包含鹽水(組合的鹽和水)及甘油。

在一些實(shí)施例中，水性稀釋劑包含丙二醇、緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖劑)、鹽及水。此一水性稀釋劑可與缺少丙二醇的非水性混合物一起使用。

在一些實(shí)施例中，水性稀釋劑包含緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖劑)、鹽及水。此一水性稀釋劑可與包含丙二醇和甘油二者的非水性混合物一起使用。

本文提供包含將脂質(zhì)與丙二醇的非水性混合物及氣體置入容器中的方法、包含將脂質(zhì)與甘油的非水性混合物及氣體置入容器中的方法及包含將脂質(zhì)與丙二醇和甘油的非水性混合物及氣體置入容器中的方法。在這些方法中的任一者中，可經(jīng)由頂隙氣體的交換將氣體置入容器中。適于此目的的氣體交換器為業(yè)內(nèi)已知。氣體交換裝置的實(shí)例是凍干室。然后可將所述容器于約10℃到約50℃、或約15℃到約40℃或約20℃到約30℃下存儲(chǔ)長(zhǎng)達(dá)2年、或1到12個(gè)月或1-30天。在另一方面中，容器可提供有用于在前述溫度下任選地存儲(chǔ)前述時(shí)間段的說(shuō)明書，或另一選擇為缺少用于在4℃下或在冷凍下存儲(chǔ)的說(shuō)明書。

本文提供一種方法，其包含組合包含脂質(zhì)于丙二醇中的非水性溶液和全氟碳?xì)怏w的第一組合物與包含水性稀釋劑的第二組合物；一種方法，其包含組合包含脂質(zhì)于甘油中的非水性溶液和全氟碳?xì)怏w的第一組合物與包含水性稀釋劑的第二組合物；及一種方法，其包含組合包含脂質(zhì)于丙二醇和甘油中的非水性溶液和全氟碳?xì)怏w的第一組合物與包含水性稀釋劑的第二組合物。

第一組合物和第二組合物可分別于容器的第一室和第二室中提供，且組合可包含使第一室與第二室之間的密封件破裂。第一組合物可于小瓶中提供，且第二組合物可于注射器中提供，且將注射器的內(nèi)容物添加至小瓶的內(nèi)容物中?；蛘撸诙M合物可于小瓶中提供，且第一組合物可于注射器中提供，且將注射器的內(nèi)容物添加至小瓶的內(nèi)容物中。

應(yīng)理解，前述實(shí)施例的任一組合或變化形式涵蓋并包括于本發(fā)明中，且除非明確指示，否則前述實(shí)例不打算視為限制性。

任一前述容器實(shí)施例可在具有或不具有額外外殼的情況下提供有用于在高于4℃的溫度下(或無(wú)冷凍)存儲(chǔ)的說(shuō)明書，或提供有與存儲(chǔ)溫度無(wú)關(guān)的說(shuō)明書。應(yīng)理解，本文所提供的調(diào)配物可存儲(chǔ)于4℃下，但并未要求將其存儲(chǔ)于此溫度下。說(shuō)明書可進(jìn)一步敘述長(zhǎng)期存儲(chǔ)，例如存儲(chǔ)幾天、幾個(gè)月或甚至幾年，且可進(jìn)一步敘述在室溫下或大約在室溫下(例如，18-25℃)長(zhǎng)期存儲(chǔ)。

在一些實(shí)施例中，組合物在容器(例如小瓶)中，且所述容器經(jīng)標(biāo)記。容器可具有附著到其一或多個(gè)外表面的標(biāo)記。所述標(biāo)記可為紙質(zhì)標(biāo)記或肉眼可見(jiàn)且最終用戶在沒(méi)有其它幫助或裝置的情況下能閱讀并理解的其它此類標(biāo)記?；蛘?，標(biāo)記可為機(jī)器可讀或裝置可讀標(biāo)記。機(jī)器可讀或裝置可讀標(biāo)記的實(shí)例包括磁條、芯片、條碼(線性、矩陣及2d條碼)、無(wú)線射頻識(shí)別(rfid)標(biāo)簽等。例如線性條碼等條碼可為符合或滿足統(tǒng)一代碼委員會(huì)(uniformcodecouncil)標(biāo)準(zhǔn)或保健業(yè)商務(wù)通信委員會(huì)(healthindustrybusinesscommunicationscouncil)標(biāo)準(zhǔn)者。所述標(biāo)記可繼而自例如以下等裝置讀?。捍艞l讀取器、芯片讀取器、條碼掃描儀或讀取器、rfid標(biāo)簽讀取器等。實(shí)際上，已用于鑒定和/或“跟蹤與追蹤(trackandtrace)”目的的任何標(biāo)記技術(shù)均可結(jié)合本文所提供的容器來(lái)使用。

標(biāo)記可為最終用戶或容器的中間處置者提供多種信息，包括(但不限于)其中所含組合物的來(lái)源和/或生產(chǎn)者，包括(例如)制備組合物和/或產(chǎn)生組合物的組份的公司或子公司的名稱、制備組合物的日期、制備組合物的物理位置、運(yùn)送容器的日期、容器的處理(包括例如是否將其存儲(chǔ)于遠(yuǎn)端位置及所述存儲(chǔ)的條件及時(shí)長(zhǎng))、遞送容器的日期、遞送方式、如fda所規(guī)定的國(guó)家藥品代碼(nationaldrugcode，ndc)、容器的內(nèi)容物、使用劑量及方法(包括投與途徑)等。

標(biāo)記可用于一或多種目的，包括例如容器及其中所含組合物的鑒定。鑒定意指將容器識(shí)別或標(biāo)記為源于授權(quán)方且已由授權(quán)方制備的能力，且其容許最終用戶或另一方識(shí)別源于另一未授權(quán)方的容器及組合物。標(biāo)記也可用于對(duì)容器進(jìn)行跟蹤及追蹤。此特征可用于在生產(chǎn)后且直到投與個(gè)體的點(diǎn)跟蹤容器及其中所含組合物。就此而言，容器在所述時(shí)間段期間的移動(dòng)可存儲(chǔ)于數(shù)據(jù)庫(kù)中，且任選地最終用戶可存取所述數(shù)據(jù)庫(kù)以確保組合物的完整性。

標(biāo)記也可為組合標(biāo)記，此意味著其可含有使用兩種不同模式讀取的信息。例如，標(biāo)記可含有對(duì)于肉眼顯而易見(jiàn)且可理解的信息(例如，其可以言語(yǔ)列舉生產(chǎn)者的名稱)及其它機(jī)器可讀取的信息，例如rfid嵌入信息或條碼嵌入信息。

標(biāo)記也可為雙重用途標(biāo)記，此意味著其可用于兩種或更多種目的。例如，標(biāo)記可含有識(shí)別組合物的信息及識(shí)別制造商和/或制造日期的其它信息。此信息可以相同格式或使用不同格式傳遞(例如，一種信息可以rfid標(biāo)記提供且另一種信息可以條碼標(biāo)記提供)。

標(biāo)記可提供對(duì)于人類可見(jiàn)且可理解的內(nèi)容，例如制造商名稱?；蛘呋蛄硗猓瑯?biāo)記可含有盡管對(duì)于人眼易見(jiàn)但在缺少必須參照的查找表或其它形式的數(shù)據(jù)庫(kù)的情形下不提供有意義信息的信息。所述信息可例如作為α-數(shù)字代碼來(lái)提供。

活化

前述組合物中的任一者可用于形成脂質(zhì)封裝的氣體微球，其進(jìn)而可用作超聲對(duì)比劑。如本文所用，脂質(zhì)封裝的氣體微球是內(nèi)部體積主要為氣體且由脂質(zhì)殼封裝的球體。脂質(zhì)殼可呈單層或雙層布置，包括單層或多層雙層。所述微球可用作超聲對(duì)比劑。

微球是從非水性混合物經(jīng)由活化工藝生成。如本文中更詳細(xì)闡述，活化是指出于產(chǎn)生脂質(zhì)封裝的氣體微球的目的劇烈振蕩脂質(zhì)溶液(例如非水性溶液)。活化通常產(chǎn)生至少1×10⁷個(gè)微球/ml溶液、5×10⁷個(gè)微球/ml溶液、或至少7.5×10⁷個(gè)微球/ml溶液、或至少1×10⁸個(gè)微球/ml溶液或約1×10⁹個(gè)微球/ml溶液。

本發(fā)明涵蓋，本文提供的某些非水性混合物可用于在氣體存在下形成脂質(zhì)封裝的氣體微球。意外的是，這些非水性混合物可被活化。

活化可通過(guò)劇烈攪動(dòng)來(lái)實(shí)施，包括振蕩定義的時(shí)間段。如上所述，活化可在水性稀釋劑存在或不存在下進(jìn)行。如本文所用，活化定義為攪動(dòng)脂質(zhì)溶液使得氣體自頂隙引入脂質(zhì)溶液中的運(yùn)動(dòng)。任何類型的攪動(dòng)脂質(zhì)溶液且導(dǎo)致引入氣體的運(yùn)動(dòng)均可用于振蕩。攪動(dòng)必須具有足夠力以容許在一段時(shí)間后形成泡沫。優(yōu)選地，攪動(dòng)具有足夠力，使得在短時(shí)間段內(nèi)(例如30分鐘，且優(yōu)選在20分鐘內(nèi)，且更優(yōu)選在10分鐘內(nèi))形成泡沫。在一些實(shí)施例中，活化可在少于5分鐘、少于4分鐘、少于3分鐘、少于2分鐘內(nèi)、在約75秒、少于1分鐘內(nèi)或在約45秒內(nèi)進(jìn)行。攪動(dòng)可通過(guò)微乳化、通過(guò)微流化來(lái)進(jìn)行，例如渦漩(例如通過(guò)渦旋)、側(cè)向或上下運(yùn)動(dòng)。不同類型的運(yùn)動(dòng)可組合。攪動(dòng)可通過(guò)振蕩容納脂質(zhì)溶液的容器來(lái)進(jìn)行，或通過(guò)振蕩容器內(nèi)的脂質(zhì)溶液而不振蕩容器自身來(lái)進(jìn)行。此外，振蕩可手動(dòng)或通過(guò)機(jī)器進(jìn)行?？墒褂玫臋C(jī)械振蕩器包括(例如)振蕩臺(tái)(例如vwr科技(scientific)(加利福尼亞州喜瑞都(cerritos,calif.))振蕩臺(tái))、微流化器wig-l-bug^tm(新月牙科制造公司(crescentdentalmanufacturing,inc.),伊利諾依州萊昂斯(lyons,ill.))和機(jī)械油漆混合器或?qū)嵗?2中所述的任何裝置。劇烈振蕩定義為至少約60次振蕩運(yùn)動(dòng)/分鐘。此在一些情況下是優(yōu)選的。以至少1000轉(zhuǎn)/分鐘渦旋是劇烈振蕩的實(shí)例且在一些情況下更優(yōu)選。以1800轉(zhuǎn)/分鐘渦旋在一些情況下甚至更優(yōu)選。

闡述于美國(guó)專利第6,039,557號(hào)中。容器(例如小瓶)可使用充分?jǐn)噭?dòng)上文所列舉的時(shí)間范圍，包括例如45秒。使用活化可進(jìn)行少于1分鐘或更久，包括30秒、45秒、60秒、75秒、90秒、105秒、120秒或更久。

活化方法的其它實(shí)例提供于實(shí)例12中。

包含脂質(zhì)及丙二醇和甘油的非水性混合物可在氣體存在下在不添加其它溶液的情況下活化?；蛘?，此混合物可首先與水性稀釋劑組合，然后在氣體存在下活化。

包括脂質(zhì)及丙二醇的非水性混合物可首先與甘油組合，且任選地與水性稀釋劑組合，然后在氣體存在下活化。

包含脂質(zhì)及甘油的非水性混合物可首先與丙二醇組合，且任選地與水性稀釋劑組合，然后在氣體存在下活化。

在其它情況下，呈固體形式的脂質(zhì)無(wú)論是否作為脂質(zhì)摻合物均可溶解于單獨(dú)的丙二醇或單獨(dú)的甘油中，或溶解于丙二醇和甘油中，或溶解于丙二醇、甘油及水性稀釋劑中，所述水性稀釋劑可進(jìn)而包含鹽及緩沖劑。這些混合物中的任一者可在使用前經(jīng)活化，且在一些情況下，可進(jìn)一步經(jīng)水性稀釋劑稀釋。

因此，本文提供包含脂質(zhì)封裝的氣體微球的組合物，所述微球包含dppa、dppc和peg5000-dppe和全氟碳?xì)怏w且在包含丙二醇和甘油的非水性混合物中；包含脂質(zhì)封裝的氣體微球的組合物，所述微球包含dppa、dppc和peg5000-dppe和全氟碳?xì)怏w且在包含丙二醇的非水性混合物中；和包含脂質(zhì)封裝的氣體微球的組合物，所述微球包含dppa、dppc和peg5000-dppe和全氟碳?xì)怏w且在包含甘油的非水性混合物中。

本發(fā)明還涵蓋在水性稀釋劑(例如但不限于水性緩沖鹽水溶液)存在下形成微球。水性稀釋劑可包含鹽、緩沖劑、丙二醇、甘油及水。

在一些實(shí)施例中，包含脂質(zhì)封裝的氣體微球的活化組合物可以8:1:1的重量％比率包含鹽水、甘油及丙二醇。

一旦形成，微球可稀釋于水性稀釋劑中，然后投與個(gè)體。水性鹽水溶液通常將為醫(yī)藥上可接受的且可缺少防腐劑(本文中稱作無(wú)防腐劑)。水性稀釋劑可為鹽水溶液(即，其可含有鹽，例如(但不限于)氯化鈉)和/或其可含有緩沖劑，例如(但不限于)磷酸鹽緩沖劑。

脂質(zhì)封裝的氣體微球可稀釋約5到約50倍或約35到約45倍。經(jīng)稀釋脂質(zhì)封裝的氣體微球可通過(guò)濃注或連續(xù)輸注至需要超聲波對(duì)比成像的個(gè)體中來(lái)投與。

微球的平均直徑在微米范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，微球的平均直徑在約1.0微米到約2.0微米或約1.2微米到約1.8微米范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，微球的平均直徑為約1.6微米。

在一些實(shí)施例中，大部分微球的直徑可在約1.0微米到約3.0微米、或約1.0微米到約2.0微米、或約1.2微米到約2.0微米范圍內(nèi)，優(yōu)選在約1.2微米到約1.8微米范圍內(nèi)。大部分微球意指至少50％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少80％且甚至更優(yōu)選至少90％的所測(cè)量的組合物中脂質(zhì)封裝的氣體微球。在一些實(shí)施例中，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、至少90％、或至少95％的組合物中所檢測(cè)脂質(zhì)封裝的氣體微球的直徑在前述范圍中的任一范圍內(nèi)。

平均直徑代表組合物中所有所檢測(cè)微球的平均直徑。微球直徑通常是使用業(yè)內(nèi)已知且可得的儀器來(lái)測(cè)量，包括(但不限于)莫爾文(malvern)fpia-3000希森美康(sysmex)粒徑分析儀。如業(yè)內(nèi)將可理解，所述儀器通常對(duì)于下限及上限二者均具有截止大小。此意味著，不計(jì)數(shù)分別低于或高于這些截止值的微球(且不包括于微球濃度計(jì)算中)且不測(cè)量其直徑(且在確定微球的平均直徑時(shí)不考慮)。實(shí)例中所用儀器具有1.0微米下限截止值及40.0微米上限截止值。使用1.0微米下限截止值及40.0微米上限截止值計(jì)數(shù)或檢測(cè)的大部分微球的直徑在1.0至20.0微米范圍內(nèi)。應(yīng)理解，本發(fā)明使用可互換地術(shù)語(yǔ)微球大小及微球直徑。因此，除非另外規(guī)定，否則微球大小是指微球直徑。

本文提供的組合物(包括經(jīng)活化組合物)可進(jìn)一步包含其它成份，例如穩(wěn)定材料或穩(wěn)定劑、粘度改質(zhì)劑、張力劑、涂布劑及懸浮劑。各類試劑的實(shí)例為業(yè)內(nèi)已知且提供于例如以下文獻(xiàn)中：美國(guó)專利第5,656,211號(hào)、公開的pct申請(qǐng)案wo99/36104和公開的美國(guó)申請(qǐng)案us2013/0022550。

本文提供的組合物(包括經(jīng)活化組合物)可包含一或多種緩沖劑，包括(但不限于)乙酸鹽緩沖劑、苯甲酸鹽緩沖劑、水楊酸鹽緩沖劑和/或磷酸鹽緩沖劑。

組合物的ph可為約6.2到約6.8。在一些情況下，ph可在5到6.5的范圍內(nèi)或在5.2到6.3的范圍內(nèi)或在5.5到6.1的范圍內(nèi)或在5.6到6的范圍內(nèi)或在5.65到5.95的范圍內(nèi)。在另一情況下，ph可在約5.7到約5.9的范圍內(nèi)(例如，所述范圍的任一端點(diǎn)或兩個(gè)端點(diǎn)+/-0.1或+/-0.2或+/-0.3)。在另一情況下，ph可為約5.8(例如，5.8+/-0.15或5.8+/-0.1)。所述范圍可使用例如稀釋于水中的乙酸鹽緩沖調(diào)配物來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在一些實(shí)施例中，每ml最終組合物(在用水性稀釋劑稀釋非水性溶液后)包含于水中的0.75mg脂質(zhì)(由0.045mgdppa、0.401mgdppc和0.304mgdppe-peg5000組成)、103.5mg丙二醇、126.2mg甘油、2.34mg磷酸二氫鈉一水合物、2.16mg磷酸氫二鈉七水合物和4.87mg氯化鈉。

在一些實(shí)施例中，每ml最終組合物包含于水中的約0.43mg脂質(zhì)(由0.0225mgdppa、0.2mgdppc和0.152mgdppe-peg5000組成)、103.5mg丙二醇、126.2mg甘油、2.34mg磷酸二氫鈉一水合物、2.16mg磷酸氫二鈉七水合物和4.87mg氯化鈉。

在一些實(shí)施例中，每ml最終組合物(在用鹽水稀釋非水性溶液后)包含于水中的0.75mg脂質(zhì)(由0.045mgdppa、0.401mgdppc和0.304mgdppe-peg5000組成)、103.5mg丙二醇、126.2mg甘油、0.074mg乙酸鈉、0.006mg乙酸和7.20mg氯化鈉。

雜質(zhì)及穩(wěn)定性

本發(fā)明進(jìn)一步提供評(píng)價(jià)脂質(zhì)溶液(例如非水性溶液)中的雜質(zhì)含量的方法。此一方法包含使用多種分析方法中的任一種分析脂質(zhì)溶液中雜質(zhì)的存在，例如(但不限于)任選地與一或多種分離技術(shù)(例如hplc)耦聯(lián)的荷電氣溶膠檢測(cè)(cad)。脂質(zhì)溶液可為包含脂質(zhì)及丙二醇或甘油或丙二醇和甘油的非水性溶液。脂質(zhì)溶液可進(jìn)一步包含緩沖劑，例如非磷酸鹽緩沖劑。脂質(zhì)溶液可進(jìn)一步包含鹽和/或水。雜質(zhì)的存在高于臨限值可表示，脂質(zhì)溶液未經(jīng)適當(dāng)存儲(chǔ)，其穩(wěn)定性已降低，且因此脂質(zhì)溶液應(yīng)被丟棄且不應(yīng)投與個(gè)體。此一方法可用于質(zhì)量控制目的。

實(shí)例2提供測(cè)量非水性溶液中的雜質(zhì)含量的方法。雜質(zhì)含量是作為相對(duì)于輸入(或理論或標(biāo)稱)脂質(zhì)量的雜質(zhì)％來(lái)提供，意指雜質(zhì)是以假定脂質(zhì)無(wú)損失時(shí)占所存在脂質(zhì)總量的百分比表示。

改質(zhì)脂質(zhì)調(diào)配物在室溫下存儲(chǔ)一段時(shí)間(包括例如約1個(gè)月、約2個(gè)月、約3個(gè)月、約6個(gè)月或更久，包括約1年或約2年)時(shí)，其可包含少于10％、少于5％或少于2％雜質(zhì)。

重要的是，在兩種調(diào)配物均存儲(chǔ)于室溫下時(shí)(即，當(dāng)組合物及存儲(chǔ)于室溫下時(shí))，經(jīng)改質(zhì)脂質(zhì)調(diào)配物包含的雜質(zhì)可少于此雜質(zhì)含量的降低可為約1％、約2％、約3％、約4％、或約5％或更大的差異。

用途及應(yīng)用

本發(fā)明提供使用微球及微球組合物的方法。微球打算作為超聲對(duì)比劑，且其可用于人類或非人類個(gè)體的活體內(nèi)或活體外。本發(fā)明組合物可用于診斷或治療目的或用于組合的診斷及治療目的。

在用作用于人類個(gè)體的超聲對(duì)比劑時(shí)，組合物如本文所述來(lái)活化以形成足量微球，任選地將其稀釋為較大體積，并以一或多次濃注注射或通過(guò)連續(xù)輸注來(lái)投與。投與通常是靜脈內(nèi)注射。然后在之后不久實(shí)施成像。成像應(yīng)用可針對(duì)心臟或其可涉及對(duì)超聲波成像敏感的另一身體區(qū)域。成像可為身體一或多個(gè)器官或區(qū)域的成像，包括(但不限于)心臟、血管、心血管系統(tǒng)及肝。

本發(fā)明的個(gè)體包括(但不限于)人類及動(dòng)物。人類在一些情況下是優(yōu)選的。

脂質(zhì)組合物是以有效量投與。有效量將為促進(jìn)或引起既定活體內(nèi)反應(yīng)和/或應(yīng)用的量。在成像應(yīng)用(例如超聲波應(yīng)用)情況中，有效量可為脂質(zhì)微球的容許個(gè)體或個(gè)體區(qū)域成像的量。

實(shí)例

實(shí)例1.樣品制備

使用fda批準(zhǔn)的市售超聲對(duì)比劑(蘭索斯醫(yī)療成像(lantheusmedicalimaging))進(jìn)行比較。每個(gè)小瓶含有以下物質(zhì)：于注射用水中的103.5mg/ml丙二醇、126.2mg/ml甘油、和2.34mg/ml磷酸二氫鈉一水合物、2.16mg/ml磷酸氫二鈉七水合物和4.87mg/ml氯化鈉的基質(zhì)中的1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(dppc；0.401mg/ml)、1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷脂酸(dppa；0.045mg/ml)和n-(甲氧基聚乙二醇5000氨甲酰基)-1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(mpeg5000dppe；0.304mg/ml)。ph為6.2-6.8。在2cc惠頓玻璃小瓶中，脂質(zhì)溶液的標(biāo)稱填充體積為約1.76ml，所述小瓶的近似體積為3.80ml，且因此頂隙為約2.04ml并含有全氟丙烷氣體(pfp,6.52mg/ml)。

新穎調(diào)配物是如下制備：

如專利us8084056中所述制備含有dppc、dppa、mpeg500dppe的脂質(zhì)摻合物(lb)，此專利的內(nèi)容以引用方式并入本文中且可用于本發(fā)明方法中。lb的調(diào)配物是通過(guò)在55℃下將lb粉末混合于丙二醇(pg)、或1:1v/v丙二醇/甘油(pg/g)或甘油媒劑中來(lái)制備。在一些研究中，將以90/10、75/25、50/50、25/79和10/90的鹽:酸比率制備的0.005m乙酸鹽、苯甲酸鹽或水楊酸鹽緩沖劑溶解于媒劑中。在一些情況下，磷酸鹽緩沖劑包括于水溶液或鹽水溶液中。

實(shí)例2.脂質(zhì)穩(wěn)定性

將來(lái)自實(shí)例1的于丙二醇中的新穎調(diào)配物脂質(zhì)摻合物樣品置入2cc惠頓玻璃小瓶中，用pfp氣體替代頂隙，插入韋斯特灰色丁基凍干塞且將小瓶用鋁密封件卷邊(crimp)。將小瓶存儲(chǔ)于25℃環(huán)境室中以代表室溫存儲(chǔ)，或在干燥烘箱中加熱至130℃以代表最終滅菌。在適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)，自存儲(chǔ)去除樣品小瓶，去卷邊，將鹽水添加至小瓶并混合以確保均勻溶液。將樣品轉(zhuǎn)移到hplc小瓶并通過(guò)反相hplc分離和電暈荷電氣溶膠檢測(cè)(cad；具有荷電氣溶膠檢測(cè)的hplc用于測(cè)量不同脂質(zhì)類型(hplcwithchargedaerosoldetectionforthemeasurementofdifferentlipidclasses),i.n.阿克沃思(i.n.acworth)、p.h.加馬奇(p.h.gamache)、r.麥卡錫(r.mccarthy)和d.阿薩(d.asa),esa生物科技公司(esabiosciencesinc.),美國(guó)馬薩諸塞州切姆斯福德(chelmsford,ma,usa)；j.瓦拉斯卡(j.waraska)和i.n.阿克沃思,美國(guó)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室(americanbiotechnologylaboratory),2008年1月)分析雜質(zhì)。

提供在25℃下存儲(chǔ)3個(gè)月的小瓶的結(jié)果以供比較。分析使用梯度反相hplc及蒸發(fā)光散射檢測(cè)(elsd)，使用c18管柱及含有以下的移動(dòng)相：水、甲醇、乙酸銨及三乙胺。表1及2提供作為在25℃及130℃下小瓶中的總脂質(zhì)含量百分比的總雜質(zhì)。

表1.存儲(chǔ)于25℃下的于丙二醇(pg)調(diào)配物中的脂質(zhì)摻合物(lb)的雜質(zhì)數(shù)據(jù).

*177mg含有l(wèi)b的pg(0.72wt％lb；lb:pg的比率為1:138)。

表2.在130℃下處理30分鐘的于丙二醇(pg)調(diào)配物中的脂質(zhì)摻合物(lb)和的雜質(zhì)數(shù)據(jù)

*89mg含有l(wèi)b的pg(0.72wt％lb；lb:pg的比率為1:138)。

**177mg含有l(wèi)b的pg(0.36wt％lb；lb:pg的比率為1:276)。

圖1圖解說(shuō)明在2-8℃和25℃下和7.5mglb/mlpg在25℃下隨時(shí)間而變的總雜質(zhì)含量。存儲(chǔ)于2-8℃下的中的總雜質(zhì)含量與存儲(chǔ)于25℃下的7.5mglb/mlpg調(diào)配物類似。然而，在將存儲(chǔ)于25℃下時(shí)，總雜質(zhì)含量顯著增加。

這些數(shù)據(jù)展示，在較高溫度下，7.5mglb/mlpg調(diào)配物遠(yuǎn)比調(diào)配物更穩(wěn)健。此觀察是意想不到的。

實(shí)例3.脂質(zhì)摻合物/丙二醇/甘油(lb/pg/g)調(diào)配物的穩(wěn)定性

將于1:1(v:v)丙二醇/甘油中的來(lái)自實(shí)例1的新穎調(diào)配物脂質(zhì)摻合物樣品填充至2cc惠頓玻璃小瓶中，頂隙經(jīng)pfp氣體替代，插入韋斯特灰色丁基凍干塞，且將小瓶用鋁密封件卷邊。將小瓶存儲(chǔ)于25℃環(huán)境室中以代表室溫存儲(chǔ)，或在烘箱中加熱至130℃以代表最終滅菌。如實(shí)例2中所述制備并分析存儲(chǔ)于25℃下的小瓶。如實(shí)例2中所述制備在130℃下加熱的小瓶，但如實(shí)例2中針對(duì)所述使用hplc系統(tǒng)來(lái)分析。表3及4提供作為在25℃及130℃下的小瓶中的總脂質(zhì)含量百分比的總雜質(zhì)。提供如實(shí)例2中所述分析的的結(jié)果以供比較。

表3.存儲(chǔ)于25℃下的于pg/g調(diào)配物中的3.75mg脂質(zhì)摻合物(lb)/ml的雜質(zhì)數(shù)據(jù)

*391mg含有l(wèi)b的pg/g(0.33wt％lb:44.9wt％pg:54.8wt％g；lb:pg:g的比率為1:138:168)。

表4.在130℃下處理30分鐘的于pg/g調(diào)配物中的脂質(zhì)摻合物(lb)和的雜質(zhì)數(shù)據(jù)

*391mg含有l(wèi)b的pg/g(0.33wt％lb:44.9wt％pg:54.8wt％g；lb:pg:g的比率為1:138:168)。

圖2圖解說(shuō)明存儲(chǔ)于2-8℃和25℃下的和存儲(chǔ)于25℃下的3.75mglb/mlpg/g調(diào)配物隨時(shí)間而變的總雜質(zhì)含量。存儲(chǔ)于2-8℃下的中的總雜質(zhì)含量與存儲(chǔ)于25℃下的3.75mglb/mlpg/g調(diào)配物類似。然而，在將存儲(chǔ)于25℃下時(shí)，總雜質(zhì)含量顯著增加。

這些數(shù)據(jù)展示，在較高溫度下，3.75mglb/mlpg/g調(diào)配物遠(yuǎn)比調(diào)配物更穩(wěn)健。此觀察是意想不到的。

實(shí)例4.緩沖脂質(zhì)摻合物/丙二醇/甘油調(diào)配物的穩(wěn)定性

將于含有0.005m乙酸鹽(75/25乙酸鈉/乙酸)、苯甲酸鹽(75/25苯甲酸鈉/苯甲酸)或水楊酸鹽(90/10水楊酸鈉/水楊酸)緩沖劑的1:1(v:v)丙二醇/甘油中的來(lái)自實(shí)例1的新穎調(diào)配物脂質(zhì)摻合物樣品填充至2cc惠頓玻璃小瓶中，頂隙經(jīng)pfp氣體替代，插入韋斯特灰色丁基凍干塞，且將小瓶用鋁密封件卷邊。將小瓶存儲(chǔ)于25℃下，如實(shí)例2中所述制備并分析。提供如實(shí)例2中所述分析的的結(jié)果以供比較。表5提供作為在25℃下的小瓶中的總脂質(zhì)含量百分比的總雜質(zhì)。

圖3圖解說(shuō)明隨時(shí)間而變的總雜質(zhì)含量。然而，在將存儲(chǔ)于25℃下時(shí)，總雜質(zhì)含量顯著增加。這些數(shù)據(jù)展示，在較高溫度下，3.75mg緩沖lb/mlpg/g調(diào)配物遠(yuǎn)比調(diào)配物更穩(wěn)健。此觀察是意想不到的。

表5.存儲(chǔ)于25℃下的3.75mg脂質(zhì)摻合物/ml緩沖pg/g調(diào)配物的雜質(zhì)數(shù)據(jù)

*于391mg含有l(wèi)b的pg/g(0.33wt％lb；44.9wt％pg；54.8wt％g；lb:pg:g的比率為1:138:168)中的5mm緩沖劑。比率代表乙酸鈉對(duì)乙酸、苯甲酸鈉對(duì)苯甲酸、水楊酸鈉對(duì)水楊酸。

實(shí)例5.脂質(zhì)摻合物甘油調(diào)配物的穩(wěn)定性

將于甘油中的來(lái)自實(shí)例1的新穎調(diào)配物脂質(zhì)摻合物樣品填充至2cchplc玻璃小瓶中，頂隙經(jīng)pfp氣體替代，且用含有隔膜的螺旋蓋將小瓶密封。將小瓶存儲(chǔ)在25℃下且如實(shí)例2中所述制備并分析。

提供如實(shí)例2中所述分析的的結(jié)果以供比較。表6提供此實(shí)驗(yàn)的總雜質(zhì)結(jié)果。這些數(shù)據(jù)展示，在較高溫度下，7.5mg緩沖lb/mlg調(diào)配物遠(yuǎn)比調(diào)配物更穩(wěn)健。此觀察是意想不到的。

表6.存儲(chǔ)于25℃下的7.50mg脂質(zhì)摻合物/ml甘油(g)調(diào)配物*的雜質(zhì)數(shù)據(jù).

*215mg含有l(wèi)b(0.59wt％lb)的g(lb:g的比率為1:168)。

實(shí)例6.脂質(zhì)摻合物粉末的穩(wěn)定性

將lb粉末存儲(chǔ)于25℃下的具有ptfe襯里蓋的琥珀瓶中。在甲醇(50％)、丙二醇(10％)、甘油(10％)、乙酸銨(30％,5mm)溶液中制備樣品。將溶液轉(zhuǎn)移到hplc小瓶并使用梯度反相hplc及蒸發(fā)光散射檢測(cè)(elsd)分析，使用c18管柱及含有以下的移動(dòng)相：水、甲醇、乙酸銨及三乙胺。

表7提供存儲(chǔ)于25℃下的與相比的脂質(zhì)摻合物粉末的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。

這些數(shù)據(jù)展示，在較高溫度下，脂質(zhì)摻合物粉末遠(yuǎn)比調(diào)配物更穩(wěn)健。

表7.脂質(zhì)摻合物粉末的雜質(zhì)數(shù)據(jù)

實(shí)例7.的活化

通過(guò)使用對(duì)pfp/脂質(zhì)溶液進(jìn)行機(jī)械振蕩(闡述于美國(guó)專利6,039,557中，其內(nèi)容以引用方式并入本文中且可用于本發(fā)明工藝中)來(lái)使fda批準(zhǔn)的市售超聲對(duì)比劑(蘭索斯醫(yī)療成像公司)成為活性形式(“經(jīng)活化”)。此導(dǎo)致將氣體納入脂質(zhì)微球中且代表活性產(chǎn)物(見(jiàn)處方信息)。的最優(yōu)活化始終產(chǎn)生氣體填充微球，可在稀釋至適當(dāng)鞘液中時(shí)使用具有1及40微米的下限截止值及上限截止值的粒徑分析儀(莫爾文fpia-3000希森美康)分析其數(shù)目及大小分布(見(jiàn)表8)。

表8.使用莫爾文fpia-3000希森美康分析的氣泡數(shù)目和大小.

^a在1至40微米范圍內(nèi)的微球的平均微球直徑。

^b在1至40微米范圍內(nèi)的微球的平均微球濃度。

使用飛利浦斯諾斯(philipssonos)5500臨床超聲波成像系統(tǒng)測(cè)量所選樣品的聲衰減。將樣品以1:7.7(1.3ml加8.7ml鹽水)稀釋于10ml注射器中。在室溫下將200微升樣品自此注射器吸取到含有200ml0.9％鹽水的燒杯中。用2cm攪拌棒維持溶液均勻度且將超聲波系統(tǒng)的s3傳感器置于燒杯頂部，剛剛進(jìn)入溶液中且在攪拌棒上邊緣上方8.9cm處。然后以數(shù)字方式獲取5秒的120hz圖像并寫到磁盤上。us系統(tǒng)是以ibs模式使用，對(duì)于所有深度將tgc固定在最小值，且將lgc禁用。機(jī)械指數(shù)(mi)為0.2且功率設(shè)定為低于最大值18db。將接收增益固定為90且將壓縮固定為0。對(duì)于所測(cè)試的每一樣品，在樣品注射之前(空白)及之后獲取us數(shù)據(jù)獲取。在將樣品引入燒杯后20秒、60秒及120秒進(jìn)行測(cè)量。

圖像分析是使用飛利浦qlab實(shí)施，其讀取us系統(tǒng)產(chǎn)生的文件并計(jì)算ibs模式的db值。繪制攪拌棒上的所關(guān)注區(qū)域并將全部5秒(約360個(gè)視頻幀)獲取中的db值平均化。衰減測(cè)量是通過(guò)自空白roi值減去樣品roi值(二者均以db表示)來(lái)獲得。將此除以u(píng)s傳感器與攪拌棒上邊緣之間的距離的兩倍以產(chǎn)生以db/cm表示的衰減。通過(guò)應(yīng)用針對(duì)引入燒杯后的時(shí)間所取樣品的線性回歸來(lái)獲得最終值。所用值衍生自回歸線與y-軸的截距。

表9.聲衰減測(cè)量^a

的聲衰減是使用飛利浦斯諾斯5500測(cè)定。

實(shí)例8.非水性調(diào)配物的活化

將實(shí)例1中所述脂質(zhì)摻合物的新穎調(diào)配物稱量至2cc惠頓玻璃小瓶中，若需要添加稀釋劑，頂隙經(jīng)pfp氣體替代，插入韋斯特灰色丁基凍干塞，且將小瓶用鋁密封件卷邊。若需要，穿過(guò)塞子注射稀釋劑，且使用將小瓶機(jī)械振蕩一定持續(xù)時(shí)間以產(chǎn)生最優(yōu)產(chǎn)物活化。測(cè)定微球數(shù)目及分布且通過(guò)實(shí)例7中所述方法檢查一些活化調(diào)配物的超聲衰減。

表10.在即將活化之前添加有調(diào)配物稀釋劑^a的7.5mg脂質(zhì)摻合物/mlpg調(diào)配物的微球特征.

^a調(diào)配物稀釋劑含有甘油、磷酸鹽緩沖劑及鹽水以在稀釋調(diào)配物后匹配小瓶組合物。

^b177mg丙二醇調(diào)配物(0.72wt％lb；lb:pg的比率為1:138)，添加1.59ml稀釋劑^a，頂隙經(jīng)pfp替代，將2ml小瓶用韋斯特灰色丁基塞密封，用鋁密封件卷邊，將小瓶用活化45sec并如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目和平均大小。

^c177mg丙二醇調(diào)配物(0.72wt％lb；lb:pg的比率為1:138)于2ml小瓶中，頂隙經(jīng)pfp替代且將小瓶加蓋并卷邊。使用一次性注射器將1.59ml稀釋劑^a穿過(guò)塞子注射至小瓶中，立即用將小瓶活化45sec且然后如實(shí)例7中所述測(cè)試。

表11.在即將活化之前添加鹽水的7.5mg脂質(zhì)摻合物/mlpg調(diào)配物的微球特征及聲衰減.

^a177mg丙二醇調(diào)配物(0.72wt％lb；lb:pg的比率為1:138)，添加1.59ml0.9％鹽水，頂隙經(jīng)pfp替代，將2ml小瓶用韋斯特灰色丁基塞密封，用鋁密封件卷邊，將小瓶活化并如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目和平均大小。

^b如實(shí)例7中所述測(cè)定聲衰減。

表12.7.5mg脂質(zhì)摻合物/mlpg/g調(diào)配物的微球特征及聲衰減

^a391mg丙二醇和甘油調(diào)配物(0.33％lb；44.9％pg:54.8％g；lb:pg:g的比率為1:138:168)，添加1.38ml0.9％鹽水，頂隙經(jīng)pfp替代，將2ml小瓶用韋斯特灰色丁基塞密封，用鋁密封件卷邊，將小瓶活化并如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目和平均大小。

^b391mg丙二醇和甘油調(diào)配物(0.33％lb；44.9％pg:54.8％g；lb:pg:g的比率為1:138:168)，頂隙經(jīng)pfp替代，且將小瓶加蓋并卷邊，如上文腳注a中所述。使用一次性注射器將1.38ml鹽水注射至小瓶中，立即活化小瓶且然后如實(shí)例7中所述測(cè)試。

^c如實(shí)例7中所述測(cè)定聲衰減。

表13.在活化后添加鹽水稀釋劑的7.5mg脂質(zhì)摻合物/ml緩沖(5mm)pg/g調(diào)配物的微球特征.

^a391mg緩沖丙二醇和甘油調(diào)配物(0.33％lb；44.9％pg:54.8％g；lb:pg:g的比率為1:138:168)，將2ml小瓶用韋斯特灰色丁基塞密封，用鋁密封件卷邊，活化小瓶，添加1.38ml0.9％鹽水，混合小瓶并如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目和平均大小。

這些研究顯示，調(diào)配于a)pgb)pg/gc)緩沖pg/g中的脂質(zhì)摻合物可通過(guò)簡(jiǎn)單添加稀釋劑并在上振蕩經(jīng)活化，以形成與經(jīng)活化具有等效特征和聲衰減的微球(如實(shí)例7中所示)。此展示無(wú)需用水性稀釋劑預(yù)調(diào)配且簡(jiǎn)單添加即足夠。此外，稀釋劑可通過(guò)穿過(guò)小瓶塞子注射添加至脂質(zhì)調(diào)配物。另外，pg/g中的脂質(zhì)摻合物可通過(guò)振蕩后添加稀釋劑經(jīng)活化以形成與活化具有等效特征及聲衰減的微球(如實(shí)例7中所示)。執(zhí)行發(fā)現(xiàn)令人驚訝。

實(shí)例9.個(gè)別脂質(zhì)或脂質(zhì)摻合物的活化

通過(guò)在丙二醇中以0.045:0.401:0.304(w:w:w)比率(與脂質(zhì)摻合物的比率相同)混合個(gè)別磷脂(dppa、dppc及mpeg5000dppe)來(lái)制備調(diào)配物(個(gè)別脂質(zhì)調(diào)配物)。將所得7.5mg/ml個(gè)別脂質(zhì)丙二醇調(diào)配物添加至稀釋劑(含有甘油、磷酸鹽緩沖劑及鹽水以匹配小瓶組合物)并混合以形成0.75mg/ml的最終總脂質(zhì)濃度。將1.7ml等份添加至2cc惠頓玻璃小瓶中，頂隙經(jīng)pfp氣體替代，插入韋斯特灰色丁基凍干塞，且將小瓶用鋁密封件卷邊。用活化小瓶且使用希森美康fpia3000分析微球數(shù)目及平均微球大小。

表14.7.5mg個(gè)別脂質(zhì)/mlpg調(diào)配物的微球特征

此研究展示，在pg中混合個(gè)別脂質(zhì)而不制備脂質(zhì)摻合物可產(chǎn)生容許與稀釋劑混合以形成可經(jīng)活化以產(chǎn)生特征等效于活化的微球(在與實(shí)例7相比時(shí))的調(diào)配物。

在另一實(shí)驗(yàn)中，將脂質(zhì)摻合物稱量至2cc惠頓玻璃小瓶中，將基質(zhì)(pg/g/鹽水)添加至小瓶，頂隙經(jīng)pfp氣體替代，插入韋斯特灰色丁基凍干塞，用鋁密封件將小瓶卷邊，且然后在25℃下用活化，并使用希森美康fpia3000分析微球數(shù)目及平均微球大小。結(jié)果呈現(xiàn)于表15中。

表15.具有pfp頂隙的小瓶中的脂質(zhì)摻合物粉末(1.275mg)的微球特征

此研究展示，可將脂質(zhì)摻合物粉末稱量至小瓶中，添加稀釋劑，頂隙經(jīng)pfp替代，且將小瓶活化以產(chǎn)生特征等效于活化的微球(在與實(shí)例7相比時(shí))。此展示，脂質(zhì)無(wú)需經(jīng)預(yù)調(diào)配以容許活化。

實(shí)例10.不同脂質(zhì)濃度的活化

使用如實(shí)例1中所述的脂質(zhì)摻合物通過(guò)在丙二醇(pg)或1:1v/v丙二醇/甘油(pg/g)中混合不同量的lb粉末來(lái)制備不同總脂質(zhì)摻合物濃度的調(diào)配物。將每一脂質(zhì)調(diào)配物稱量至2cc惠頓玻璃小瓶中，若需要添加稀釋劑，頂隙經(jīng)pfp氣體替代，插入韋斯特灰色丁基凍干塞，且將小瓶用鋁密封件卷邊。使用將小瓶機(jī)械振蕩以活化產(chǎn)物且若需要使用配備有針的注射器穿過(guò)塞子添加稀釋劑。如實(shí)例7中所述測(cè)定微球數(shù)目及分布。

表16.不同脂質(zhì)mg/mlpg調(diào)配物的微球特征^a

^a小瓶(2cc惠頓小瓶)是通過(guò)稱量177mg含有1.875mg、3.75mg或7.5mg脂質(zhì)摻合物/ml的丙二醇(lb:pg比率分別為1:552；1:276；和1:138)來(lái)制備。

^b在即將活化之前將小瓶用8:1(v:v)鹽水及甘油稀釋至1.7ml最終體積。然后將空氣頂隙與pfp交換，用韋斯特灰色丁基塞密封，將小瓶用鋁密封件卷邊，活化并如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目及平均大小。

^c在即將活化之前將小瓶用鹽水稀釋至1.7ml最終體積。然后將空氣頂隙與pfp交換，用韋斯特灰色丁基塞密封，將小瓶用鋁密封件卷邊，活化并如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目及平均大小。

^d小瓶(2cc惠頓小瓶)是通過(guò)用調(diào)配物基質(zhì)1至4或1至2稀釋(還測(cè)試未稀釋)來(lái)制備，將頂隙氣體與pfp交換，將小瓶加塞子并用鋁密封件卷邊，活化并如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目及平均大小。

表17.不同脂質(zhì)mg/mlpg/g調(diào)配物的微球特征^a

^a小瓶(2cc惠頓小瓶)是通過(guò)稱量391mg含有0.9375mg、1.875mg或3.75mg脂質(zhì)摻合物/ml的1:1(v/v)丙二醇和甘油(lb:pg:g比率分別為1:552:672；1:276:336；和1:138:168)來(lái)制備。

^b在即將活化之前將小瓶用鹽水稀釋至1.7ml最終體積。然后將空氣頂隙與pfp交換，用韋斯特灰色丁基塞密封，將小瓶用鋁密封件卷邊，活化并如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目及平均大小。

^c將空氣頂隙與pfp交換，將小瓶用韋斯特灰色丁基塞密封，用鋁密封件卷邊并活化。將鹽水添加至1.7ml最終體積并如實(shí)例7中所述測(cè)試小瓶的微球數(shù)目及平均大小。

^d小瓶(2cc惠頓小瓶)是通過(guò)用調(diào)配物基質(zhì)1至4或1至2稀釋(亦測(cè)試未稀釋)來(lái)制備，將頂隙氣體與pfp交換，將小瓶加塞子并用鋁密封件卷邊，活化并如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目及平均大小。

所述研究展示，具有不同脂質(zhì)濃度的脂質(zhì)摻合物調(diào)配物在活化時(shí)產(chǎn)生成比例數(shù)目的微球(每給定體積，1ml)。微球大小等效于活化且微球數(shù)目類似于或高于活化或等效稀釋形式。并未預(yù)期形成具有等效于活化的特征及在pg或pg/g中的多種不同脂質(zhì)摻合物濃度的微球的能力。在添加稀釋劑之前通過(guò)活化pg/g中的脂質(zhì)摻合物來(lái)實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)的能力甚至更令人驚訝。

實(shí)例11.容器

將新穎脂質(zhì)調(diào)配物或填充至各種容器中，包括：小瓶、注射器及易曲折塑料管，隨后將其活化。在所有研究中，將適當(dāng)量的脂質(zhì)調(diào)配物置于所述容器中，頂隙經(jīng)pfp替代，密封所述容器且活化所述調(diào)配物。

表18.在2ml肖特小瓶中活化的pg或pg/g調(diào)配物中的脂質(zhì)摻合物的微球特征^a

^a將適當(dāng)量的7.5mglb/mlpg或3.75mglb/mlpg/g調(diào)配物稱量至2ml肖特小瓶中，對(duì)于“活化前”樣品添加適當(dāng)量的鹽水，空氣頂隙經(jīng)pfp替代，用韋斯特灰色丁基塞密封小瓶，用鋁密封件卷邊，活化，對(duì)于“活化后樣品”添加適當(dāng)量的鹽水，且如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目及平均大小。使用活化小瓶。

表19.在1ml惠頓v形小瓶中活化的pg或pg/g調(diào)配物中的脂質(zhì)摻合物的微球特征^a

^a將適當(dāng)量的7.5mglb/mlpg或3.75mglb/mlpg/g調(diào)配物稱量至1ml惠頓v形小瓶中，空氣頂隙經(jīng)pfp替代，對(duì)于“活化前”樣品添加適當(dāng)量的鹽水，用韋斯特灰色丁基塞密封小瓶，用鋁密封件卷邊，活化，對(duì)于“活化后”樣品添加適當(dāng)量的鹽水，且如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目及平均大小。使用活化小瓶。

表20.在注射器中活化的的微球濃度^a

^a將填充(1.5ml至2.7ml)到3ml及5ml注射器(亨克-薩斯(henke-sass),沃爾夫gmbh(wolfgmbh),德國(guó)圖特林根(tuttlingen,germany))中。將空氣頂隙用pfp替代，將注射器用wig-l-bug^tm活化，如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目及平均大小。

表21.在3ml注射器中活化的pg或pg/g調(diào)配物中的脂質(zhì)摻合物的微球特征

^a將適當(dāng)量的7.5mglb/mlpg或3.75mglb/mlpg/g調(diào)配物稱量至3ml注射器(亨克-薩斯,沃爾夫gmbh,德國(guó)圖特林根)中，對(duì)于“活化前”樣品添加適當(dāng)量的鹽水，空氣頂隙經(jīng)pfp替代并活化注射器，對(duì)于“活化后”樣品添加適當(dāng)量的鹽水，且如實(shí)例7中所述測(cè)試制劑的微球數(shù)目及平均大小。使用活化注射器。

表22.在注射器中活化的pg調(diào)配物中的脂質(zhì)摻合物的微球特征，所述注射器經(jīng)修改以具有兩個(gè)用牙科汞齊膠囊形成的隔室^a

^a將5ml注射器(亨克-薩斯,沃爾夫gmbh,德國(guó)圖特林根)減小至3ml。打開牙科汞齊膠囊(得自當(dāng)?shù)匮泪t(yī))，去除含有粉末的底部，且自頂部隔室去除柱塞以及頂部隔室的內(nèi)容物。將頂部隔室裝配至減小的注射器的筒中。

^b將適當(dāng)量的7.5mglb/mlpg或3.75mglb/mlpg/g調(diào)配物稱量至減小到約2.5ml的5ml注射器主體中(亨克-薩斯,沃爾夫gmbh,德國(guó)圖特林根)，將牙科汞齊柱塞插入膠囊中，對(duì)于“活化前”樣品添加適當(dāng)量的鹽水，空氣頂隙經(jīng)pfp替代，用魯爾鎖蓋(luerlockcap)密封注射器，活化，對(duì)于“活化后”樣品添加適當(dāng)量的鹽水，且如實(shí)例7中所述測(cè)試微球數(shù)目及平均大小。使用活化小瓶。

表23.在經(jīng)修改以具有兩個(gè)隔室的注射器中活化的pg或pg/g調(diào)配物中的脂質(zhì)摻合物的微球特征^a

^a3ml注射器(亨克-薩斯,沃爾夫gmbh,德國(guó)圖特林根)經(jīng)修改以具有約3mm×10mm×1mm膨出部作為市售二隔室注射器的典型旁路通道。所述通道是通過(guò)加熱鑷子的一個(gè)鉗并在約2ml體積標(biāo)志處將其壓至注射器筒的內(nèi)部來(lái)制備。將注射器柱塞末端截?cái)嗟郊s1cm長(zhǎng)度并用作旁路插塞。也減小第二注射器柱塞。

^b將適當(dāng)量的7.5mglb/mlpg或3.75mglb/mlpg/g調(diào)配物稱量至經(jīng)修改3ml注射器的主體中低于旁路通道處，將旁路插塞插入剛剛高于旁路通道的點(diǎn)，將適當(dāng)量的鹽水添加至在插入旁路插塞后形成的頂部室中，插入減小注射器柱塞，完成上部室的填充。將下部室中的空氣頂隙用pfp替代，用魯爾鎖蓋密封注射器。使用活化注射器，推動(dòng)注射器柱塞以將旁路插塞移動(dòng)至旁路通道中，容許鹽水進(jìn)入含有“活化后”樣品的活化產(chǎn)物的下部室中。對(duì)于“活化前”樣品，推動(dòng)注射器柱塞以將旁路插塞移動(dòng)至旁路通道中，容許鹽水進(jìn)入下部室中，使用活化注射器。如實(shí)例7中所述測(cè)試樣品的微球數(shù)目及平均大小。

表24.在二隔室塑料管中活化的脂質(zhì)摻合物pg或pg/g調(diào)配物的微球特征

^a將適當(dāng)量的7.5mglb/mlpg或3.75mglb/mlpg7g調(diào)配物稱量至二隔室管(neopacfleximed管,13.5×80mm,霍夫曼內(nèi)奧派克ag(hoffmannneopacag),瑞士上迪斯巴赫(oberdiessbach,switzerland))的下部室中，將適當(dāng)量的鹽水添加至頂部室中，將下部室中的空氣頂隙用pfp替代，用魯爾鎖蓋密封該管。對(duì)于“活化后”樣品，使用活化所述管，將上部隔室鹽水轉(zhuǎn)移到下部隔室并混合。對(duì)于“活化前”樣品，將鹽水轉(zhuǎn)移到下部隔室，之后使用使管活化。如實(shí)例7中所述測(cè)試樣品的微球數(shù)目及平均大小。

所述研究展示，用機(jī)械振蕩器振蕩脂質(zhì)摻合物pg及pg/g調(diào)配物的工藝可在包括小瓶、注射器及塑料管在內(nèi)的多種容器中實(shí)現(xiàn)，并產(chǎn)生具有等效于活化的特征的微球。令人驚訝的是，機(jī)械振蕩克服了容器尺寸及用于容器制造材料的差異且容許形成具有欲形成的等效大小及數(shù)目的微球。注射器中pg及pg/g中的lb調(diào)配物在添加稀釋劑之前及之后的活化均是令人激動(dòng)的發(fā)現(xiàn)。另外，能自調(diào)配物分離稀釋劑且然后在通過(guò)機(jī)械振蕩活化之前或之后容許兩種組份混合到一起證實(shí)了提供可以容易產(chǎn)物生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)室溫穩(wěn)定調(diào)配物的制劑的新機(jī)會(huì)。

實(shí)例12.活化方法

實(shí)施研究以展示用若干種并非使用的方法活化的能力。這些方法闡述于下文中，結(jié)果報(bào)告于表25中。

a.將(1.5ml)抽吸至3ml塑料注射器中并連接至三通活塞。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器中并連接至活塞上的另一端口。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞介于50-400次之間來(lái)混合及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

b.將(3.0ml)抽吸至10ml塑料注射器中并連接至三通活塞。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器中并連接至活塞上的另一端口。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞200次來(lái)混合及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

c.將脂質(zhì)調(diào)配物(1.5ml的0.045mg/mldppa、0.75mg/mldppc、0mg/mlmpeg5000dppe、4.87mgnacl/ml、103.5mg/ml丙二醇、126.2mg/ml甘油、2.34mg/mlnah2po4h2o、2.16mg/mlnahpo47h2o)抽吸至3ml塑料注射器中并連接至三通活塞。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器中并連接至活塞上的另一端口。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞100次來(lái)混合調(diào)配物及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示此脂質(zhì)調(diào)配物的活化。

d.將改質(zhì)的脂質(zhì)調(diào)配物(1.5ml的0.045mg/mldppa、0.75mg/mldppc、0mg/mlmpeg5000dppe、4.87mg/mlnacl、103.5mg/ml丙二醇、126.2mg/ml甘油、2.34mg/mlnah2po4h2o、2.16mg/mlnahpo47h2o)抽吸至3ml塑料注射器中并連接至三通活塞。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器中并連接至活塞上的另一端口。在脂質(zhì)調(diào)配物填充的注射器與活塞之間是填充有7個(gè)高效x-網(wǎng)格靜態(tài)混合器(stamixco,gxp-9,4-pa66，黑色)的塑料管。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞50次來(lái)混合調(diào)配物及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示此脂質(zhì)調(diào)配物的活化。

e.將改質(zhì)的脂質(zhì)調(diào)配物(1.5ml的0.045mg/mldppa、0.75mg/mldppc、0mg/mlmpeg5000dppe、4.87mg/mlnacl、103.5mg/ml丙二醇、126.2mg/ml甘油、2.34mg/mlnah2po4h2o、2.16mg/mlnahpo47h2o)抽吸至3ml塑膠注射器中并連接至兩個(gè)串聯(lián)三通活塞。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器中并連接至活塞上的另一端口。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞100次來(lái)混合調(diào)配物及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示此脂質(zhì)調(diào)配物的活化。

f.將改質(zhì)的脂質(zhì)調(diào)配物(1.5ml的0.045mg/mldppa、0.75mg/mldppc、0mg/mlmpeg5000dppe、4.87mg/mlnacl、103.5mg/ml丙二醇、126.2mg/ml甘油、2.34mg/mlnah2po4h2o、2.16mg/mlnahpo47h2o)抽吸至3ml塑料注射器中并連接至三通活塞。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器中并連接至活塞上的另一端口。在脂質(zhì)調(diào)配物填充的注射器與活塞之間是填充有8個(gè)高效x-網(wǎng)格靜態(tài)混合器(stamixco,gxf-10-2-me，橙色)的塑料管。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞100次來(lái)混合調(diào)配物及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示此脂質(zhì)調(diào)配物的活化。

g.將改質(zhì)的脂質(zhì)調(diào)配物(1.5ml的0.045mg/mldppa、0.401mg/mldppc、0.304mg/mlmpeg5000dppe、4.87mg/mlnacl、155.25mg/ml丙二醇、31.55mg/ml甘油、2.34mg/mlnah2po4h2o、2.16mg/mlnahpo47h2o)抽吸至3ml塑料注射器中并連接至三通活塞。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器中并連接至活塞上的另一端口。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞100次來(lái)混合調(diào)配物及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示此脂質(zhì)調(diào)配物的活化。

h.將(1.5ml)加3.5ml鹽水抽吸至5ml塑料注射器中并連接至三通活塞。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器中并連接至活塞上的另一端口。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞100次來(lái)混合鹽水及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

i.將(1.5ml)抽吸至3ml塑料注射器中并連接至三通活塞。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器中并連接至活塞上的另一端口。在填充的注射器與活塞之間是具有塑料螺旋混合器(stamixco,2.5”x3/16”，在2.5英寸中15個(gè)螺旋圈)的塑料管。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞50次來(lái)混合及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

j.將(3.0ml)抽吸至10ml塑料注射器中并連接至三通活塞。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器中并連接至活塞上的另一端口。在填充的注射器與活塞之間是具有塑料螺旋混合器(stamixco,2.5”×3/16”，在2.5英寸中15個(gè)螺旋圈)的塑料管。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞50次來(lái)混合及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

k.將(1.5ml)抽吸至3ml塑料注射器中并直接連接至具有塑料螺旋混合器(stamixco,2.5”×3/16”，在2.5英寸中15個(gè)螺旋圈)的塑料管。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器并連接至塑料管的另一端。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞25次來(lái)混合及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

l.將(1.5ml)抽吸至3ml塑料注射器中并直接連接至20uqma過(guò)濾器(沃特斯(waters))。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器并連接至過(guò)濾器的另一端。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞50次來(lái)混合及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

m.將(1.5ml)抽吸至3ml塑料注射器中并直接連接至20uqma過(guò)濾器(沃特斯)及具有塑料螺旋混合器(stamixco,2.5”×3/16”，在2.5英寸中15個(gè)螺旋圈)的塑料管。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)注射器并連接至混合器的另一端。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞50次來(lái)混合及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

n.將(0.6ml)抽吸至1ml玻璃注射器并連接至含有5u過(guò)濾器的1.5英寸金屬支架。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)玻璃注射器并連接至金屬支架的另一端。此擠出裝置可自市場(chǎng)購(gòu)得(liposofast-basic,奧維斯汀公司(avestin,inc.))。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞25次來(lái)混合及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

o.將(0.6ml)抽吸至1ml玻璃注射器并連接至含有5u過(guò)濾器的1.5英寸金屬支架。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)玻璃注射器并連接至金屬支架的另一端。此擠出裝置可自市場(chǎng)購(gòu)得(liposofast-basic,奧維斯汀公司)。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞100次來(lái)混合及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

p.將(0.6ml)抽吸至1ml玻璃注射器并連接至含有0.4或1.0微米過(guò)濾器的1.5英寸金屬支架。用pfp氣體填充相同大小的單獨(dú)玻璃注射器并連接至金屬支架的另一端。此擠出裝置可自市場(chǎng)購(gòu)得(liposofast-basic,奧維斯汀公司)。通過(guò)來(lái)回交替推壓每一注射器上的柱塞25次來(lái)混合及pfp氣體。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

q.將的小瓶(1.5ml)在最高設(shè)定下渦旋5分鐘。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

r.將的小瓶(1.5ml)超聲波處理2分鐘。溶液為乳白色，但未測(cè)試微氣泡計(jì)數(shù)或氣泡直徑測(cè)量。

s.用高速槳式勻漿器將的小瓶(1.5ml)處理5分鐘。溶液為乳白色，但未測(cè)試微氣泡計(jì)數(shù)或氣泡直徑測(cè)量。

t.將的小瓶(1.5ml)固定在0.75”x2.25”x23”木棍的末端上，在兩個(gè)相距15”的木柱之間以100次擊打/27秒的速率移動(dòng)300次與1500次之間，并測(cè)試微氣泡計(jì)數(shù)或氣泡直徑量測(cè)。微氣泡計(jì)數(shù)及氣泡直徑測(cè)量指示的活化。

表25.使用希森美康微氣泡分析儀的微氣泡計(jì)數(shù)及直徑的結(jié)果.

這些研究展示或其修改形式的活化可使用多種活化裝置來(lái)完成。

本文所列舉的參考文獻(xiàn)(包括專利及專利申請(qǐng)案)其全文以引用方式并入本文中。