本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種星毛冠蓋藤中香豆素類成分的含量測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

從目前抗腫瘤藥物研究發(fā)展的趨勢(shì)來看，國(guó)內(nèi)外在尋找抗腫瘤藥物的這方面已經(jīng)做了不少的研究工作，也取得了一定的成果，已經(jīng)尋找并開發(fā)出了一些具有較好抗腫瘤作用的藥物，但是總的來說研究開發(fā)出高效、不良反應(yīng)較小的藥物數(shù)量不多，尚不能滿足臨床上腫瘤患者的需求。同時(shí)，尚未能開發(fā)出對(duì)于治療腫瘤具有特效的藥物。利用現(xiàn)有的醫(yī)藥研究技術(shù)，加大對(duì)具有抗腫瘤作用的天然產(chǎn)物進(jìn)行篩選，力爭(zhēng)能開發(fā)出高效、低毒的抗腫瘤藥物，不光是廣大腫瘤患者的迫切需求，也是廣大醫(yī)藥研究工作者的重點(diǎn)攻關(guān)方向之一。我們應(yīng)加大對(duì)民間秘方、驗(yàn)方的篩選研究工作，從中尋找出具有更好療效，甚至具有特效的抗腫瘤藥物。

星毛冠蓋藤（pileostegiatomentellahand.mazz.）為繡球花科冠蓋藤屬植物，其藥材名為消瘤藤，《中華本草》、《廣西藥用植物名錄》、《廣西植物志》均將其收載，但只作為同屬植物冠蓋藤的替代品，記錄其具有祛風(fēng)除濕，散瘀止痛，消腫解毒的功效，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)任何關(guān)于星毛冠蓋藤藥理活性的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。消瘤藤為目前全國(guó)唯一一所國(guó)家事業(yè)性、公益性、非營(yíng)利性的瑤醫(yī)藥特色醫(yī)院--廣西金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)醫(yī)院腫瘤科用于治療各種腫瘤的主藥。雖然抗腫瘤療效顯著，但其主要依靠民間驗(yàn)方，缺乏科學(xué)規(guī)范的用藥指導(dǎo)。

目前關(guān)于星毛冠蓋藤的研究主要在粗物質(zhì)的提取、分離方面，如經(jīng)檢索，有以下文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行了研究：

文獻(xiàn)一：作者肖冰梅、佘朋桂、李詠梅等在2012年13期《中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志》，發(fā)表文章《星毛冠蓋藤的質(zhì)量研究》，研究采用2010年版《中國(guó)藥典》方法對(duì)星毛冠蓋藤進(jìn)行了水分、灰分及浸出物含量檢測(cè)，考察提取方法及提取時(shí)間對(duì)浸出物含量的影響；以70%乙醇回流提取總黃酮，蘆丁為對(duì)照品采用紫外分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：水分含量為10.8%，總灰分為5.2%,酸不溶灰分為1.2%，水溶性浸出物含量以回流方法提取40min最高，提取率達(dá)13.45%，醇溶性浸出物以回流方法提取60min最高，提取率為11.09%；總黃酮含量為0.39%，回收率102.7%,rsd1.76%。

文獻(xiàn)二：作者王云卿、馬國(guó)需、梁瓊平等在2016年24期《中草藥》雜志，發(fā)表的《瑤藥“腫瘤藤”星毛冠蓋藤)的化學(xué)成分研究》，用各種色譜方法對(duì)星毛冠蓋藤藤莖90%甲醇提取物進(jìn)行分離純化，結(jié)合波譜技術(shù)與化學(xué)方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果從星毛冠蓋藤藤莖的90%甲醇提取物中分離鑒定了16個(gè)化合物，分別鑒定為落干酸(1)、4-o-α-l-阿拉伯呋喃糖基-(1→6)-β-d-吡喃葡糖苷(4s)-4-羥基-β-紫羅蘭酮(2)、間苯二酚(3)、祖師麻乙素(4)、茵芋苷(5)、傘形花內(nèi)酯(6)、斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯(7)、鄰苯二甲酸二乙酯(8)、裂環(huán)馬錢素(9)、裂環(huán)馬錢素二縮醛(10)、當(dāng)藥苷(11)、foliasalaciosideb(12)、芐基-o-β-d-呋喃芹糖基-(1″→6′)-β-d-吡喃葡萄糖苷(13)、麥芽糖(14)、葡萄糖(15)、胡蘿卜苷(16)。

文獻(xiàn)三：作者：李詠梅、佘朋桂和肖冰梅在《藥物研究》中發(fā)表《星毛冠蓋藤不同藥用部位的高效液相色譜分析》，研究通過對(duì)星毛冠蓋藤不同藥用部位70%乙醇提取，使用不同比例甲醇和乙腈系統(tǒng)等度洗脫，使用高效液相色譜法對(duì)藥用各部位均有較好的分離效果，結(jié)論表明：僅莖枝含有蘆丁。

文獻(xiàn)四：作者：謝金攀、謝裕安、楊帆、梁瓊平和龐趙生等在《中藥方劑》雜志發(fā)表《星毛冠蓋藤中總黃酮超聲乙醇浸提工藝的優(yōu)化》，研究發(fā)現(xiàn)最優(yōu)方案為：在40℃水浴，超聲功率100w的條件下，加入20倍量65%乙醇，室溫下浸泡星毛冠蓋藤3h，超聲提取50min，可以達(dá)到最佳效果。

可以看出，以上研究并未對(duì)抗腫瘤成分香豆素類物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)研究，而對(duì)星毛冠蓋藤中的香豆素類成分進(jìn)行含量測(cè)定，有助于進(jìn)一步科學(xué)的開發(fā)該藥材。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)以上問題，提供一種星毛冠蓋藤中香豆素類成分的含量測(cè)定方法，以此進(jìn)一步科學(xué)、系統(tǒng)開發(fā)星毛冠蓋藤中抗腫瘤活性成分，為資源利用和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

研究表明，茵芋苷具有治療腎功能不全方面的活性，7-羥基香豆素對(duì)人膀胱癌細(xì)胞系e-j細(xì)胞株增殖具有抑制作用。相關(guān)文獻(xiàn)：[1]薛清春.遠(yuǎn)志屬植物瓜子金根的化學(xué)成分研究及茵芋苷的合成研究[d].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2009；[2]楊秀偉，徐波，冉福香，等.11種香豆素類化合物對(duì)人膀胱癌細(xì)胞系e-j細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制活性的篩選[j].結(jié)合醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2007，5(1)：56-60

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明星毛冠蓋藤中香豆素類成分的含量檢測(cè)方法，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定星毛冠蓋藤中茵芋苷、7-羥基香豆素、7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量，具體方法如下：

（1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。

所述色譜條件為：色譜柱：c18（5μm，250×4.6mm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：320nm；流動(dòng)相：流動(dòng)相a為乙腈，流動(dòng)相b為0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫；柱溫：25℃；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：10μl。

所述梯度洗脫程序?yàn)椋?~30min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)從5%線性到變化到40%；30~31min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)從40%線性變化到5%，31~40min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)保持在5%。具體洗脫程序見表1：

（2）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取茵芋苷對(duì)照品、7-羥基香豆素對(duì)照品和7-羥基-8-甲氧基香豆素對(duì)照品，加甲醇超聲溶解并制備成對(duì)照品溶液，濃度分別為：茵芋苷0.1032mg/ml，7-羥基香豆素0.1022mg/ml和7-羥基-8-甲氧基香豆素0.1112mg/ml。

（3）供試品溶液的制備：精密稱取星毛冠蓋藤藥材粉末1g，置于150ml錐形瓶中，精密加入80%的甲醇(v/v)25ml，稱定重量，加熱回流提取60min，用80%甲醇(v/v)補(bǔ)足減失的重量，溶液過濾，精密量取續(xù)濾液2ml置10ml量瓶中，用80%甲醇(v/v)定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

（4）測(cè)定供試品溶液中茵芋苷、7-羥基香豆素、7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量：采用對(duì)照品溶液繪制進(jìn)樣量—色譜峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定星毛冠蓋藤中三種成分的色譜峰面積，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出茵芋苷、7-羥基香豆素、7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量即可。

所述步驟（1）系統(tǒng)性試驗(yàn)研究如下：

一、線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液各0.1、0.2、0.5、1、2、5ml置10ml容量瓶，用甲醇定容至刻度。按步驟(1)所述色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10μl，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸處理得茵芋苷的回歸方程為：y=20.30956x+2.12117，r=0.9999，線性范圍為0.0103～1.032μg；7-羥基香豆素的回歸方程為：y=53.22705x+21.84810，r=0.9999，線性范圍為0.0102～1.022μg；7-羥基-8-甲氧基香豆素的回歸方程為：y=39.41803x+5.75058，r=0.9999，線性范圍為0.0111～1.112μg。

二、精密度試驗(yàn)

精密吸取星毛冠蓋藤供試品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果見表2，茵芋苷平均峰面積值為946.80，rsd為0.13%，7-羥基香豆素平均峰面積值為331.25，rsd為0.06%，7-羥基-8甲氧基香豆素平均峰面積值為110.27，rsd為0.09%，表明儀器精密度良好。

三、重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批藥材粉末6份，每份1g，精密測(cè)定，按最終確定提取方法進(jìn)行制備，測(cè)定峰面積并計(jì)算星毛冠蓋藤中茵芋苷、7-羥基香豆素、7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量，茵芋苷平均含量為4.86mg/g，rsd為1.61%，7-羥基香豆素平均含量為0.57mg/g，rsd為1.51%，7-羥基-8甲氧基香豆素平均含量為0.22mg/g，rsd為1.50%。表明本法重復(fù)性良好，結(jié)果見表3。

四、穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，每次精密吸取10μl，分別于1，2，4，6，12h進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積值并計(jì)算含量，結(jié)果見表4，在24h內(nèi)測(cè)定藥材的峰面積并計(jì)算茵芋苷、7-羥基香豆素、7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量，茵芋苷平均含量為4.83mg/g，rsd為1.01%，7-羥基香豆素平均含量為0.57mg/g，rsd為1.58%，7-羥基-8甲氧基香豆素平均含量為0.22mg/g，rsd為0.79%。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

五、加樣回收試驗(yàn)

精密稱定已測(cè)定含量(每g中含茵芋苷4.86mg、7-羥基香豆素0.57mg、7-羥基-8-甲氧基香豆素0.22mg)的藥材粉末6份，每份約0.5g，精密稱定，另精密稱取茵芋苷對(duì)照品22.69mg，7-羥基香豆素對(duì)照品2.70mg，7-羥基-8-甲氧基香豆素對(duì)照品1.21mg，置200ml量瓶中，加適量80%甲醇超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別在上述6份藥材中加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液25ml，按供試品制備方法制備，分別進(jìn)樣10ul，記錄茵芋苷、7-羥基香豆素、7-羥基-8-甲氧基香豆素的峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見表5、6、7。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明對(duì)星毛冠蓋藤中香豆素類成分：茵芋苷、7-羥基香豆素、7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量測(cè)定方法，分別對(duì)對(duì)照品溶液及供試品溶液在本發(fā)明色譜條件下進(jìn)行以上成分的色譜分析，并通過成分的峰面積響應(yīng)值的線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率等方面的測(cè)定，從而掌握星毛冠蓋藤中香豆素類成分含量的測(cè)定方法。本測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，值得在星毛冠蓋藤中香豆素類成分含量測(cè)定方面推廣應(yīng)用，為進(jìn)一步開發(fā)該藥材資源提供了科學(xué)依據(jù)。

附圖說明：

附圖1：乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫程序圖。圖1中曲線，1、茵芋苷，3、7-羥基香豆素，4、7-羥基-8甲氧基香豆素。

附圖2：茵芋苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

附圖3：7-羥基香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

附圖4：7-羥基-8-甲氧基香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

附圖5：對(duì)照品和供試品的hplc色譜圖。圖5中：對(duì)照品和供試品hplc色譜圖（a.混合對(duì)照品色譜b.星毛冠蓋藤樣品色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

采用hplc法同時(shí)測(cè)定星毛冠蓋藤中茵芋苷、7-羥基香豆素、7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量：

1、所用材料、儀器和試藥如下：

1.1取廣西金秀瑤族自治縣金秀鎮(zhèn)、桐木鎮(zhèn)、三角鄉(xiāng)和大樟鄉(xiāng)4批星毛冠蓋藤藥材粉末進(jìn)行香豆素類成分含量測(cè)定。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

agilent1206高效液相色譜儀配dad檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫科技有限公司）ag-204電子分析天平（mettlertoledo）；hh-s6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；milliporesimplicity-uv超純水器(美國(guó)密里博)。

1.3試藥

茵芋苷對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)r14m7f11135，含量以98%計(jì)），7-羥基香豆素（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111739-200501），7-羥基-8-甲氧基香豆素由廣西中醫(yī)藥研究院提供，含量經(jīng)歸一化法測(cè)定為100%；液相用水為超純水，甲醇、乙腈（fisher，色譜純），磷酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純），提取用甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純），水為純凈水。

色譜條件選擇

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取混合對(duì)照品適量，進(jìn)樣，用dad檢測(cè)器在210～400nm波長(zhǎng)范圍掃描，結(jié)果顯示茵芋苷最大吸收波長(zhǎng)為318nm，7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素最大吸收波長(zhǎng)為322nm，測(cè)定中要選擇一個(gè)能同時(shí)最大檢出3種成分，故在最大吸收波長(zhǎng)±2nm處選擇320nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2流動(dòng)相條件選擇

分別比較甲醇-0.2%磷酸水溶液（15:85）、乙腈-0.2%磷酸水溶液（15:85）、乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，結(jié)果顯示，用甲醇-0.2%磷酸水溶液系統(tǒng)峰展寬，宜用乙腈-0.2%磷酸水溶液系統(tǒng)，但三種成分極性相差較大，用等度洗脫用時(shí)較長(zhǎng)，故改用梯度洗脫，7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素極性相近，洗脫程序分離度不好，調(diào)整洗脫程序，以乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫程序效果最好。

2.3色譜條件的確定

色譜柱：c18（5μm，250×4.6mm）；

檢測(cè)波長(zhǎng)：320nm；

流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，洗脫程序見表3；

柱溫：25℃；

流速：1.0ml/min；

進(jìn)樣量：10μl。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

3.1供試品溶液的制備

精密稱取茵芋苷對(duì)照品10.53mg，7-羥基香豆素對(duì)照品10.22mg、7-羥基-8-甲氧基香豆素對(duì)照品11.12mg，分別置10ml量瓶中，加適量甲醇超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取三種對(duì)照品貯備液1.0ml，置10ml量瓶中，用甲醇定容，即得混合對(duì)照品溶液（每1ml溶液中含茵芋苷0.1032mg，7-羥基香豆素0.1022mg，7-羥基-8-甲氧基香豆素0.1112mg）。

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液各0.1、0.2、0.5、1、2、5ml置10ml容量瓶，用甲醇定容至刻度。按2.3項(xiàng)色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10μl，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸處理得茵芋苷的回歸方程為：y=20.30956x+2.12117，r=0.9999，線性范圍為0.0103～1.032μg；7-羥基香豆素的回歸方程為：y=53.22705x+21.84810，r=0.9999，線性范圍為0.0102～1.022μg；7-羥基-8-甲氧基香豆素的回歸方程為：y=39.41803x+5.75058，r=0.9999，線性范圍為0.0111～1.112μg。

單因素實(shí)驗(yàn)

4.1提取方法考察

取星毛冠蓋藤粉末2份，每份約2g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，分別采用加熱回流、超聲兩種提取方法提取1h，溶液過濾，續(xù)濾液用0.45μm的濾膜過濾至樣品瓶中，按上述的色譜條件進(jìn)行hplc分析。結(jié)果顯示，回流提取效果更佳，故選回流。

4.2溶劑濃度考察

取星毛冠蓋藤粉末6份，每份約2g，精密稱定，置于錐形瓶中，分別精密加入5%、20%、50%、80%、95%、100%甲醇各25ml，加熱回流提取1h，溶液過濾，續(xù)濾液用0.45μm的濾膜過濾至樣品瓶中，按上述的色譜條件進(jìn)行hplc分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，80%甲醇的提取消瘤藤成分的提取率最高，最后選定80%甲醇提取。

4.3提取時(shí)間考察

取星毛冠蓋藤藥材粉末4份，每份約1g，精密稱定，置于錐形瓶中，分別精密加入80%甲醇各25ml，分別加熱回流提取15min、30min、60min、120min，溶液過濾，續(xù)濾液用0.45μm的濾膜過濾至樣品瓶中，按上述的色譜條件進(jìn)行hplc分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加熱回流60min提取消瘤藤成分的提取率最高，故選加熱回流60min。

提取方法的確定

取星毛冠蓋藤藥材粉末約1g，精密稱定，置于150ml錐形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，稱定重量，加熱回流提取60min，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，溶液過濾，精密量取續(xù)濾液2ml置10ml量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

樣品含量測(cè)定

測(cè)定供試品溶液中茵芋苷、7-羥基香豆素、7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量：采用對(duì)照品溶液繪制進(jìn)樣量—色譜峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定星毛冠蓋藤中三種成分的色譜峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出茵芋苷、7-羥基香豆素、7-羥基-8-甲氧基香豆素的含量，結(jié)果見表8。