本發(fā)明涉及一種煙草中煙堿旋光異構(gòu)體的測定方法，屬于煙草化學(xué)分析領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

煙堿，又名尼古丁，化學(xué)名為1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷，是煙草、煙草制品及煙氣中存在的重要的生物堿，約占煙草中總生物堿的90％。在其分子結(jié)構(gòu)中，四氫吡咯環(huán)上的2位碳原子具有手性，因此尼古丁具有兩個對映異構(gòu)體，即s-(-)-尼古丁和r-(+)-尼古丁。煙草中的尼古丁主要為s-(-)-尼古丁，r-(+)-尼古丁僅占煙草原料中總尼古丁的1％左右，但隨著燃燒過程中的熱解外消旋作用，r-(+)-尼古丁的含量可達(dá)到2～3％。許多動物實(shí)驗(yàn)和體外模型實(shí)驗(yàn)表明，兩者在生物體內(nèi)的代謝過程有所不同，s-(-)-尼古丁比r-(+)-尼古丁具有更強(qiáng)的生理活性和毒性。因此，兩種尼古丁手性異構(gòu)體的分離及定量檢測在藥學(xué)和吸煙與健康方面具有重要意義。

尼古丁旋光異構(gòu)體檢測方法主要有光學(xué)極化檢測法、核磁共振法(¹h-nmr、¹³c-nmr)、二維液相色譜法、二維氣相色譜質(zhì)譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳-非標(biāo)記內(nèi)在成像法等，所報道的手性拆分方法通常靈敏度不高、耗時較長或涉及到手性位移試劑的使用。比如公布號cn106324130a的發(fā)明專利公開的一種卷煙煙絲中煙堿的手性分析方法，包括：將煙絲樣品干燥、粉碎和過篩，加入萃取液(體積比2:4:1的水、正己烷和2m氫氧化鈉溶液)萃取并過濾，普通煙絲樣品萃取液直接進(jìn)行多維氣相色譜和質(zhì)譜檢測器分析，極低煙堿含量煙絲樣品萃取液經(jīng)自動固相微萃取后進(jìn)行多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。該方法采用多維氣相氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了s-(-)-尼古丁和r-(+)-尼古丁的較好分離，r-(+)-尼古丁的檢出限(lod)為0.25％，但是該方法耗時較長，56min才能實(shí)現(xiàn)對兩種手性異構(gòu)體的拆分。目前未見到超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對煙堿旋光異構(gòu)體進(jìn)行分離及定量檢測的相關(guān)報道。作為一種新興的檢測技術(shù)，合相色譜以無毒、不易燃且不污染環(huán)境的超臨界流體co2作為主要流動相，是一種真正的綠色環(huán)保技術(shù)，相比于液相色譜和氣相色譜有很多突出優(yōu)勢，對于結(jié)構(gòu)類似物、異構(gòu)體、對映體和非對映異構(gòu)體具有很好的分離度和選擇性，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜檢測器的使用能提高檢測的靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種煙草中煙堿旋光異構(gòu)體的測定方法，該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，靈敏度高，耗時短，對環(huán)境友好。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

煙草中煙堿旋光異構(gòu)體的測定方法，包括以下步驟：

(1)稱取0.1～0.2g煙末樣品，加入10～20ml體積濃度5％的hac水溶液，超聲提取后過濾，稀釋，得到待測溶液；

(2)取待測溶液進(jìn)行超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(upc²-ms/ms)分析，分析條件如下：

色譜條件：色譜柱為trefoil^tmcel1柱，150mm×2.1mm，2.5μm；柱溫：10℃；進(jìn)樣量：1μl；流動相a：co2，流動相b：含0.1～0.2％(v/v)nh3·h2o的甲醇溶液；流速：1ml/min；背壓：1500psi；補(bǔ)償溶劑：0.1％甲酸的甲醇(v/v)；流速：0.2ml/min；洗脫梯度：0～3min，流動相a97％，流動相b3％；3～3.5min，流動相a84％，流動相b16％；3.5～5min，流動相a84％，流動相b16％；5min以后，流動相a97％，流動相b3％；

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源(esi)；溫度：150℃；毛細(xì)管電壓：3.0kv；去溶劑氣溫度：300℃；去溶劑氣流速：650l/h；反吹氣流速：50l/h；多反應(yīng)監(jiān)測模式(mrm)：s-(-)-尼古丁的保留時間為2.25～2.27min，r-(+)-尼古丁的保留時間為2.38～2.42min，母離子163.02m/z，子離子129.97*m/z和116.96m/z，*為定量離子，錐孔電壓36v，碰撞能18v和26v；

(3)采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量計算樣品中s-(-)-尼古丁和r-(+)-尼古丁的含量。

步驟(1)在稱取煙末樣品前，先參照yc/t31-1996的方法測定樣品水分含量。測定水分含量的目的是扣除煙末樣品中的水分，計算煙堿旋光異構(gòu)體在樣品干基中的含量。

步驟(1)中超聲提取的功率為100w，頻率為40khz，提取時間30～50min。

步驟(1)中過濾可采用0.22μm的水相濾膜。

步驟(1)中稀釋可采用異丙醇作為稀釋溶劑。取濾液30～60μl，用異丙醇稀釋定容至10ml，即得待測溶液。

步驟(3)中外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法為：配制含s-(-)-尼古丁和r-(+)-尼古丁目標(biāo)物的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以目標(biāo)物的色譜峰面積對其濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；將步驟2)的分析結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到待測溶液中目標(biāo)物的濃度；再計算得到樣品中s-(-)-尼古丁和r-(+)-尼古丁的含量。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明首次建立了煙草中兩種尼古丁旋光異構(gòu)體的超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，通過超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對煙草樣品中煙堿旋光異構(gòu)體進(jìn)行手性拆分和定量分析檢測。該方法在樣品前處理過程只用到少量的乙酸溶液和異丙醇溶液，輔助超聲提取等手段，操作簡單，試劑毒性小。雖然ms/ms檢測器中的esi源存在可能的基質(zhì)效應(yīng)，但是由于儀器本身檢測靈敏度高，并且樣品普遍含量高，需要對樣品高比例稀釋，高比例的稀釋將基質(zhì)效應(yīng)弱化，因此又免去了復(fù)雜的凈化過程。檢測過程所用到的試劑為co2和極少量的甲醇，具有環(huán)境友好等突出優(yōu)點(diǎn)。由于目前氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定煙堿旋光異構(gòu)體所需時間較長(140min)，本發(fā)明方法與其相比較又具有檢測效率較高的特點(diǎn)，在3min時間內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)兩種旋光體的拆分，一個樣品檢測完成時間為5min，可以實(shí)現(xiàn)批量樣品的快速測定，可為藥學(xué)和吸煙與健康方面的研究提供技術(shù)支持。

本發(fā)明檢測方法的精密度<6％，s-(-)-尼古丁的檢出限為10.4ng/ml，定量限為34.6ng/ml，r-(+)-尼古丁的檢出限為6.6ng/ml，定量限為22ng/ml。檢測結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，靈敏度高，適用于煙草樣品中煙堿旋光異構(gòu)體的分離和檢測。由于該方法實(shí)現(xiàn)了煙草中煙堿不同旋光異構(gòu)體的測定，且測定結(jié)果準(zhǔn)確，不僅可以對煙堿旋光異構(gòu)體的含量比例進(jìn)行計算，也間接實(shí)現(xiàn)了煙草中煙堿含量的測定，因此可以用來測定計算煙草中總煙堿含量，是目前煙草中煙堿檢測效率最高的色譜類測定方法。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的總離子流圖；

圖2為實(shí)施例1中烤煙樣品的總離子流圖；

圖3為實(shí)施例2中白肋煙樣品的總離子流圖；

圖4為實(shí)施例3中香料煙樣品的總離子流圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。

實(shí)施例1

烤煙中煙堿旋光異構(gòu)體的測定方法，包括以下步驟：

(1)樣品前處理

按照yc/t31-1996的方法對煙末樣品中的水分進(jìn)行測定；

稱取0.1g(精確至0.0001g)煙末樣品于50ml的具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入10ml5％(v/v)hac水溶液；將三角瓶置于超聲儀中，以100w功率超聲提取40min；用0.22μm水相濾膜對提取液進(jìn)行過濾，取200μl濾液以異丙醇稀釋定容至10ml的容量瓶中，得到待測溶液；

(2)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制包括s-(-)-尼古丁和r-(+)-尼古丁單標(biāo)儲備液的配制、s-(-)-尼古丁和r-(+)-尼古丁混標(biāo)儲備液的配制以及系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制，具體配制過程如下：

單標(biāo)儲備液：以異丙醇作為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為3.2mg/ml的s-(-)-尼古丁和2.83mg/ml的r-(+)-尼古丁單標(biāo)儲備液；

混標(biāo)儲備液：分別移取1mls-(-)-尼古丁和0.1mlr-(+)-尼古丁的單標(biāo)儲備液于10ml的容量瓶中，以異丙醇定容，即得兩種尼古丁旋光異構(gòu)體的混標(biāo)儲備液；

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取50、125、250、500、1250μl的兩種尼古丁旋光異構(gòu)體的混標(biāo)儲備液，以異丙醇稀釋定容至10ml，得到系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中s-(-)-尼古丁的濃度為1.6、4.0、8.0、16.0、40.0μg/ml，r-(+)-尼古丁的濃度為141.5、353.75、707.5、1415、3537.5ng/ml；

(3)upc²-ms/ms分析

將5種濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行upc²-ms/ms分析，分析條件如下：

色譜條件：色譜柱為trefoil^tmcel1柱，150mm×2.1mm，2.5μm；柱溫：10℃；進(jìn)樣量：1μl；流動相a：co2，流動相b：含0.1～0.2％(v/v)nh3·h2o的甲醇溶液；流速：1ml/min；背壓：1500psi；補(bǔ)償溶劑：0.1％甲酸的甲醇(v/v)；流速：0.2ml/min；洗脫梯度見下表1；

表1洗脫梯度

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源(esi)；溫度：150℃；毛細(xì)管電壓：3.0kv；去溶劑氣溫度：300℃；去溶劑氣流速：650l/h；反吹氣流速：50l/h；多反應(yīng)監(jiān)測模式(mrm)，詳細(xì)參數(shù)見下表2；

表2兩種尼古丁旋光異構(gòu)體的mrm參數(shù)

注：*為定量離子。

以目標(biāo)物的色譜峰面積對目標(biāo)物的濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程、相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見下表3，b3級標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(s-(-)-尼古丁濃度為8.0μg/ml，r-(+)-尼古丁濃度為707.5ng/ml)的總離子流圖見圖1；

表3標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中兩種尼古丁旋光異構(gòu)體的線性擬合結(jié)果

(4)結(jié)果分析

取待測溶液進(jìn)行超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量計算煙草樣品中尼古丁旋光異構(gòu)體的含量(均以干基計)，結(jié)果見下表4，總離子流圖見圖2。

實(shí)施例2

白肋煙中煙堿旋光異構(gòu)體的測定方法，包括以下步驟：

(1)樣品前處理

按照yc/t31-1996的方法對煙末樣品中的水分進(jìn)行測定；

稱取0.1g(精確至0.0001g)煙末樣品于50ml的具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入10ml5％(v/v)hac水溶液；將三角瓶置于超聲儀中，以100w功率超聲提取40min；用0.22μm水相濾膜對提取液進(jìn)行過濾，取200μl濾液以異丙醇稀釋定容至10ml的容量瓶中，得到待測溶液；

其他操作同實(shí)施例1，測定結(jié)果見下表4，總離子流圖見圖3。

實(shí)施例3

香料煙中煙堿旋光異構(gòu)體的測定方法，包括以下步驟：

(1)樣品前處理

按照yc/t31-1996的方法對煙末樣品中的水分進(jìn)行測定；

稱取0.1g(精確至0.0001g)煙末樣品于50ml的具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入10ml5％(v/v)hac水溶液；將三角瓶置于超聲儀中，以100w功率超聲提取40min；用0.22μm水相濾膜對提取液進(jìn)行過濾，取500μl濾液以異丙醇稀釋定容至10ml的容量瓶中，得到待測溶液；

其他操作同實(shí)施例1，測定結(jié)果見下表4，總離子流圖見圖4。

表4實(shí)施例中3種煙草樣品尼古丁旋光異構(gòu)體的測定結(jié)果

從表4可知，在所測三種煙草樣品中，僅在香料煙中發(fā)現(xiàn)了r-(+)-尼古丁的信號。

試驗(yàn)例

(1)精密度測定

對同一香料煙樣品按照上述提取和測定條件平行測定6次，計算6次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd，結(jié)果見下表5。

表5精密度測定結(jié)果

從表5可知，本發(fā)明檢測方法的測定結(jié)果rsd<8％，精密度良好。

(2)檢出限和定量限測定

通過對最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用upc²-ms/ms連續(xù)測定10次，計算檢出結(jié)果的sd，以3sd為檢出限，10sd為定量限，計算得到s-(-)-尼古丁的檢出限為10.4ng/ml，定量限為34.6ng/ml，r-(+)-尼古丁的檢出限為6.6ng/ml，定量限為22ng/ml。

(3)本發(fā)明檢測方法與連續(xù)流動分析法的對比

將實(shí)施例1～3測得的煙末樣品中尼古丁的含量與連續(xù)流動分析法的測定結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果見下表6。

表6本發(fā)明檢測方法與傳統(tǒng)方法的比對結(jié)果

從表6可知，本發(fā)明檢測方法的測定結(jié)果與傳統(tǒng)方法的測定結(jié)果一致性較好。