本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能夠驗證酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
定量蛋白質(zhì)組學(xué)的目的是對復(fù)雜的混合體系中所有的蛋白質(zhì)進行鑒定，并對蛋白質(zhì)的量及量的變化進行準確的測定，是當前生命科學(xué)研究的重要內(nèi)容。近年來，由于質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)的進步，定量蛋白質(zhì)組學(xué)在分析蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組方面已取得了令人矚目的成就。
在種種成熟的蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)中，最普遍的技術(shù)是基于三重四極桿質(zhì)譜(triplequadrupole)，在選擇反應(yīng)監(jiān)控模式(selectedreactionmonitoring，srm)下對蛋白質(zhì)中特異肽進行檢測。在完全酶解的情況下，特異肽的摩爾濃度與對應(yīng)蛋白質(zhì)的摩爾濃度相同，故可以通過其與蛋白質(zhì)分子量計算獲得蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。如公開號為cn103616454a的專利文獻公開了一種定量檢測人β-酪蛋白含量的方法以及試劑盒，該方法中利用人β-酪蛋白酶解后所獲得的特異多肽序列，設(shè)計出同位素標記的特異肽和同位素標記內(nèi)標物的序列，并基于內(nèi)標法對人β-酪蛋白進行定量檢測。
在過去的10年間，雖然產(chǎn)生了許多方法提高特異肽的檢測準確度，主要包括各種同位素內(nèi)標標記策略，但是一直缺乏一種簡單有效的方法，用于驗證蛋白質(zhì)是否完全酶解、目標特異肽是否完全從蛋白質(zhì)中釋放出來。如果不對蛋白質(zhì)酶解效果進行有效的驗證，對于后續(xù)所有的提高特異肽檢測準確度的研究也就無從說起。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種能夠驗證酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，可以對特異肽是否已完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到，進行有效的驗證，以獲得準確的特異肽的濃度。
本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種能夠驗證酶解效果的基于酶解多肽原理的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，包括：
(1)采用酶對待測蛋白質(zhì)樣品進行酶解，得到酶解物；
(2)對所述酶解物中驗證肽和特異肽進行檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果驗證待測蛋白質(zhì)樣品的酶解效果；
(3)若通過酶解效果驗證，表示特異肽已完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到，則用所獲得的特異肽濃度乘以待測蛋白質(zhì)樣品的分子量獲得蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度；
(4)若未通過酶解效果驗證，表示特異肽未完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到，則將酶解物再次進行酶解優(yōu)化處理；
所述驗證肽中至少含有一個或一個以上在待測蛋白質(zhì)中最后被所述酶所酶解的位點；或，所述驗證肽為所述特異肽向n端或者c端延長至一個或一個以上酶解位點的多肽。
本發(fā)明通過檢測酶解物中的驗證肽來判斷蛋白質(zhì)是否被完全酶解、所有特異肽是否從蛋白質(zhì)中完全釋放出來。本發(fā)明中對于驗證肽的選擇來說，可以選擇含有最難以被酶解(酶解時間最長)的酶解位點的多肽作為驗證肽，若含有最難以酶解位點的多肽已經(jīng)酶解完全，那么則特異肽已完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到。
一般來說，為每個蛋白質(zhì)只需選擇一條多肽作為特異肽。在此情況下，所以無需追求蛋白質(zhì)徹底水解，只要保證所選擇的特異肽完全釋放出來即可。因此本發(fā)明在此情況下，本發(fā)明還可以選擇特異肽向n端或者c端延長至一個或一個以上酶解位點的多肽作為驗證肽。
本發(fā)明中驗證肽的選擇有多種，作為優(yōu)選，所述驗證肽為所述特異肽向特異肽的n端延長至下一個酶解位點的多肽。對于位于蛋白質(zhì)c端的特異肽，可以選擇向n端延伸至下一個酶解位點的多肽作為驗證肽。
作為優(yōu)選，所述驗證肽為所述特異肽向特異肽的c端延長至下一個酶解位點的多肽。對于位于蛋白質(zhì)n端的特異肽，可以選擇向c端延伸至下一個酶解位點的多肽作為驗證肽。
作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述驗證肽和特異肽采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時檢測。本發(fā)明中對驗證肽進行檢測時，可以采用與特異肽相同的檢測方法，其中預(yù)處理方法和儀器通用參數(shù)與特異肽完全一致，僅增加驗證肽專屬的srm參數(shù)。因此本發(fā)明可以在不增加實驗操作和成本的前提下，僅通過參數(shù)的設(shè)置即實施成本發(fā)明，從而本發(fā)明具有很高的便利性和實用性。
本發(fā)明中采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對驗證肽進行檢測時，為了降低檢測誤差，本發(fā)明需要合理設(shè)置驗證肽的檢測參數(shù)，由于儀器品牌型號、狀態(tài)、信號的表達方式的差異，相同濃度的驗證肽在不同設(shè)備上所產(chǎn)生的信號也不同。所以驗證肽的閾值無法是一個絕對值，而是是一個相對值，作為優(yōu)選，所述驗證肽的信號強度閾值設(shè)置為所述特異肽信號強度的1％。若驗證肽的信號強度小于所述驗證肽的信號強度閾值時，則特異肽已完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到，反之，特異肽未完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到。
作為優(yōu)選，所述驗證肽的信噪比低于3。若驗證肽的信號強度小于所述驗證肽的信噪比時，則特異肽已完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到，反之，特異肽未完全從待測蛋白質(zhì)樣品酶解得到。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
本發(fā)明中若酶解產(chǎn)物中含有所述驗證肽時，則特異肽未完全從待測蛋白質(zhì)樣品中酶解得到，待測蛋白質(zhì)樣品還需再次進行酶解，可以再一次進行酶解優(yōu)化處理，并重復(fù)對驗證肽和特異肽的檢測過程，直至酶解產(chǎn)物中不含有所述驗證肽；反之，若酶解產(chǎn)物中未含有所述驗證肽時，則特異肽完全從待測蛋白質(zhì)樣品中酶解得到，因此本發(fā)明可以通過對驗證肽的檢驗來驗證蛋白質(zhì)的酶解效果，從而可以對于待測蛋白質(zhì)是否酶解完全釋放得到所對應(yīng)的特異肽進行鑒定，以獲得準確的特異肽的濃度，進而準確的換算出待測蛋白質(zhì)的含量。
具體實施方式
實施例1(驗證肽的篩選方法)
取1mgβ乳球蛋白，溶于1ml水中。取100μl上述溶液，于2ml塑料離心管中，依次加入10μl二硫蘇糖醇溶液(100mmol/l)和865μl碳酸氫銨溶液(500mm)，混合均勻后在70℃水浴鍋中孵育30min；加入10μl碘代乙酰胺(300mmol/l)溶液，混合均勻后在室溫環(huán)境中避光靜置30min；加入胰蛋白酶溶液10μl，于37℃水浴鍋中反應(yīng)10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、180、240min；樣品在完成反應(yīng)后迅速加入5μl甲酸溶液，通過0.22μm濾膜過濾。上述樣品首先在高分辨質(zhì)譜進行多肽的篩選，其高效液相色譜參數(shù)如下：
高效液相色譜儀：thermoscientificeasy-nlc1000；
色譜柱：easy-spraycolumn(c18，2μm，
上樣量：2μl；
流動相：a相：含0.1％甲酸、2％乙腈的水溶液；b相：含0.1％甲酸的乙腈溶液；
液相色譜梯度：b相在2分鐘內(nèi)從3上升至8％，在80分鐘內(nèi)從8％上升至20％，在10分鐘內(nèi)從20％上升至30％，在5分鐘內(nèi)從30％上升至70％，在3分鐘內(nèi)從70％上升至90％，在90％維持20分鐘。
流速：250nl/min；
質(zhì)譜參數(shù)如下：
質(zhì)譜儀：thermoscientificqexactive；
噴霧電壓：2kv；
毛細管溫度：250℃；
s-lens：55％；
碰撞能量：27％hcd；
分辨率設(shè)置：一級70000@m/z200，二級17500@m/z200；
母離子掃描范圍：m/z300-1800；
子離子掃描范圍：從m/z100開始；
data-dependentms/ms：top20；
多肽篩查軟件設(shè)置如下：
蛋白質(zhì)一級序列數(shù)據(jù)庫：p02754(采集自uniprotkb)；
蛋白酶：胰蛋白酶；
最大漏切位點：1；
固定修飾：c烷基化；
可變修飾：m氧化；
通過上述方法所測得包含1個漏切位點的多肽可視作候選驗證肽，通過觀察其峰面積來考察其酶解狀況，隨著酶解時間的增加，驗證肽首先從蛋白質(zhì)中釋放出來，然后進一步酶解成不含有漏切位點的多肽，所以驗證肽的信號強度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在這些驗證肽所需的完全酶解時間，即他們的信號低于閾值所需的時間見表1，其中，多肽(序列為seqidno.3)所需要的酶解時間為90min，最難以酶解，因此可將多肽(序列為seqidno.3)作為驗證肽使用。
表1β乳球蛋白酶解得到的包含1個漏切位點的多肽完全酶解的時間
實施例2(應(yīng)用實施例1驗證肽來檢測樣品中β乳球蛋白質(zhì)的含量)
樣品預(yù)處理方式：稱取10g樣品于100ml容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度。取上述溶液10μl于2ml塑料離心管中，依次加入10μl同位素特異肽溶液、10μl二硫蘇糖醇溶液(100mmol/l)和945μl碳酸氫銨溶液(500mm)，混合均勻后在70℃水浴鍋中孵育30min；加入10μl碘代乙酰胺(300mmol/l)溶液，混合均勻后在室溫環(huán)境中避光靜置30min；加入胰蛋白酶溶液10μl，于37℃水浴鍋中反應(yīng)90min；加入5μl甲酸溶液，通過0.22μm濾膜過濾，進樣分析。
上述特異肽和驗證肽的檢測通道參數(shù)見表2，其中液相色譜條件和質(zhì)譜條件高效液相色譜分離條件如下：
色譜柱為c18色譜柱，柱溫為40℃；流動相a為體積百分比為0.1％的甲酸的乙腈溶液，流動相b為體積百分比為0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.3ml/min；
其中，梯度洗脫為：
流動相a的體積百分比由3％耗時10min上升至40％，對應(yīng)地流動相b的體積百分比由97％耗時10min下降至60％，然后改為100％流動相a沖洗2min，最后改為流動相a體積百分比3％和流動相b體積百分比97％保留3min；
進樣分析質(zhì)譜條件：
毛細管電壓：3.5kv；錐孔電壓：35kv；脫溶劑溫度：500℃；脫溶劑氣流量：900l/min；錐孔反吹氣流量：30l/hr；碰撞室壓力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5v；高端分辨率1：15.0v；離子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8v；高端分辨率2：15.0v；離子能量2：1.0；離子源溫度：150℃；提取器電壓：3.0v；入口透鏡電壓：0.5v；出口電壓：0.5v；碰撞梯度：1.0。
特異肽標準曲線預(yù)處理方式：將合成的特異肽用水稀釋，配制成系列標準曲線溶液，取10μl標準曲線溶液，依次加入10μl混合同位素特異肽溶液、10μl二硫蘇糖醇溶液(100mmol/l)和845μl碳酸氫銨溶液(500mm)，混合均勻后在70℃水浴鍋中孵育30min；加入10μl碘代乙酰胺(300mmol/l)溶液，混合均勻后在室溫環(huán)境中避光靜置30min，加入5μl甲酸溶液，通過0.22μm濾膜過濾，進樣分析，分析參數(shù)同上。
樣品計算方式：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度＝特異肽的摩爾濃度×蛋白質(zhì)的分子量
表2特異肽和驗證肽的檢測通道參數(shù)
同位素特異肽與特異肽的序列相同，區(qū)別僅在于，同位素特異肽與特異肽上中的某些元素互為同位素。結(jié)果顯示，在90min的酶解時間之后，驗證肽無法被測得，說明該樣品已經(jīng)完全酶解，該樣品中β乳球蛋白的含量為1.94g/100g；當酶解時間延長至180min，測得的β乳球蛋白沒有顯著性增加，說明通過驗證肽可以有效判斷蛋白質(zhì)是否完全酶解。
實施例3(驗證肽的篩選方法)
對于部分蛋白質(zhì)來說，難以完全酶解，所以難以通過如實施例1所述的驗證肽進行驗證。本實施例確定特異肽之后，以特異肽為基礎(chǔ)，向特異肽的n端或者c端延伸到下一個酶解位點的多肽作為驗證肽，當驗證肽信號值低于閾值時，可以認為對應(yīng)的特異肽已經(jīng)完全從蛋白質(zhì)中釋放出來了。
對于位于蛋白質(zhì)n端的特異肽，可以選擇向c端延伸至下一個酶解位點的多肽作為驗證肽。對于位于蛋白質(zhì)c端的特異肽，可以選擇向n端延伸至下一個酶解位點的多肽作為驗證肽。
驗證肽的篩選中儀器參數(shù)與實施例1相同。具體例子：
牛κ酪蛋白的特異肽為seqidno.14，其向n端延伸的驗證肽序列為seqidno.15，向c端延伸的驗證肽序列為seqidno.16，兩條驗證肽完全酶解時間均為60min，所以只需選擇其中一條用于驗證，無需同時監(jiān)控兩條驗證肽。(見表3)牛β酪蛋白的特異肽為seqidno.17，由于它位于蛋白質(zhì)的c端，所以候選驗證肽只有一條，為：seqidno.18。(見表4)
表3牛κ酪蛋白特異肽、同位素特異肽和驗證肽的檢測通道參數(shù)
表4牛β酪蛋白特異肽、同位素特異肽和驗證肽的檢測通道參數(shù)
實施例4
本實施例以可可奶為基質(zhì)驗證本發(fā)明準確性，操作方法如下：
樣品預(yù)處理方式：稱取10g可可粉于100ml容量瓶中，加入1mg/mlβ酪蛋白100μl，用水溶解并定容至刻度。取上述溶液10μl于2ml塑料離心管中，依次加入10μl同位素特異肽溶液、10μl二硫蘇糖醇溶液(100mmol/l)和945μl碳酸氫銨溶液(500mm)，混合均勻后在70℃水浴鍋中孵育30min；加入10μl碘代乙酰胺(300mmol/l)溶液，混合均勻后在室溫環(huán)境中避光靜置30min；加入胰蛋白酶溶液10μl，于37℃水浴鍋中反應(yīng)60min和180min；加入5μl甲酸溶液，通過0.22μm濾膜過濾，進樣分析。
后續(xù)預(yù)處理和檢測與實施例2相同，srm參數(shù)見表4。
結(jié)果顯示，樣品酶解時間為60min時，樣品中驗證肽的信號值高于閾值，說明該樣品未完全酶解，回收率僅為63.8％，原因是可可粉中含有的基質(zhì)會影響胰蛋白酶活力，導(dǎo)致其酶解時間增加。在沒有完全酶解驗證方法的情況下，無法對這種酶活力降低的情況進行準確預(yù)期。而將酶解時間增加到180min后，驗證肽的信號值顯著下降，低于閾值，此時回收率為98.1％，符合本發(fā)明的預(yù)期。