本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用cd45免疫熒光聯(lián)合cep17熒光原位雜交探針鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells,ctcs)是指是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，因自發(fā)或診療操作從實(shí)體腫瘤病灶(原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)脫落釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，大部分ctcs在進(jìn)入外周血后發(fā)生凋亡或被吞噬，少數(shù)能夠逃逸并錨著發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶。近幾年ctcs在腫瘤診斷、治療和監(jiān)控等方面的臨床表現(xiàn)逐漸嶄露頭角，是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無(wú)創(chuàng)診斷和實(shí)時(shí)療效監(jiān)測(cè)手段，臨床應(yīng)用價(jià)值極其顯著。與傳統(tǒng)的影像學(xué)診斷、內(nèi)窺鏡檢查以及病理學(xué)診斷相比，優(yōu)勢(shì)顯著，可更加敏感地發(fā)現(xiàn)疾病的變化，更加科學(xué)、迅速的評(píng)價(jià)某一治療方案的效果。而且分離富集ctcs只需抽取患者少量外周血，對(duì)患者沒(méi)有副作用，因此可以高頻度的監(jiān)測(cè)，達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的目的。更為重要的是，ctcs可作為分析患者腫瘤生物學(xué)特征的實(shí)時(shí)樣本，可以發(fā)現(xiàn)患者的實(shí)時(shí)生物學(xué)變化，并根據(jù)結(jié)果及時(shí)調(diào)整治療方案，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)的個(gè)體化治療。

ctcs富集捕獲的方法基本上基于以下三種原理：免疫捕獲、細(xì)胞大小、其他特征的識(shí)別(如細(xì)胞密度、電荷、形變能力等)，前兩種是目前應(yīng)用較多的方法。捕獲后對(duì)ctcs鑒定是實(shí)現(xiàn)ctcs運(yùn)用于臨床腫瘤患者的療效實(shí)時(shí)評(píng)估、病情實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、指導(dǎo)用藥和預(yù)后判斷的關(guān)鍵。鑒定ctcs最常用的方法主要有6種方法：(1)免疫熒光法；(2)流式細(xì)胞法；(3)熒光原位雜交法；(4)rt-pcr；(5)基因芯片法；(6)二代測(cè)序法。免疫熒光法和流式細(xì)胞法基于ctcs膜蛋白特征鑒定技術(shù)；熒光原位雜交法、rt-pcr、基因芯片法和二代測(cè)序法基于ctcs核酸特征鑒定技術(shù)。

免疫熒光是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，使熒光素標(biāo)記的抗體與特異的腫瘤標(biāo)志物(主要包括上皮細(xì)胞角蛋白、上皮細(xì)胞膜特異性抗原等)結(jié)合，通過(guò)酶和底物反應(yīng)顯色來(lái)判斷腫瘤細(xì)胞的存在。免疫熒光是檢測(cè)ctcs的成熟方法之一，簡(jiǎn)便、直觀并可以進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，但其敏感性只有10⁵左右，而且許多分化差的腫瘤不能表達(dá)目標(biāo)抗原，而非上皮細(xì)胞中細(xì)胞角蛋白和上皮細(xì)胞抗原亦可能陽(yáng)性，加之鏡下對(duì)結(jié)果觀察和判讀的主觀性較強(qiáng)，這些都限制了免疫熒光在ctcs檢測(cè)中的應(yīng)用。

熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，fish)是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。fish的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于dna分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以用探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。熒光原位雜交技術(shù)在應(yīng)用于檢測(cè)ctcs染色體多倍體，基因斷裂，基因融合時(shí)，由于捕獲的ctcs中存在大量的血細(xì)胞背景，在熒光顯微鏡下，尋找目標(biāo)ctcs極為困難，從而限制了fish技術(shù)在ctcs中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，目的在于提供一種應(yīng)用cd45免疫熒光聯(lián)合cep17熒光原位雜交探針鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種應(yīng)用cd45免疫熒光聯(lián)合cep17熒光原位雜交探針鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑盒，包括：固定液、2×ssc、0.3％np-40/0.4×ssc、0.075mkcl溶液、cd45單抗和cep17探針混合液、dapi復(fù)染劑、穿孔劑、封閉液和封片劑。

上述方案中，所述cd45單抗和cep17探針混合液的組分為熒光標(biāo)記cd45單抗、cep17熒光原位雜交探針、硫酸葡聚糖、去離子甲酰胺、bsa、ssc、triton-100。

上述方案中，所述cd45單抗和cep17探針混合液各組分的濃度為：熒光標(biāo)記cd45單抗的濃度為0.002mg/ml，cep17熒光原位雜交探針的濃度為2ng/μl，硫酸葡聚糖10％(質(zhì)量濃度)、去離子甲酰胺50％(體積濃度)、bsa1％(質(zhì)量濃度)、6×ssc、triton-1001‰(體積濃度)。

上述方案中，所述固定液為甲醇和冰乙酸按體積比3:1混合所得混合液。

上述方案中，所述穿孔劑的組分為5‰tritonx-100、0.1m磷酸鹽緩沖液。

上述方案中，所述封閉液的組分為5％的bsa。

上述方案中，所述封片劑為樹脂。

上述試劑盒在制備用于鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)品中的應(yīng)用，具體地包括如下步驟：

(1)收獲細(xì)胞：將捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞樣本(ctcs)吸至尖底離心管，離心、去上清；

(2)低滲：加入預(yù)溫至37℃的0.075mol/lkcl溶液6～8ml，用吸管吹打混勻后置37℃溫箱20～30min；

(3)預(yù)固定：加入固定液2ml，吹打混勻，離心；

(4)吸去上清液，加新鮮配制的固定液5ml，吹打混勻，固定10min，離心；

(5)重復(fù)步驟(4)直至細(xì)胞沉淀洗白洗干凈；

(6)細(xì)胞懸液的制備：吸去上清液，加入適量固定液，制成濃度合適的細(xì)胞懸液(10×物鏡在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞密度，要求細(xì)胞無(wú)重疊，且單視野細(xì)胞數(shù)量在100～200個(gè)為宜)；

(7)制片：吸取3～5μl細(xì)胞懸液滴至防脫載玻片上，56℃老化0.5～2小時(shí)；

(8)封閉：向玻片加入100ul封閉液，室溫封閉10min后，2×ssc(ph7.0)漂洗5min；

(9)穿孔：滴加100ul穿孔劑，室溫封閉10min后，2×ssc(ph7.0)漂洗5min；

(10)脫水：將玻片依次置于70vt％(體積濃度)乙醇、85vt％乙醇和100vt％乙醇中各2min脫水后自然干燥玻片；

(11)雜交孵育：取出cd45單抗和cep17探針混合液，室溫靜置5分鐘，徹底混勻后短暫離心，取10μl滴于細(xì)胞滴片雜交區(qū)域，立即蓋上22mm×22mm的蓋玻片，探針在蓋玻片下應(yīng)均勻展開無(wú)氣泡，用樹脂封邊，將玻片置于雜交儀上進(jìn)行雜交孵育；

(12)洗滌：取出孵育后的玻片，去除蓋玻片上的橡皮膠，立即將玻片置于65℃～68℃0.3％np-40/0.4×ssc溶液中，振蕩10～20s脫去蓋玻片，浸泡5～10分鐘，將玻片置于37℃去離子水中，振蕩1～3s，浸泡2分鐘，暗處自然干燥玻片；

(13)封片：滴加10uldapi復(fù)染劑；

(14)閱片：在熒光顯微鏡下選用合適的濾光片觀察玻片；

(15)結(jié)果判定：a.cd45染色陽(yáng)性為白細(xì)胞；b.cd45未被染色，但呈巨大裸核，為非腫瘤細(xì)胞；c.cd45未被染色，信號(hào)點(diǎn)≥2個(gè)，非巨大裸核可以判斷為循環(huán)腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)。

上述方案中，步驟(11)所述雜交孵育的條件為：75℃變性2分鐘，37℃孵育2小時(shí)。

本發(fā)明的有益效果如下：

(1)本發(fā)明采用免疫熒光聯(lián)合熒光原位雜交技術(shù)鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞，克服了免疫熒光檢測(cè)或熒光原位雜交檢測(cè)單一技術(shù)檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果不能充分證實(shí)為循環(huán)腫瘤細(xì)胞的缺點(diǎn)，減少循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定的錯(cuò)誤；

(2)本發(fā)明采用cd45免疫熒光抗體聯(lián)合cep17熒光原位雜交探針鑒定捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，通過(guò)一步法完成了免疫熒光和熒光原位雜交檢測(cè)，一步法雜交孵育在2h內(nèi)快速完成，大大減少了檢測(cè)時(shí)間；

(3)本發(fā)明中所述cep17探針采用非重復(fù)序列技術(shù)制備而成，減少了常規(guī)cep17探針因?yàn)橹貜?fù)序列導(dǎo)致的非特異性雜交信號(hào)，能有效減少循環(huán)腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)錯(cuò)誤；同時(shí)該技術(shù)制備的cep17探針能夠在2個(gè)小時(shí)內(nèi)快速完成雜交，比傳統(tǒng)探針的16～24小時(shí)雜交時(shí)間，大大縮短。

附圖說(shuō)明

圖1為本試劑盒鑒定捕獲的循環(huán)腫瘤，其中a細(xì)胞未被cd45染紅色，同時(shí)核中含有多個(gè)(＞2個(gè))熒光原位雜交信號(hào)，該細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞；b細(xì)胞被cd45染紅色，核中含有2個(gè)熒光信號(hào)點(diǎn)，該細(xì)胞為血液細(xì)胞(白細(xì)胞)。

圖2為本試劑盒鑒定捕獲的循環(huán)腫瘤，其中a細(xì)胞未被cd45染紅色，同時(shí)核中含有2個(gè)熒光原位雜交信號(hào)，該細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞，該樣本多個(gè)腫瘤細(xì)胞形成團(tuán)狀。

圖3為本試劑盒鑒定捕獲的循環(huán)腫瘤，其中a細(xì)胞未被cd45染紅色，同時(shí)核中含有多個(gè)(＞2個(gè))熒光原位雜交信號(hào)，該細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞；b細(xì)胞被cd45染紅色，核中含有2個(gè)熒光信號(hào)點(diǎn)，該細(xì)胞為血液細(xì)胞(白細(xì)胞)。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

實(shí)施例1

一種應(yīng)用cd45免疫熒光聯(lián)合cep17熒光原位雜交探針鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑盒，試劑盒的組成如下表1所示：

表1試劑盒組成

實(shí)施例2

使用實(shí)施例1所述試劑盒鑒定乳腺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞，采用的cd45單抗+17號(hào)染色體熒光原位雜交探針檢測(cè)，17號(hào)染色體熒光原位雜交探針特異性序列(seqidno.1)為：tgaacattcctttggatggagcaggtttgagacactctttttgtacaatctacaagtggatatttggacctctctgaggatttcgttggaaacgggataactgcacctaactaaacggaagcattctcagaaacttcttggtgatgtttgcattcaaatcccagagt

具體包括如下步驟：

(1)收獲細(xì)胞：將捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞樣本(ctcs)吸至尖底離心管，離心，1000轉(zhuǎn)/min，10min，去上清；

(2)低滲：加入預(yù)溫至37℃的0.075mol/lkcl溶液6～8ml，用吸管吹打混勻后置37℃溫箱20～30min；

(3)預(yù)固定：加入固定液2ml，吹打混勻，1000轉(zhuǎn)/min離心10min；

(4)吸去上清液，加新鮮配制的固定液5ml，吹打混勻，固定10min，1000轉(zhuǎn)/min離心10min；

(5)重復(fù)步驟(4)直至細(xì)胞沉淀洗白洗干凈；

(6)細(xì)胞懸液的制備：吸去上清液，加入適量固定液，制成濃度合適的細(xì)胞懸液；

(7)制片：吸取3～5μl細(xì)胞懸液滴至防脫載玻片上，56℃老化0.5～2小時(shí)；

(8)封閉：向玻片加入100ul封閉液，室溫封閉10min后，2×ssc(ph7.0)漂洗5min；

(9)穿孔：滴加100ul穿孔劑，室溫封閉10min后，2×ssc(ph7.0)漂洗5min；

(10)脫水：將玻片依次置于70vt％乙醇、85vt％乙醇和100vt％乙醇中各2min脫水后自然干燥玻片；

(11)雜交孵育：取出cd45單抗和cep17探針混合液，室溫靜置5分鐘，徹底混勻后短暫離心，取10μl滴于細(xì)胞滴片雜交區(qū)域，立即蓋上22mm×22mm的蓋玻片，探針在蓋玻片下應(yīng)均勻展開無(wú)氣泡，用樹脂封邊，將玻片置于雜交儀上，75℃變性2分鐘，37℃孵育2小時(shí)；

(12)洗滌：取出孵育后的玻片，去除蓋玻片上的橡皮膠，立即將玻片置于65℃～68℃0.3％np-40/0.4×ssc溶液中，振蕩10～20秒脫去蓋玻片，浸泡5～10分鐘，將玻片置于37℃去離子水中，振蕩1～3秒，浸泡2分鐘，暗處自然干燥玻片；

(13)封片：滴加10uldapi復(fù)染劑；

(14)閱片：在熒光顯微鏡下選用合適的濾光片觀察玻片。

檢測(cè)結(jié)果如圖1和圖2所示，圖1為本試劑盒鑒定捕獲的循環(huán)腫瘤，其中a細(xì)胞未被cd45染紅色，同時(shí)核中含有多個(gè)(＞2個(gè))熒光原位雜交信號(hào)，該細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞；b細(xì)胞被cd45染紅色，核中含有2個(gè)熒光信號(hào)點(diǎn)，該細(xì)胞為血液細(xì)胞(白細(xì)胞)。

圖2為本試劑盒鑒定捕獲的循環(huán)腫瘤，其中a細(xì)胞未被cd45染紅色，同時(shí)核中含有2個(gè)熒光原位雜交信號(hào)，該細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞，該樣本多個(gè)腫瘤細(xì)胞形成團(tuán)狀。

實(shí)施例3

使用本發(fā)明實(shí)施例所述試劑盒，應(yīng)用cd45免疫熒光和cep17熒光原位雜交聯(lián)合檢測(cè)胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞，17號(hào)染色體熒光原位雜交探針特異性序列(seqidno.1)為：

tgaacattcctttggatggagcaggtttgagacactctttttgtacaatctacaagtggatatttggacctctctgaggatttcgttggaaacgggataactgcacctaactaaacggaagcattctcagaaacttcttggtgatgtttgcattcaaatcccagagt

具體包括如下步驟：

(1)收獲細(xì)胞：抽取患者外周血10ml，采用市售的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲儀或試劑盒捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctcs)，捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞吸至尖底離心管，離心，1000轉(zhuǎn)/min，10min，去上清；

(2)低滲：加入預(yù)溫至37℃的0.075mol/lkcl溶液6～8ml，用吸管吹打混勻后置37℃溫箱20～30min；

(3)預(yù)固定：加入固定液2ml，吹打混勻，1000轉(zhuǎn)/min離心10min；

(4)吸去上清液，加新鮮配制的固定液5ml，吹打混勻，固定10min，1000轉(zhuǎn)/min離心10min；

(5)重復(fù)步驟(4)直至細(xì)胞沉淀洗白洗干凈；

(6)細(xì)胞懸液的制備：吸去上清液，加入適量固定液，制成濃度合適的細(xì)胞懸液；

(7)制片：吸取3～5μl細(xì)胞懸液滴至防脫載玻片上，56℃老化0.5～2小時(shí)；

(8)封閉：向玻片加入100ul封閉液，室溫封閉10min后，2×ssc(ph7.0)漂洗5min；

(9)穿孔：滴加100ul穿孔劑，室溫封閉10min后，2×ssc(ph7.0)漂洗5min；

(10)脫水：將玻片依次置于70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水后自然干燥玻片；

(11)雜交孵育：取出cd45單抗和cep17探針混合液，室溫靜置5分鐘，徹底混勻后短暫離心，取10μl滴于細(xì)胞滴片雜交區(qū)域，立即蓋上22mm×22mm的蓋玻片，探針在蓋玻片下應(yīng)均勻展開無(wú)氣泡，用樹脂封邊，將玻片置于雜交儀上，75℃變性2分鐘，37℃孵育2小時(shí)；

(12)洗滌：取出孵育后的玻片，去除蓋玻片上的橡皮膠，立即將玻片置于65℃～68℃0.3％np-40/0.4×ssc溶液中，振蕩10～20秒脫去蓋玻片，浸泡5～10分鐘，將玻片置于37℃去離子水中，振蕩1～3秒，浸泡2分鐘，暗處自然干燥玻片；

(13)封片：滴加10uldapi復(fù)染劑；

(14)閱片：在熒光顯微鏡下選用合適的濾光片觀察玻片。

檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。圖3為本試劑盒鑒定捕獲的循環(huán)腫瘤，其中a細(xì)胞未被cd45染紅色，同時(shí)核中含有多個(gè)(＞2個(gè))熒光原位雜交信號(hào)，該細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞；b細(xì)胞被cd45染紅色，核中含有2個(gè)熒光信號(hào)點(diǎn)，該細(xì)胞為血液細(xì)胞(白細(xì)胞)。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的實(shí)例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限制。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>武漢康錄生物技術(shù)股份有限公司

<120>一種應(yīng)用cd45免疫熒光聯(lián)合cep17探針鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用

<160>1

<210>1

<211>167bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgaacattcctttggatggagcaggtttgagacactctttttgtacaatctacaagtgga60

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