本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種poct定量檢測系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

目前以膠體金和熒光層析為代表的定量poct系統(tǒng)在臨床應(yīng)用上越來越廣泛。但是目前這一系統(tǒng)存在較大的問題就是檢測不穩(wěn)定，精密度比電化發(fā)光和臨床生化產(chǎn)品的檢測有很大差距，因此只能作為參考指標(biāo)用于病情初篩，而不能直接用于診斷。精密度差的一個重要原因是檢測時沒有獨立的內(nèi)標(biāo)物。

以熒光定標(biāo)poct為例說明目前提高精密度的方法。熒光定量poct在處理液中包含熒光物質(zhì)的抗體，當(dāng)樣本中的被測物與標(biāo)記了熒光微球的抗體反應(yīng)后，在檢測t線區(qū)域被捕獲，沒有接合被測物的標(biāo)記了熒光微球的抗體在檢測c線區(qū)域被捕獲，然后通過計算t線區(qū)域的熒光信號和c線區(qū)域的熒光信號比值來作為輸出。如果帶有標(biāo)記熒光微球的抗體全部被t線和c線捕獲時，輸出的信號沒有誤差，然而這只是理想情況。實際情況是標(biāo)記了熒光微球的抗體不能完全釋放，而且每個測試，釋放的比例也不盡相同，所以輸出就會與真實值存在偏差，這一偏差便是目前這一產(chǎn)品測量不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。

有人使用某些毒品的抗體作為獨立的內(nèi)標(biāo)物來解決這一問題，主要基于正常人體內(nèi)不含毒品抗體或抗原。因此這一方法對于無吸毒經(jīng)歷的人群，可取得了較好效果。但是當(dāng)患者有吸毒史，便會影響檢測。因此毒品的抗體作為獨立的內(nèi)標(biāo)物存在一定的缺陷。另一個問題是，現(xiàn)有紙層析poct產(chǎn)品，完全采用免疫反應(yīng)，反應(yīng)時間較長，一般為10～15分鐘，這么漫長的檢測時間會錯失醫(yī)生診斷挽救生命的時間。并且現(xiàn)有技術(shù)中使用抗體作為內(nèi)標(biāo)物，熒光檢測試劑上有大量熒光物質(zhì)殘留，從而使得檢測精度低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中沒有獨立內(nèi)標(biāo)物的紙層析技術(shù)，或采用以毒品的抗體作為獨立內(nèi)標(biāo)物的改進技術(shù)檢測中出現(xiàn)的不足(前者在檢測中由于載體釋放不完全導(dǎo)致重現(xiàn)性差，后者由于中患者隱瞞有吸毒史，導(dǎo)致檢測偏差)，以及檢測試劑上有大量熒光物質(zhì)殘留的技術(shù)問題，設(shè)計了用單鏈核酸作為獨立內(nèi)標(biāo)物的poct檢測系統(tǒng)。本系統(tǒng)解決了上述問題，一方面使產(chǎn)品的重現(xiàn)性即精度提高，而且提高了有吸毒史的患者檢測的準確性，另一方面也可以使檢測過程時間縮短，為醫(yī)生快速診斷提供保障。

本發(fā)明的poct定量檢測系統(tǒng)，其包括：測試試劑，該測試試劑包含標(biāo)記有第一抗體的載體和標(biāo)記有單鏈寡聚核苷酸a作為內(nèi)標(biāo)物的載體；至少一第一檢測試劑，所述第一檢測試劑包含第二抗體；和至少一第二檢測試劑，所述第二檢測試劑包含與單鏈寡聚核苷酸a序列互補的單鏈寡聚核苷酸a'；其中所述第一抗體與第二抗體分別可與樣本中的抗原發(fā)生反應(yīng)。

本發(fā)明采用核酸作為poct定量檢測系統(tǒng)的內(nèi)標(biāo)物，其基本原理為堿基互補配對原則，即在dna的分子結(jié)構(gòu)中，由于堿基之間的氫鍵具有固定的數(shù)目和dna兩條鏈之間的距離保持不變，使得堿基配對必須遵循一定的規(guī)律，這就是adenine(a，腺嘌呤)一定與thymine(t，胸腺嘧啶)，在rna中與uracil(u，尿嘧啶)配對，guanine(g，鳥嘌呤)一定與cytosine(c，胞嘧啶)配對，反之亦然。而且這種配對相對于免疫反應(yīng)，具有更高的專一性，因此可以解決使用傳統(tǒng)方法作為內(nèi)標(biāo)物的非特異性，提高檢測的準確性。

其中，所述poct定量檢測系統(tǒng)包括樣本流入?yún)^(qū)和樣本檢測區(qū)；所述樣本檢測區(qū)依次固定有所述第一檢測試劑和所述第二檢測試劑。

所述樣本流入?yún)^(qū)為滴入子區(qū)，滴入有測試試劑和具有抗原的樣本的混合液?；蛘?，所述樣本流入?yún)^(qū)具有滴入子區(qū)和釋放子區(qū)，所述滴入子區(qū)供含有抗原的樣本滴入；所述釋放子區(qū)固定有所述測試試劑。

所述第一抗體通過物理吸附或化學(xué)交聯(lián)的方法固定到載體上；所述單鏈寡聚核苷酸a通過物理吸附或化學(xué)交聯(lián)的方法固定到載體上。

所述載體為熒光膠球、磁珠、量子點、熒光素或納米金顆粒，優(yōu)選熒光膠球。

所述單鏈寡聚核苷酸a為人工合成或天然的不同于人基因序列的5～5000個堿基。

所述樣本檢測區(qū)依次包含固定有所述第一檢測試劑的第一檢測區(qū)和固定有所述第二檢測試劑的第二檢測區(qū)，所述第一檢測區(qū)為1～48個，優(yōu)選2個；所述第二檢測區(qū)為1～10個，優(yōu)選1個。

所述樣本檢測區(qū)之后還具有吸水區(qū)，所述poct定量檢測系統(tǒng)還包括一底板，所述滴入子區(qū)、釋放子區(qū)、樣本檢測區(qū)和吸水區(qū)依次設(shè)在所述底板上。

所述第一抗體為1～40個；所述第二抗體為1～40個。所述1～40個第一抗體，可與樣本中的1～40個不同抗原反應(yīng)；所述1～40個第二抗體也可與樣本中的1～40個不同抗原發(fā)生反應(yīng)，但是第一抗體與第二抗體是與樣本中1～40個抗原中的同一抗原發(fā)生反應(yīng)。

所述poct定量檢測系統(tǒng)可用傳統(tǒng)的紙層析方式：即該poct定量檢測系統(tǒng)包括一底板，所述滴入子區(qū)、釋放子區(qū)、樣本檢測區(qū)和吸水區(qū)依次設(shè)在所述底板上。poct定量檢測系統(tǒng)也可以為微管反應(yīng)：即該poct定量檢測系統(tǒng)包括一組管路，預(yù)先將第一檢測試劑和第二檢測試劑固定到管路中，當(dāng)測試試劑與樣本混合后，滴入樣本流入?yún)^(qū)，然后在第一檢測試劑和第二檢測試劑固定處發(fā)生反應(yīng)。

本發(fā)明的積極進步效果在于：與目前的方法相比，在方法上較目前存在巨大優(yōu)勢，一是相對與毒品的抗體采購容易，成本低廉。人的全基因測序已經(jīng)完成，因此完全可以設(shè)計出與人基因不同的序列，因此在檢測人體液時，不會受到干擾。當(dāng)使用核酸作為內(nèi)標(biāo)物時，由于核酸的反應(yīng)比蛋白更靈敏，因此反應(yīng)較快，因此相同條件下，使用核酸作為內(nèi)標(biāo)物，可以縮短檢測時間。而且檢測試劑上熒光物質(zhì)殘留大大減少。另外當(dāng)樣本中存在需要檢測的多個指標(biāo)抗原的時候，可以共用一個內(nèi)標(biāo)物，可以實現(xiàn)一個樣本檢測后，輸出多個結(jié)果，可以節(jié)約成本。而且針對不同的多指標(biāo)抗原，檢測系統(tǒng)更具有普適性，并且內(nèi)標(biāo)物的結(jié)合特異性更強。

附圖說明

圖1為poct定量檢測系統(tǒng)。

具體實施方式

如圖1所示，為本發(fā)明的poct定量檢測系統(tǒng)，下面具有一底板90，底板90上依次包括樣本流入?yún)^(qū)10，樣本流入?yún)^(qū)10又包括滴入?yún)^(qū)12如采用普通聚酯纖維材質(zhì)、釋放子區(qū)14如采用玻璃纖維材質(zhì)、檢測區(qū)20如采用硝酸纖維素膜材質(zhì)，包括第一檢測區(qū)22和第二檢測區(qū)24，和吸水區(qū)30如采用普通的吸水紙。釋放子區(qū)14預(yù)先處理有通過物理吸附或化學(xué)交聯(lián)等方法固定有第一抗體的載體和通過物理吸附或化學(xué)交聯(lián)等方法固定有單鏈寡聚核苷酸a的載體，第一抗體可與樣本中的抗原發(fā)生反應(yīng)結(jié)合。單鏈寡聚核苷酸a可為人工合成或天然的不同于人基因序列的5～5000個堿基。載體可為熒光膠球、磁珠、量子點、熒光素或納米金顆粒，優(yōu)選熒光膠球。第一檢測區(qū)22例如2個，22a和22b，針對單指標(biāo)抗原的樣本，22a和22b處可噴涂相同第二抗體的第一檢測試劑；針對雙指標(biāo)抗原的樣本，22a和22b處可噴涂含有兩種不同第二抗體的第一檢測試劑。該處噴涂的第二抗體可與樣本中的抗原發(fā)生反應(yīng)結(jié)合，從而捕獲樣本中的抗原；和第二檢測區(qū)24，例如1個，預(yù)先處理有含有與單鏈寡聚核苷酸a序列互補的單鏈寡聚核苷酸a'的第二檢測試劑，從而可捕獲單鏈寡聚核苷酸。最終，檢測在固定第一檢測試劑處的載體信號和固定第二檢測試劑處的載體信號以形成對照結(jié)果輸出。

實施例1單t線單指標(biāo)肌鈣蛋白熒光層析試劑檢測系統(tǒng)

材料：羧基熒光膠球，直徑300nm，貨號fc02f，購自bangslaboratories,inc.。

12bp氨基化單鏈dnag-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-精氨酸和12bp單鏈dnac-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

肌鈣蛋白抗體，貨號分別4t21cc和4t21，購自hytest。

方法：

1、按照bangslaboratories,inc.技術(shù)指導(dǎo)technote205文件中的相關(guān)說明，將10mg4t21cc抗體接到1mlfc02f上，然后用100mmol/ltris緩沖液稀釋10倍，編號latex1a備用。

2、按照bangslaboratories,inc技術(shù)指導(dǎo)technote302文件中的相關(guān)說明，將1mg氨基化單鏈dnag-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-精氨酸接到0.25mlfc02f上，然后用100mmol/ltris緩沖液稀釋2倍，編號latex2a備用。

3、將10mllatex1a和0.5mllatex2a混合，然后使用biodot的xyz3060處理平臺，將混合物噴到玻璃纖維上，圖1中的位置14。

4、使用biodot的xyz3060處理平臺，將10mg/ml的4t21的肌鈣蛋白抗體噴到圖1的位置22a處，位置22a處為硝酸纖維素材質(zhì)。位置22b不做噴涂。

5、使用biodot的xyz3060處理平臺，將2mg/ml的4t21的單鏈dnac-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c噴到圖1的位置24處。

檢測過程：將60μl心臟病患者血清樣本10份分別滴到10根上述熒光層析試劑的位置12，等待6分鐘。樣本中的肌鈣蛋白在位置14與步聚1制備的熒光抗體進行反應(yīng)，形成肌鈣蛋白抗原+抗體+熒光球的三聚體和不參加反應(yīng)的熒光球+單鏈dna。反應(yīng)完成后，液體層析到22a位置，三聚體被處理在這里的第二抗體捕獲。其余的液體繼續(xù)向前，流到位置24的時候，熒光球+單鏈dna上的dna被互補dna捕獲。之后通過儀器在波長610nm下測量位置22a和位置24上的載體熒光強度之比作為結(jié)果，輸出給上位機，上位機根據(jù)樣本中的肌鈣蛋白含量與結(jié)果的對應(yīng)關(guān)系，計算出樣本中的肌鈣蛋白含量。同時以武漢明德生物科技有限責(zé)任公司市售的熒光層析試劑為對照組，加上樣本后，反應(yīng)15分鐘，檢測，結(jié)果如表1所示。

結(jié)論：上述血清樣本滴加在10根上述的單t線單指標(biāo)肌鈣蛋白熒光層析試劑檢測系統(tǒng)，所得變異系數(shù)為4.2％。而市售武漢明德生物科技有限責(zé)任公司的肌鈣蛋白i(ctni)檢測試劑盒(免疫層析法)為9.2％。說明通過采取單鏈寡聚核苷酸作為獨立內(nèi)標(biāo)物后，檢測精密度有顯著提高。本實施例的檢測時間為6分鐘，低于市售產(chǎn)品的檢測時間為10分鐘，因此可以為醫(yī)生診斷節(jié)約時間。同時實施例1的檢測試劑盒的硝酸纖維素前端熒光物質(zhì)殘留較少，而對照組的檢測試劑盒殘留較多。

表1本發(fā)明的熒光層析試劑檢測出的肌鈣蛋白含量

備注：變異系數(shù)＝均值/標(biāo)準偏差*100％

實施例2雙t線單指標(biāo)肌鈣蛋白熒光層析試劑檢測系統(tǒng)

材料與方法同實施例1，不同之處在于：繼續(xù)使用biodot的xyz3060處理平臺，在位置22b處繼續(xù)進一步噴涂5mg/ml的4t21的肌鈣蛋白抗體。

檢測過程：將60μl心臟病人的血清樣本滴到位置12，等待6分鐘。樣本中的肌鈣蛋白在位置14與步聚1制備的熒光抗體進行反應(yīng)，形成肌鈣蛋白抗原+抗體+熒光球的三聚體和不參加反應(yīng)的熒光球+單鏈dna。反應(yīng)完成后，液體層析到22a位置，三聚體被處理在這里的抗體捕獲。其余的液體繼續(xù)向前，流到位置22b的時候，位置22a沒有捕獲的三聚體在這里繼續(xù)被捕獲，其余的液體繼續(xù)向前，流到位置24的時候，熒光球+單鏈dna上的dna被互補dna捕獲。之后通過儀器在波長610nm下測量位置22a和22b與24的熒光強度，然后將位置22a和22b的信號之和，再與位置24的信號之比作為結(jié)果，輸出給上位機。同時該樣本采用實施例1的檢測系統(tǒng)進行檢測。

結(jié)果顯示：采用實施例1的檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果為70μg/l，實施例2的檢測值為73μg/l，但系統(tǒng)提示用戶進行釋放后再檢測，檢測值為110μg/l。其實原理在于，樣本中含有大量的抗原，這些抗原無法全部與第一檢測試劑反應(yīng)，而多余的抗原，直接與第一條t線結(jié)合，這樣前述的三聚體就無法再與第一條t線結(jié)合，而導(dǎo)致第二條t線信號超過第一條t線信號。當(dāng)僅有一條t線時，則無法結(jié)合的三聚體就會流入下游，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。

實施例3雙指標(biāo)腦鈉肽(bnp)和肌鈣蛋白熒光層析試劑檢測系統(tǒng)

材料：羧基熒光膠球，直徑300nm，貨號fc02f，購自bangslaboratories,inc.

20bp的氨基化單鏈dnaa-a-a-a-a-a-a-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-精氨酸和20bp單鏈dnat-t-t-t-t-t-t-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

兩株肌鈣蛋白抗體4c2cc和m155cc，貨號4t21cc，購自hytest。

bnp單克隆抗體24c5抗體和26e2抗體，貨號4bnp2，購自hytest。

方法：按照bangslaboratories,inc.技術(shù)指導(dǎo)technote205文件中的相關(guān)說明，將4c2cc抗體接到1mlfc02f上，編號latex1c備用。

按照bangslaboratories,inc.技術(shù)指導(dǎo)technote205文件中的相關(guān)說明，將24c5抗體接到1mlfc02f上，編號latex2c備用。

將latex1c和latex2c等比混合，然后用100mmol/ltris緩沖液稀釋5倍，編號為latex3c備用。

按照bangslaboratories,inc技術(shù)指導(dǎo)technote302文件中的相關(guān)說明，將1mg氨基化單鏈dnaa-a-a-a-a-a-a-a-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-g-精氨酸接到0.25mlfc02f上，然后用100mmol/ltris緩沖液稀釋2倍，編號latex4c備用。

將latex3c和latex4c按照體積比為10:1進行混合，然后使用biodot的xyz3060處理平臺，將混合物噴到位置14。

使用biodot的xyz3060處理平臺，將10mg/ml的m155cc肌鈣蛋白抗體噴到位置22a處。

使用biodot的xyz3060處理平臺，將10mg/ml的26e2bnp抗體噴到位置22b處。

使用biodot的xyz3060處理平臺，將2mg/ml的4t21的單鏈dnat-t-t-t-t-t-t-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c-c噴到位置24處。

檢測過程：將60μl心臟病人血清樣本滴到位置12等待6分鐘。樣本中的肌鈣蛋白在位置14與步聚1制備的熒光抗體進行反應(yīng)，形成肌鈣蛋白抗原+抗體+熒光球的三聚體；樣本中的bnp在位置14與步聚2制備的熒光抗體進行反應(yīng)，形成bnp抗原+抗體+熒光球的三聚體；液體中除了有上述兩個三聚體外，還包括不參加反應(yīng)的熒光球+單鏈dna。反應(yīng)完成后，液體層析到22a位置，肌鈣蛋白三聚體被處理在這里的抗體捕獲。其余的液體繼續(xù)向前，液體層析到22b位置，bnp三聚體被處理在這里的抗體捕獲，而剩余的熒光球+單鏈dna在位置24，被其互補dna捕獲。之后在610nm波長下測量位置22的熒光強度為0.12、24的熒光強度為13.98，然后將位置22a與位置24信號之比作為肌鈣蛋白結(jié)果為0.28微克/升，將位置22b與位置24信號之比作為bnp結(jié)果輸出給上位機，上位機根據(jù)樣本中的肌鈣蛋白含量與結(jié)果的對應(yīng)關(guān)系，便可以根據(jù)檢測結(jié)果反算出樣本中的肌鈣蛋白含量，再根據(jù)樣本中的bnp含量與結(jié)果的對應(yīng)關(guān)系，便可以根據(jù)檢測結(jié)果反算出樣本中的bnp含量，為415.3微克/升。同一樣本，重復(fù)檢測9次，計算得到檢測肌鈣蛋白i的精密度為5.9％，檢測bnp的精密度為7.5％。

實施例4單t線單指標(biāo)肌鈣蛋白熒光層析試劑檢測系統(tǒng)

在進行實施例1的檢測過程，當(dāng)發(fā)明人拆開檢測試劑盒外殼發(fā)現(xiàn)實施例1的檢測試劑盒的硝酸纖維素前端熒光物質(zhì)殘留較少，而對照組的檢測試劑盒殘留較多。設(shè)計如下實驗：

材料：羧基熒光膠球，直徑300nm，貨號fc02f，購自bangslaboratories,inc.。

肌鈣蛋白抗體，貨號分別4t21cc和4t21，購自hytest。

方法：

1、按照bangslaboratories,inc.技術(shù)指導(dǎo)technote205文件中的相關(guān)說明，將10mg4t21cc抗體接到1mlfc02f上，然后用100mmol/ltris緩沖液稀釋10倍，編號latex1d備用。

2、將10mllatex1d和0.5ml100mmol/ltris緩沖液混合，然后使用biodot的xyz3060處理平臺，將混合物噴到玻璃纖維上，圖1中的位置14。

3、使用biodot的xyz3060處理平臺，將10mg/ml的4t21的肌鈣蛋白抗體噴到圖1的位置22a處，該處為硝酸纖維素材質(zhì)。位置22b不做噴涂。得到對照熒光層析試劑。

檢測過程：將60μl心臟病患者血清樣本4份分別滴到2個上述對照熒光層析試劑上(對照試劑1a和對照試劑1b)和2個實施例1制備的熒光層析試劑上(實驗試劑2a和2b)的位置12，等待6分鐘。然后在紫外燈下觀察這4個試劑硝酸纖維素前端殘留的大小，發(fā)現(xiàn)本次制備的試劑殘留較多。結(jié)果如下：

備注：“+”表示殘留強度，“+”越多，表示殘留越多。