專利名稱：：一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)定量檢測(cè)afp的免疫層析試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是涉及一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙，具體說，是涉及一種以上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料作為生物標(biāo)記物的雙抗夾心式免疫層析試紙，以用于定量檢測(cè)血清中甲胎蛋白(a-fetoprotein，AFP)濃度。
背景技術(shù)：
：上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(Up-ConvertingPhosphor,UCP)是一種可對(duì)能量進(jìn)行上轉(zhuǎn)的稀土金屬合成物，即UCP可吸收低能量的(長(zhǎng)波長(zhǎng))紅外光，但卻發(fā)射高能量的(短波長(zhǎng))可見光。UCP是由幾種稀土金屬元素?fù)诫s于某些晶體的晶格中構(gòu)成的。在這種材料中有三種主要的成分主基質(zhì)、吸收子和發(fā)射子。作為主基質(zhì)的晶體材料有氧硫化物(如Y202S、Gd02S、1^2028等)、氟化物(如YF3、GdF3、LaF3等)、鎵酸鹽(如YGa03、Y3Ga50!2等)以及硅酸鹽(如YSi205、YSi307等)等；常用作吸收子的稀土金屬離子有鐿離子(Yb")、鉺離子(Er3、釤離子(Sm3,等；常用作發(fā)射子的稀土金屬離子有鉺離子(Er3,、鈥離子(Ho、銩離子(Tm3+)、鋱離子(Tb")等。吸收子和發(fā)射子這一離子對(duì)在主基質(zhì)晶格內(nèi)適宜的空間取向和距離，是產(chǎn)生上轉(zhuǎn)換發(fā)光的基礎(chǔ)。研究表明，將上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，可為傳統(tǒng)的免疫層析技術(shù)帶來以下突破性的變革1、UCP發(fā)光標(biāo)記物的特點(diǎn)，使得以其作為標(biāo)記物的免疫層析試紙可與儀器結(jié)合，對(duì)目標(biāo)被檢物進(jìn)行靈敏度極高的精確定量檢測(cè)；2、UCP所具有的多種特征光譜(激發(fā)光譜與發(fā)射光譜)，使得基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙可進(jìn)行靈敏度極高的多重分析，即一次性的對(duì)生物樣品中的多種目標(biāo)被檢物進(jìn)行檢測(cè)；3、UCP獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象，使得以其作為標(biāo)記物的檢測(cè)過程排除了由于待檢測(cè)生物樣品自發(fā)熒光造成干擾的可能，提高信噪比，從而提高了檢測(cè)的靈敏度與穩(wěn)定性；44、通過共價(jià)方式交聯(lián)生物活性分子，在保證檢測(cè)靈敏度的前提下提高了系統(tǒng)的可靠性與穩(wěn)定性。原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，近年來國(guó)內(nèi)外原發(fā)性肝癌的發(fā)病率有不斷升高的趨勢(shì)，且其起病隱匿性強(qiáng)，早期癥狀不明顯，一旦出現(xiàn)臨床癥狀多屬晚期。因此迫切需要一種快速準(zhǔn)確診斷原發(fā)性肝癌的檢測(cè)方法。甲胎蛋白(AFP)是一種分子量為70kDa的胚胎性糖蛋白，胚胎時(shí)期可能起著與蛋白相似的作用，常人血清中甲胎蛋白濃度很小，但原發(fā)性肝癌患者大約90%患者的血清中AFP濃度較高，而且其濃度與疾病的變化密切相關(guān)。因此，血清AFP中濃度測(cè)定成為原發(fā)性肝癌診斷的重要指標(biāo)。目前，血清中AFP濃度測(cè)定為免疫層析技術(shù)，其中所使用的標(biāo)記物通常為酶、膠體金以及著色膠珠標(biāo)記物，這幾種標(biāo)記物應(yīng)用于免疫層析技術(shù)中有兩個(gè)共同點(diǎn)物理吸附交聯(lián)法與通過顏色判斷結(jié)果。其中物理吸附法(即通過疏水性以及靜電吸附制備標(biāo)記物)的脆弱性使得基于該種標(biāo)記物的免疫層析對(duì)于反應(yīng)的條件要求極為苛刻，從而一些有效的非特異去除試劑，如吐溫20(Tween20)、吹通100(Triton100)、十二烷基磺酸鈉(SDS)等，由于對(duì)疏水性以及靜電性的影響改變而只能在低濃度使用，由此便造成了基于該種標(biāo)記物的免疫層析試紙假陽性率、假陰性率較高的必然結(jié)果；另外通過顏色判斷結(jié)果在使用操作簡(jiǎn)便的同時(shí)必然受觀察者主觀影響大、靈敏度低，且只能停留在定性水平，而絕對(duì)無法實(shí)現(xiàn)精確定量。由于基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析技術(shù)，其獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光特性，使檢測(cè)無本底干擾，就定性分析而言，靈敏度可達(dá)膠體金的IOO倍；同時(shí)其發(fā)光性能穩(wěn)定，不易淬滅，可用于多重、定量分析。因此，研制基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙，以用于定量檢測(cè)血清中甲胎蛋白(AFP)濃度，對(duì)原發(fā)性肝癌的早期診斷具有重要意義，但至今未見相關(guān)技術(shù)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷和不足，旨在提供一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙，以用于定量檢測(cè)血清中甲胎蛋白(AFP)濃度。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)定量檢測(cè)AFP的免疫層析試紙，是以上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料作為生物標(biāo)記物的雙抗夾心式免疫層析試紙，其特征在于作為生物標(biāo)記物的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料是表面經(jīng)過氨基化修飾的，以NaYF4為基質(zhì)、Yb"為敏化劑、Yb和Er共摻雜的NaYF4:Yb:Er納米顆粒，所標(biāo)記的生物活性分子為AFP抗體。所述NaYF4:Yb:Er納米顆粒的直徑優(yōu)選100~400nm。本發(fā)明所述的基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)定量檢測(cè)AFP的免疫層析試紙的制備方法，包括UCP-生物活性分子結(jié)合物的制備、樣品墊的制備、結(jié)合墊的制備、分析膜的制備、免疫層析試紙條的組裝共5個(gè)步驟，各步驟的具體操作如下a)UCP-生物活性分子結(jié)合物的制備將表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒加入到pH-7.2的0.03mol/L的嫌酸鹽緩沖液(PB)中，配制成濃度為1~2mg/ml的懸濁液；向其中加入25%的戊二醛，于153(TC下反應(yīng)24小時(shí)，戊二醛與表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為(100~500):1;離心洗去多余的戊二醛，然后分散在0.03mol/L的PB中，配制成濃度為1~2mg/ml的懸濁液；再向其中加入AFP抗體，于35'C反應(yīng)24小時(shí)，AFP抗體與表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為l:(200-1000);在3~5'C離心洗滌數(shù)次，即得UCP-生物活性分子結(jié)合物，保存于0.03mol/L的PB(含0.1。/oBSA,0.1%Tween20)中；b)樣品墊的制備選用纖維素膜作為樣品墊材料，剪成1.5x30.0cm規(guī)格的條帶，將其放入樣品墊封閉液(pH-7.2的0.03mol/LPB,含有5mg/mBSA,0.1%TritonX-100)中浸泡30min，然后于37-C烘干備用；c)結(jié)合墊的制備選用玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊材料，將其剪成1.0x30.0cm規(guī)格的條帶；離心步驟a)制備的UCP-生物活性分子結(jié)合物中的保存液，然后向沉降物中加入pH-7.2的0.03mol/LPB(含l。/。蔗糖及l(fā)。/c)BSA),充分混勾后加入該條帶上，于37'C烘干備用；d)分析膜的制備將硝酸纖維膜(NC膜)剪切成2.5x30.0cm規(guī)格的條帶，用點(diǎn)樣儀在NC膜上不同位置分別噴點(diǎn)AFP單抗和羊抗鼠IgG抗體，作為檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，于37'C烘干備用；e)免疫層析試紙條的組裝將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊、樣品墊依次貼在帶有粘合劑的底板上，并切成4cm寬的試紙條即可。對(duì)所述NaYF4:Yb:Er納米顆粒表面進(jìn)行氨基化修飾的操作過程如下①進(jìn)行表面硅化將NaYF4:Yb:Er納米顆粒加入到含水10。/。~50%的乙醇溶劑中，配制成濃度為0.015mg/ml的懸濁液，在15~50。C水洛中攪拌均勻；向其中加入正硅酸乙酯(TEOS)，正硅酸乙酯與NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為(10~2):1,繼續(xù)反應(yīng)515小時(shí)，結(jié)東反應(yīng)，離心洗滌備用；②進(jìn)行表面氨基化將上述表面硅化的NaYF4:Yb:Er納米顆粒，加入甲醇與丙三醇按(0.2~2):l體積比組成的混合溶劑中，配制成濃度為0.015mg/ml的懸濁液，超聲分散；向其中加入N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEAPS),AEAPS與NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為(10~500):1,于15~5(TC下恒溫?cái)嚢?~IO小時(shí)，用乙醇離心洗滌，干燥即可。使用本發(fā)明所述的基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)定量檢測(cè)AFP的免疫層析試紙進(jìn)行定量檢測(cè)AFP的搡作如下1)將lmg/mL的AFP抗原標(biāo)準(zhǔn)品用正常人血清作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品Ong/ml，2ng/ml，5ng/ml,10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml，400ng/ml，600ng/ml,800ng/ml，lOOOng/ml,1200ng/ml，1500ng/m,1800ng/ml，2000ng/ml;2)將所制備的試紙條的樣品墊端分別插入上述濃度系列標(biāo)準(zhǔn)品中，15min后取出，通過熒光測(cè)量?jī)x檢測(cè)T線和C線區(qū)域的熒光強(qiáng)度的比值(每個(gè)樣品分別用3個(gè)試紙條檢測(cè)3次，取平均值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；3)利用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)臨床血清樣品，通過判讀T/C值，即可計(jì)算得臨床血清樣品中AFP的濃度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析技術(shù)在定量檢測(cè)血清中甲胎蛋白(AFP)濃度中的應(yīng)用，使AFP的檢測(cè)無本底干擾，定量檢測(cè)限可達(dá)2ng/ml，線性范圍寬(從2ng/ml~2000ng/ml)，且線性較好(R2=0.9978)，可多重分析；相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)定量檢測(cè)限一般為10ng/ml，線性范圍只有10~300ng/ml，R2=0.9631而言，本發(fā)明的免疫層析試紙具有定量檢測(cè)靈敏度高的突出有益效果，對(duì)原發(fā)性肝癌的早期診斷具有重要意義。圖1為用本發(fā)明所述的免疫層析試紙定量檢測(cè)AFP抗原標(biāo)準(zhǔn)品所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其目的僅在于更好理解本發(fā)明的內(nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例中所用的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料一NaYF4:Yb:Er納米顆粒是按照期刊文獻(xiàn)《化工技術(shù)與開發(fā)》，第36卷第6期，2007年6月，第12頁中所公開的制備工藝制得。實(shí)施例1一、對(duì)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料一NaYF4:Yb:Er納米顆粒表面進(jìn)行氨基化修飾①進(jìn)行表面硅化將顆粒直徑為100~400nm的NaYF4:Yb:Er納米顆粒加入到含水10。/。的乙醇溶劑中，配制成濃度為0.01mg/ml的懸濁液，在5(TC水浴中攪拌均勻；向其中加入正硅酸乙酯(TEOS)，正硅酸乙酯與NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為10:1，繼續(xù)反應(yīng)5小時(shí)，結(jié)東反應(yīng)，離心洗滌備用；②進(jìn)行表面氨基化將上述表面硅化的NaYF4:Yb:Er納米顆粒，加入甲醇與丙三醇按0.2:l體積比組成的混合溶劑中，配制成濃度為0.01mg/ml的懸濁液，超聲分散；向其中加入N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEAPS),AEAPS與NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為10:1,于50。C下恒溫?cái)嚢?小時(shí)，用乙醇離心洗滌，干燥即可。二、制備免疫層析試紙a)制備UCP-生物活性分子結(jié)合物將表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒加入到pH-7.2的0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液(PB)中，配制成濃度為1.5mg/ml的懸濁液；向其中加入25%的戊二醛，于室溫下反應(yīng)3小時(shí)，戊二醛與表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為100:1;離心洗去多余的戊二醛，然后分散在0.03mol/L的PB中，配制成濃度為1.5mg/ml的懸濁液；再向其中加入AFP抗體，于4"C反應(yīng)3小時(shí)，AFP抗體與表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為l:1000;在4'C離心洗滌數(shù)次，即得UCP-生物活性分子結(jié)合物，保存于0.03mol/L的PB(含0.1。/。BSA，0.1%Tween20)中；b)樣品墊的制備選用纖維素膜作為樣品墊材料，剪成1.5x30.0cm規(guī)格的條帶，將其放入樣品墊封閉液(pH-7.2的0.03mol/LPB，含有5mg/m舊SA，0.1%TritonX-100)中浸泡30min,然后于37'C烘干備用；c)結(jié)合墊的制備選用玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊材料，將其剪成1.0x30.0cm規(guī)格的條帶；離心步驟a)制備的UCP-生物活性分子結(jié)合物中的保存液，然后向沉降物中加入pH-7.2的0.03mol/LPB(含1。/。蔗糖及1。/。BSA),充分混勻后加入該條帶上，于37'C烘干備用；d)分析膜的制備將硝酸纖維膜(NC膜)剪切成2.5x30.0cm規(guī)格的條帶，用點(diǎn)樣儀在NC膜上不同位置分別噴點(diǎn)AFP單抗和羊抗鼠IgG抗體，作為檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，于37。C烘干備用；e)免疫層析試紙條的組裝將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊、樣品墊依次貼在帶有粘合劑的底板上，并切成4cm寬的試紙條，即得以上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料一表面經(jīng)過氨基化修飾的，以NaYF4為基質(zhì)、Y^+為敏化劑、Yb和Er共摻雜的NaYF4:Yb:Er納米顆粒作為AFP抗體標(biāo)記物的雙抗夾心式免疫層析試紙。實(shí)施例2一、對(duì)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料一NaYF4:Yb:Er納米顆粒表面進(jìn)行氨基化修飾①進(jìn)行表面硅化將顆粒直徑為100~400nm的NaYF4:Yb:Er納米顆粒加入到含水50。/。的乙醇溶劑中，配制成濃度為5mg/ml的懸濁液，在15'C水洛中攪拌均勻；向其中加入9正硅酸乙酯(TEOS),正硅酸乙酯與NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為2:1，繼續(xù)反應(yīng)15小時(shí)，結(jié)東反應(yīng)，離心洗滌備用；②進(jìn)行表面氨基化將上述表面硅化的NaYF4:Yb:Er納米顆粒，加入甲醇與丙三醇按2:l體積比組成的混合溶劑中，配制成濃度為5mg/ml的懸濁液，超聲分散；向其中加入N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEAPS)，AEAPS與NaYKt:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為500:1,于15。C下恒溫?cái)嚢?5小時(shí)，用乙醇離心洗滌，千燥即可。二、制備免疫層析試紙a)制備UCP-生物活性分子結(jié)合物將表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒加入到pI^7.2的0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液(PB)中，配制成濃度為1.5mg/ml的懸濁液；向其中加入25%的戊二醛，于室溫下反應(yīng)3小時(shí)，戊二醛與表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為500:1;離心洗去多余的戊二醛，然后分散在0.03mol/L的PB中，配制成濃度為1.5mg/ml的懸濁液；再向其中加入AFP抗體，于4"C反應(yīng)3小時(shí)，AFP抗體與表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為l:200;在4。C離心洗滌數(shù)次，即得UCP-生物活性分子結(jié)合物，保存于0.03mol/L的PB(含0.P/。BSA,0.1%Tween20)中；b)樣品墊的制備選用纖維素膜作為樣品墊材料，剪成1.5x30.0cm規(guī)格的條帶，將其放入樣品墊封閉液(pH:7.2的0.03mol/LPB,含有5mg/mlBSA，0.1%TritonX-100)中浸泡30min，然后于37"C烘干備用；c)結(jié)合墊的制備選用玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊材料，將其剪成1.0x30.0cm規(guī)格的&帶；離心步驟a)制備的UCP-生物活性分子結(jié)合物中的保存液，然后向沉降物中加入pH二7.2的0.03mol/LPB(含P/。蔗糖及1。/()BSA),充分混勻后加入該條帶上，于37'C烘干備用；d)分析膜的制備將硝酸纖維膜(NC膜)剪切成2.5x30.0cm規(guī)格的條帶，用點(diǎn)樣儀在NC膜上不同位置分別噴點(diǎn)AFP單抗和羊抗鼠IgG抗體，作為檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，于37"C烘干備用；e)免疫層析試紙條的組裝將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊、樣品墊依次貼在帶有粘合劑的底板上，并切成4cm寬的試紙條，即得以上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料一表面經(jīng)過氨基化修飾的，以NaYF4為基質(zhì)、Yb"為敏化劑、Yb和Er共摻雜的NaYF4:Yb:Er納米顆粒作為AFP抗體標(biāo)記物的雙抗夾心式免疫層析試紙。實(shí)施例3一、對(duì)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料一NaYF4:Yb:Er納米顆粒表面進(jìn)行氨基化修飾①進(jìn)行表面硅化將顆粒直徑為100~400nm的NaYF4:Yb:Er納米顆粒加入到含水30。/。的乙醇溶劑中，配制成濃度為lmg/ml的懸濁液，在25。C水洛中攪拌均勻；向其中加入正硅酸乙酯(TEOS),正硅酸乙酯與NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為6:1,繼續(xù)反應(yīng)10小時(shí)，結(jié)東反應(yīng)，離心洗滌備用；②進(jìn)行表面氨基化將上述表面硅化的NaYF4:Yb:Er納米顆粒，加入甲醇與丙三醇按l:l體積比組成的混合溶劑中，配制成濃度為lmg/ml的懸濁液，超聲分散；向其中加入N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEAPS),AEAPS與NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為250:1,于25t:下恒溫?cái)嚢?0小時(shí)，用乙醇離心洗滌，干燥即可。二、制備免疫層析試紙a)制備UCP-生物活性分子結(jié)合物將表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒加入到pl^7.2的0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液(PB)中，配制成濃度為1.5mg/ml的懸濁液；向其中加入25%的戊二醛，于室溫下反應(yīng)3小時(shí)，戊二醛與表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為300:1;離心洗去多余的戊二醛，然后分散在0.03mol/L的PB中，配制成濃度為1.5mg/ml的懸濁液；再向其中加入AFP抗體，于4'C反應(yīng)3小時(shí)，AFP抗體與表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為l:600;在4。C離心洗滌數(shù)次，即得UCP-生物活性分子結(jié)合物，保存于0.03mol/L的PB(含0.P/oBSA,0.1%Tween20)中；b)樣品墊的制備選用纖維素膜作為樣品墊材料，剪成1.5x30.0cm規(guī)格的條帶，將其放入樣品墊封閉液(pH:7.2的0.03mol/LPB，含有5mg/mffiSA,0.1%TritonX-100)中浸泡30min,然后于37。C烘干備用；c)結(jié)合墊的制備選用玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊材料，將其剪成1.0x30.0cm規(guī)格的條帶；離心步驟a)制備的UCP-生物活性分子結(jié)合物中的保存液，然后向沉降物中加入pH-7.2的0.03mol/LPB(含1。/。蔗糖及1。/。BSA)，充分混勾后加入該條帶上，于37'C烘干備用；d)分析膜的制備將硝酸纖維膜(NC膜)剪切成2.5x30.0cm規(guī)格的條帶，用點(diǎn)樣儀在NC膜上不同位置分別噴點(diǎn)AFP單抗和羊抗鼠IgG抗體，作為檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，于37卩烘干備用；e)免疫層析試紙條的組裝將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊、樣品墊依次貼在帶有粘合劑的底板上，并切成4cm寬的試紙條，即得以上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料一表面經(jīng)過氨基化修飾的，以NaYF4為基質(zhì)、Yb"為敏化劑、Yb和Er共摻雜的NaYF4:Yb:Er納米顆粒作為AFP抗體標(biāo)記物的雙抗夾心式免疫層析試紙。實(shí)施例4使用上述所制備的免疫層析試紙進(jìn)行定量檢測(cè)AFP抗原1)將lmg/mL的AFP抗原標(biāo)準(zhǔn)品用正常人血清作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品Ong/ml，2ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml,400ng/ml,600ng/ml，800ng/ml，lOOOng/ml,1200ng/ml，1500ng/m,1800ng/ml，2000ng/ml;2)將上述所制備的試紙條的樣品墊端分別插入上述濃度系列標(biāo)準(zhǔn)品中，15min后取出，通過熒光測(cè)量?jī)x檢測(cè)T線和C線區(qū)域的熒光強(qiáng)度的比值(每個(gè)樣品分別用上述3個(gè)實(shí)施例所制備的3個(gè)試紙條檢測(cè)3次，取平均值)，每個(gè)濃度標(biāo)樣的T/C檢測(cè)數(shù)據(jù)見表1所示，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖l所示；3)檢測(cè)臨床血清樣品，通過判讀T/C值，利用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算得該臨床血清樣品中AFP的濃度。表l每個(gè)濃度標(biāo)樣的T/C檢測(cè)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖1所示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y=0.0041X+0.4574，擬合系數(shù)的平方為R2=0.9978。由此可見本發(fā)明的免疫層析試紙的定量檢測(cè)限可達(dá)2ng/ml,線性范圍寬(從2ng/ml~2000ng/ml),且線性較好(R2=0.9978),相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)定量檢測(cè)限一般為10ng/ml，線性范圍只有10~300ng/ml,R2=0.9631而言，本發(fā)明具有定量檢測(cè)靈敏度高的突出有益效果，對(duì)原發(fā)性肝癌的早期診斷具有重要意義。權(quán)利要求1.一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)定量檢測(cè)AFP的免疫層析試紙，是以上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料作為生物標(biāo)記物的雙抗夾心式免疫層析試紙，其特征在于作為生物標(biāo)記物的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料是表面經(jīng)過氨基化修飾的，以NaYF4為基質(zhì)、Yb3+為敏化劑、Yb和Er共摻雜的NaYF4:Yb:Er納米顆粒，所標(biāo)記的生物活性分子為AFP抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)定量檢測(cè)AFP的免疫層析試紙，其特征在于所述NaYF4:Yb:Er納米顆粒的直徑為100400nrn。3.—種權(quán)利要求1所述的基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)定量檢測(cè)AFP的免疫層析試紙的制備方法，包括UCP-生物活性分子結(jié)合物的制備、樣品墊的制備、結(jié)合墊的制備、分析膜的制備、免疫層析試紙條的組裝共5個(gè)步驟，其特征在于，各步驟的具體操作如下a)UCP-生物活性分子結(jié)合物的制備將表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒加入到pH:7.2的0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液(PB)中，配制成濃度為1~2mg/ml的懸濁液；向其中加入25%的戊二醛，于153(TC下反應(yīng)24小時(shí)，戊二醛與表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為(100~500):1;離心洗去多余的戊二醛，然后分散在0.03mol/L的PB中，配制成濃度為1~2mg/ml的懸濁液；再向其中加入AFP抗體，于35'C反應(yīng)24小時(shí)，AFP抗體與表面經(jīng)過氨基化修飾的NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為l:(200-1000);在3~5。C離心洗滌數(shù)次，即得UCP-生物活性分子結(jié)合物，保存于0.03mol/L的PB(含0.1。/。BSA，0.1%Tween20)中；b)樣品墊的制備選用纖維素膜作為樣品墊材料，剪成1.5x30.0cm規(guī)格的條帶，將其放入樣品墊封閉液(pH-7.2的0.03mol/LPB,含有5mg/mlBSA，0.1%TritonX-100)中浸泡30min,然后于37"C烘干備用；c)結(jié)合墊的制備選用玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊材料，將其剪成1.0x30.0cm規(guī)格的條帶；離心步驟a)制備的UCP-生物活性分子結(jié)合物中的保存液，然后向沉降物中加入pH二7.2的0.03mol/LPB(含1。/。蔗糖及1。/。BSA)，充分混句后加入該條帶上，于37'C烘干備用；d)分析膜的制備將硝酸纖維膜(NC膜)剪切成2.5x30.0cm規(guī)格的條帶，用點(diǎn)樣儀在NC膜上不同位置分別噴點(diǎn)AFP單抗和羊抗鼠IgG抗體，作為檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，于37。C烘干備用；e)免疫層析試紙條的組裝將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊、樣品墊依次貼在帶有粘合劑的底板上，并切成4cm寬的試紙條即可。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)定量檢測(cè)AFP的免疫層析試紙的制備方法，其特征在于，對(duì)所述NaYF4:Yb:Er納米顆粒表面進(jìn)行氨基化修飾的操作過程如下①進(jìn)行表面硅化'將NaYF4:Yb:Er納米顆粒加入到含水10。/。~50%的乙醇溶劑中，配制成濃度為0.015mg/ml的懸濁液，在15~50。C水洛中攪拌均句；向其中加入正硅酸乙酯(TEOS)，正硅酸乙酯與NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為(10~2):1，繼續(xù)反應(yīng)5~15小時(shí)，結(jié)東反應(yīng)，離心洗滌備用；②進(jìn)行表面氨基化將上述表面硅化的NaYF4:Yb:Er納米顆粒，加入甲醇與丙三醇按(0.2~2):l體積比組成的混合溶劑中，配制成濃度為0.015mg/ml的懸濁液，超聲分散；向其中加入N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AEAPS)，AEAPS與NaYF4:Yb:Er納米顆粒的質(zhì)量比為(10~500):1，于15~5CTC下恒溫?cái)嚢?~IO小時(shí)，用乙醇離心洗滌，干燥即可。全文摘要本發(fā)明公開了一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)定量檢測(cè)AFP的免疫層析試紙，該試紙是以表面經(jīng)過氨基化修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料-NaYF₄:Yb:Er納米顆粒作為AFP抗體標(biāo)記物的雙抗夾心式免疫層析試紙。所述試紙的制備包括UCP-生物活性分子結(jié)合物的制備、樣品墊的制備、結(jié)合墊的制備、分析膜的制備及免疫層析試紙條的組裝共5個(gè)步驟。本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析技術(shù)在定量檢測(cè)AFP濃度中的應(yīng)用，使AFP的檢測(cè)無本底干擾，定量檢測(cè)限可達(dá)2ng/ml，線性范圍寬，且線性較好，可多重分析，具有定量檢測(cè)靈敏度高的突出有益效果，對(duì)原發(fā)性肝癌的早期診斷具有重要意義。文檔編號(hào)G01N21/64GK101551388SQ20091005181公開日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年5月22日優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日發(fā)明者蕾周,楊瑞馥,沈鶴柏,趙露晶申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)