亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

甲狀腺素化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定試劑盒及制備方法

文檔序號(hào):6117385閱讀:254來(lái)源:國(guó)知局

專利名稱::甲狀腺素化學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明屬于免疫診斷
技術(shù)領(lǐng)域
,具體涉及一種甲狀腺素(T4)定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)及制備方法以及應(yīng)用它來(lái)測(cè)定甲狀腺素的方法。
背景技術(shù)
:甲狀腺素又稱四碘甲腺原氨酸(T4)是由甲狀腺主動(dòng)捕獲無(wú)機(jī)碘經(jīng)有機(jī)化后與酪氨酸結(jié)合而成的,分子量為777,循環(huán)血中T,/2為67天。在外周血中99.96%與結(jié)合蛋白結(jié)合。T4在外周組織中經(jīng)5-脫碘酶和5'-脫碘酶作用分別形成反T3和T3。甲狀腺素對(duì)身體機(jī)能有重要的作用,故測(cè)定甲狀腺素能夠反映甲狀腺功能是否正常。增高多見(jiàn)于甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥,降低多見(jiàn)于甲狀腺機(jī)能減退癥。甲狀腺素(T4)含量過(guò)高(甲亢)或過(guò)低(甲減)是一種較常見(jiàn)的疾病,長(zhǎng)期以來(lái),臨床醫(yī)生是根據(jù)酶免疫分析或放射免疫分析檢測(cè)結(jié)果來(lái)判斷甲亢或甲減患者的病情。但是這兩種方法分別有其缺點(diǎn),如放射免疫分析操作復(fù)雜,時(shí)間長(zhǎng),有放射性污染問(wèn)題,而酶免疫分析靈敏度低,檢測(cè)范圍窄等?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析在酶免疫分析基礎(chǔ)上結(jié)合了化學(xué)發(fā)光技術(shù)使得檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)范圍得到大幅度提高?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)于1977年問(wèn)世,1985年第一代化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒研制成功并投放市場(chǎng)。進(jìn)入九十年代,化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的研制和自動(dòng)化測(cè)量?jī)x的生產(chǎn)取得了突破性進(jìn)展,從而進(jìn)入高速發(fā)展階段。化學(xué)發(fā)光免疫分析是繼熒光、放射性同位素和酶免疫分析之后發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫分析技術(shù),根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及臨床應(yīng)用資料,從實(shí)用性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性及發(fā)展前景來(lái)看,在非放射性標(biāo)記分析技術(shù)中化學(xué)發(fā)光免疫分析處于領(lǐng)先地位,代表了當(dāng)今世界發(fā)展的方向和潮流,它不僅具有免疫反應(yīng)的特異性,而且具有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏性(檢測(cè)限度可達(dá)10—'5~10—18mol/L)?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、效期長(zhǎng)并安全無(wú)毒無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn),成為取代放射免疫分析和酶免疫分析技術(shù)的首選。化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物一acridini咖ester(AE),是有效的發(fā)光標(biāo)記物,其通過(guò)起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH-ft02)作用而發(fā)光,強(qiáng)烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成,為快速的閃爍發(fā)光。還有以三聯(lián)吡啶釕(Ru(byp)')標(biāo)記物為發(fā)光底物,用另一反應(yīng)物三丙胺(TPA)來(lái)激發(fā)光反應(yīng),在電極表面反復(fù)進(jìn)行氧化還原反應(yīng)從而產(chǎn)生高效穩(wěn)定連續(xù)發(fā)光的電化學(xué)發(fā)光免疫分析。這些免疫分析方法都需要高精度復(fù)雜的自動(dòng)測(cè)量?jī)x器,目前在國(guó)內(nèi)還難以實(shí)現(xiàn)?;瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析是以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)(如酶標(biāo)記的抗原或抗體)進(jìn)行免疫反應(yīng),免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物,在信號(hào)試劑作用下發(fā)光,用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶(冊(cè)P)和堿性磷酸酶(ALP),它們有各自的發(fā)光底物。HRP常用的底物為魯米諾(3-氨基鄰苯二甲酰肼,luminol)或其衍生物如異魯米諾(4-氨基鄰苯二甲酰肼)等,魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行,在過(guò)氧化物酶及活性氧的存在下,生成激發(fā)態(tài)中間體,當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)發(fā)光,其波長(zhǎng)為425nm。發(fā)光強(qiáng)度依賴于酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度。如果不使用增強(qiáng)劑,魯米諾體系的發(fā)光基本上為閃光型且信號(hào)弱,通過(guò)加入某些特殊的增強(qiáng)劑可增強(qiáng)發(fā)光的信號(hào)并可大大延長(zhǎng)發(fā)光的持續(xù)時(shí)間。堿性磷酸酶體系相對(duì)于辣根過(guò)氧化酶具有穩(wěn)定,發(fā)光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn),因此,國(guó)外生產(chǎn)的自動(dòng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析儀及與之相匹配的試劑盒多數(shù)采用了這種發(fā)光系統(tǒng)。但是,國(guó)外的這些自動(dòng)化學(xué)光酶免疫分析儀及與之相匹配的試劑盒多采用封閉體系配合使用,價(jià)格昂貴,操作復(fù)雜,在國(guó)內(nèi)不易推廣。為了克服上述不足,本發(fā)明提供一種采用辣根過(guò)氧化酶(HPR)標(biāo)記抗原的開放式操作化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng),它簡(jiǎn)便快速,適用性廣,試劑成本低并不需要昂貴的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x,因此,在我國(guó)具有廣闊的應(yīng)用前景。由于采用了獨(dú)創(chuàng)的化學(xué)發(fā)光底物液和標(biāo)記方法,因此,其穩(wěn)定性和各項(xiàng)指標(biāo)都大幅提高,從實(shí)際測(cè)試看,其性能與進(jìn)口試劑盒相似。本發(fā)明提供了一種甲狀腺素(T4)酶促化學(xué)發(fā)光法定量測(cè)定試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括T4標(biāo)準(zhǔn)品、抗體預(yù)包被反應(yīng)板、酶標(biāo)記物、稀釋液、20倍濃縮洗滌液、化學(xué)發(fā)光底物液。酶標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶(HPR)標(biāo)記T4抗原。本發(fā)明提供了一種辣根過(guò)氧化物酶(服P)標(biāo)記T4的標(biāo)記方法(生物素一親和素放大系統(tǒng)),其包括1.生物素化T4(1)T4與BSA的連接取羧基已經(jīng)被甲酯化的T4lmg溶于0.2mLDMF中成5mg/mL的溶液,加入lmL濃度為0.5mg/mL的BSA(溶于0.05MpH6.8的PB中),混勻后加入200nL的戊二醛,混勻室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜。次日取出裝入透析袋并對(duì)0.05MpH9.4的CB液透析24小時(shí),中間換液3次,然后取出轉(zhuǎn)入玻璃瓶中。(2)生物素化T4取N羥基琥珀酰亞胺酯化的生物素溶于0.2mLDMF中,攪拌下逐滴加入到上(1)的透析液中,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)后裝入透析袋對(duì)0.02MPH7.4PB液透析過(guò)夜。2.HRP標(biāo)記親和素取服P溶于蒸餾水中,加入新鮮配制的過(guò)碘酸鈉,混勻后4'C放置30分鐘,然后加入160mM乙二醇,室溫放置30分鐘。將5mg/niL的親和素蒸餾水溶液加入到上述溶液中,混勻后裝入透析袋對(duì)0.05MpH9.5的CB液中4'C攪拌透析過(guò)夜。3.生物素一親和素系統(tǒng)放大的T4-冊(cè)P標(biāo)記物將1.生物素化T4的產(chǎn)物和2.HRP標(biāo)記親和素的產(chǎn)物完全混合,在37。C下攪拌反應(yīng)1小時(shí)后加入等體積的甘油,保存于-2(TC。本發(fā)明提供了一種辣根過(guò)氧化物酶(冊(cè)P)的化學(xué)發(fā)光底物液,其通過(guò)如下方法配制A液在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH8.5的Tris-HCl緩沖液。在此緩沖液中加入Luminol、Tween20以及苯并熒蒽(結(jié)構(gòu)如下圖所示),混合均勻。B液在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸,配制成0.1MpH4.6的檸檬酸緩沖液,在此溶液中加入30%過(guò)氧化氫溶液。使用方法使用前將A液與B液按1:1比例混合后使用。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>本發(fā)明還提供一種甲狀腺素(T4)定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)的制備方法,該方法包括下列步驟(1)T4標(biāo)準(zhǔn)品制備取一定量的T4原料溶解于DMF中,然后以人去激素血清將T4原料稀釋成一系列濃度。即可作為標(biāo)準(zhǔn)品使用。(2)酶標(biāo)記物的制備采用前述的辣根過(guò)氧化物酶(服P)標(biāo)記T4的標(biāo)記方法。(3)酶標(biāo)記物稀釋液的制備以0.1MpH7.5的Tris-HC1緩沖液為稀釋液,加入0.2%BSA以及一定量的阻斷劑。(4)包被抗體成為預(yù)包被反應(yīng)板以0.06MPH4.8的擰檬酸緩沖液為稀釋液將羊抗T4多抗稀釋至一定濃度,每個(gè)微孔加100微升,4'C靜置過(guò)夜。次日用含1%BSA的PH7.4,0.02M的PB液封閉未結(jié)合位點(diǎn),37°C1小時(shí)后拍干,真空包裝。(5)分裝試劑盒其余各種組份,按試劑盒需要量分裝在小瓶中。(6)檢定試劑盒的特異性、靈敏度、精密度、穩(wěn)定性合格。(7)組裝成為成品。本發(fā)明同時(shí)提供了一種使用本發(fā)明甲狀腺素(T4)定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)的檢測(cè)方法,其步驟為(1)自4'C冰箱中取出試劑盒,室溫平衡15分鐘。(2)取出包被板條,插入板架上。(3)在反應(yīng)孔中分別加一定量的各濃度標(biāo)準(zhǔn)品和樣本,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)空白1L,然后除空白孔外各孔均加入相同體積的酶標(biāo)記物,用微量震蕩器充分振蕩混勻,37。C溫育l小時(shí)。(4)甩去反應(yīng)液,每孔加滿稀釋后的洗滌液,洗板5次,最后在干凈的吸水紙上扣干。(5)各孔均加入相同體積的化學(xué)發(fā)光底物液,用微量震蕩器充分振蕩混合均勻,室溫避光反應(yīng)。(6)在發(fā)光測(cè)量?jī)x上依序測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)。(7)以校準(zhǔn)品濃度和RLU值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以各待測(cè)樣本的RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上査出該樣本的T4濃度。對(duì)本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行了一系列的測(cè)試檢驗(yàn),具體如下一、甲狀腺素(T4)定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)的具體操作如下(1)取出已包被條孔,插入支架上。(2)反應(yīng)孔中分別加各濃度標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣本每孔25ul,再加入稀釋好的酶標(biāo)記物液100wl/孔,置37'C中反應(yīng)1小時(shí)。(3)甩去反應(yīng)孔內(nèi)的液體,然后用洗滌液洗5次,每孔中加滿洗滌液后停留30秒鐘,甩去洗滌液后在吸水紙上拍干。(4)各孔加入化學(xué)發(fā)光底物液50ix1。在暗處放置10分鐘后放入發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。(5)以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光值做Logit變換值為縱坐標(biāo),用各待測(cè)樣本的發(fā)光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上査出該樣本的T4濃度。其中Logit二ln[(B/BO)/(1-B/B0)]。二、甲狀腺素(T4)定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)的方法學(xué)鑒定用中國(guó)藥品生物制品檢定所提供的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品進(jìn)行檢定,結(jié)果見(jiàn)下表1:表l檢定實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)果說(shuō)明"甲狀腺素(T4)定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)"的特異性、精密型、靈敏度和穩(wěn)定性是良好的、合格的。三、甲狀腺素(T4)定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用去激素血清配制成濃度為0、20、40、80、160、320ng/ml共6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光值做Logit變換值為縱坐標(biāo),繪制成T4標(biāo)準(zhǔn)曲線。四、正常人T4含量的確定隨機(jī)檢測(cè)284例正常人血清樣品,它們的濃度平均值(X)=82:.43ng/ml,標(biāo)準(zhǔn)差(SD)=18.60。所以正常人血清中T4的含量范圍為X土2SD,即為45.23-119.63ng/ml。本發(fā)明甲狀腺素(T4)定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)的臨床應(yīng)用及與進(jìn)口MONOBIND試劑盒的比較使用本發(fā)明的"甲狀腺激素(T4)定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)"和進(jìn)口T4(M0N0BIND)試劑盒同時(shí)檢測(cè)血清樣本66份,以比較兩種試劑盒之間的相關(guān)性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2及表2。表2兩種試劑盒的結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>比較結(jié)果表明兩種方法非常顯著相關(guān),說(shuō)明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果較為一致。本發(fā)明的試劑盒能非常專一地定量檢測(cè)患者血清T4的含量。它具有簡(jiǎn)便、靈敏和穩(wěn)定等特點(diǎn)。且本試劑盒操作簡(jiǎn)便迅速,采用一步法可在短時(shí)間內(nèi)獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果,比放射免疫分析檢測(cè)法快速;經(jīng)臨床試用結(jié)果表明本試劑盒與進(jìn)口MONOBIND試劑盒具有很好的符合性,因而本試劑盒對(duì)甲狀腺功能亢進(jìn)(甲亢)和減退(甲減)的診斷和療效評(píng)價(jià)都具有十分重要的參考價(jià)值。使用本試劑盒的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)需貴重儀器設(shè)備,試劑便宜且收費(fèi)低廉,能適用于各級(jí)醫(yī)院及臨床測(cè)試中心,因而具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、靈敏、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。圖l本發(fā)明試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2本試劑盒與進(jìn)口T4試劑盒測(cè)定結(jié)果比較圖,其中縱坐標(biāo)Y為本試劑盒測(cè)得的血樣中T4含量;橫坐標(biāo)X為進(jìn)口M0N0BIND試劑盒測(cè)得的血樣中T4含量:兩種方法相關(guān)系數(shù)(r)=0.9668;直線方程Y=l.0167X-2.7992。具體實(shí)施例方式1.化學(xué)發(fā)光底物液的制備A液在100ml雙蒸水中加入1.21gTris和295uL濃HC1配成0.1MpH8.5的Tris-HC1緩沖液。在此緩沖液中加入0.5g的L咖inol、20uL的Tween20以及0.lg苯并熒蒽(結(jié)構(gòu)如下圖所示),混合均勻。B液在100ml雙蒸水中加入檸檬酸三鈉0.73g和檸檬酸0.44g,配制成0.1MPH4.6的檸檬酸緩沖液,在此溶液中加入IOO"L30%過(guò)氧化氫溶液,.使用方法使用前將A液與B液按l:1比例混合后使用。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>2.酶標(biāo)記物的制備2.1生物素化T4(1)T4與BSA的連接取羧基已經(jīng)被甲酯化的T4lmg溶于0.2mLDMF中成5mg/mL的溶液,加入lmL濃度為0.5mg/mL的BSA(溶于0.05Mp朋.8的PB中),混勻后加入200yL的戊二醛,混勻室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜。次日取出裝入透析袋并對(duì)0.05MpH9.4的CB液透析24小時(shí),中間換液3次,然后取出轉(zhuǎn)入玻璃瓶中。(2)生物素化T4取lmg的N羥基琥珀酰亞胺酯化的生物素溶于0.2mLDMF中,攪拌下逐滴加入到上(1)的透析液中,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)后裝入透析袋對(duì)0.02MpH7.4PB液透析過(guò)夜。2.2冊(cè)P標(biāo)記親和素取5mgHRP溶于0.5mL蒸餾水中,加入新鮮配制的60mM過(guò)碘酸鈉0.5mL,混勻后4°C放置30分鐘,然后加入160mM乙二醇0.5mL,室溫放置30分鐘。將5mg/mL的親和素蒸餾水溶液lmL加入到上述溶液中,混勻后裝入透析袋對(duì)0.05MPH9.5的CB液中4'C攪拌透析過(guò)夜。2.3生物素一親和素系統(tǒng)放大的T4-HRP標(biāo)記物將3.1.生物素化T4的產(chǎn)物和2.服P標(biāo)記親和素的產(chǎn)物完全混合,在37。C下攪拌反應(yīng)1小時(shí)后加入等體積的甘油,保存于-20'C。3.酶標(biāo)稀釋液以0.1MPH7.5Tris-HC1的緩沖液為稀釋液,加入0.2%BSA,以及一定量的阻斷劑。4.酶標(biāo)記物濃度的選定用前述3標(biāo)記方法制備的酶標(biāo)記物,選擇不同濃度的酶標(biāo)記物測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光強(qiáng)度,考察信噪比。選擇信噪比高的酶標(biāo)記物的濃度。若都符合要求,則選擇較低濃度的酶標(biāo)記物以減少其使用量,從而降低成本。5.T4標(biāo)準(zhǔn)品的制備取1mg的T4原料溶解于lmL的DMF中,配成1mg/mL的溶液,然后以人去激素血清將T4原料稀釋成濃度為0、20、40、80、160、320ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品。采用前述的辣根過(guò)氧化物酶(服P)標(biāo)記T4的標(biāo)記方法。6.預(yù)包被抗體板的制備(1)包被以0.06Mffl4.8的檸檬酸緩沖液為稀釋液將羊抗T4多抗稀釋至一定濃度,每個(gè)微孔加100微升,4'C靜置過(guò)夜。(2)封閉次日用含1%BSA的PH7.4,0.02MP.B液封閉未結(jié)合位點(diǎn).37°C1小時(shí)后拍干,真空包裝。7.洗滌液的配制濃縮洗滌液配方:試劑終濃度1000ml用量Tris198raM24gHC115mlNaCl2.74M160gKC154mM4gPH8.0—8.58.半成品及成品的組成上述(一)~~(十)步驟所得產(chǎn)品裝入小瓶及尖底離心管中,即為半成品。抽出三份經(jīng)過(guò)特異性、穩(wěn)定性、靈敏度及精密度檢定合格才能組裝成定量T4試劑盒。組成試劑盒后還需抽出三份同半成品一樣經(jīng)過(guò)檢定合格才能出售。權(quán)利要求1.一種甲狀腺素(T4)定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法),其特征在于,包含T4標(biāo)準(zhǔn)品、抗體預(yù)包被反應(yīng)板、稀釋液、洗滌液、化學(xué)發(fā)光底物液,用辣根過(guò)氧化酶(HPR)標(biāo)記T4抗原,其中化學(xué)發(fā)光底物液通過(guò)以下方法制備A液在雙蒸水中加入Tris和濃HCl配成0.1MpH8.5的Tris-HCl緩沖液。在此緩沖液中加入Luminol、Tween20以及苯并熒蒽(結(jié)構(gòu)如下圖所示),混合均勻。B液在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸,配制成0.1MpH4.6的檸檬酸緩沖液,在此溶液中加入30%過(guò)氧化氫溶液。使用前將A液與B液按1∶1比例混合后使用。id="icf0001"file="A2006101658480002C1.gif"wi="69"he="31"top="92"left="33"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2.如權(quán)利要求l所述的試劑盒,其特征在于其中辣根過(guò)氧化酶(HPR)標(biāo)記T4抗原是通過(guò)以下方法制備的A.生物素化T4(1)T4與BSA的連接取羧基已經(jīng)被甲酯化的T4lmg溶于0.2mLDMF中成5mg/mL的溶液,加入lmL濃度為0.5mg/mL的BSA(溶于0.05MpH6.8的PB中),混勻后加入200uL的戊二醛,混勻室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜。次日取出裝入透析袋并對(duì)0.05MpH9.4的CB液透析24小時(shí),中間換液3次,然后取出轉(zhuǎn)入玻璃瓶中。(2)生物素化T4取N羥基琥珀酰亞胺酯化的生物素溶于0.2mLDMF中,攪拌下逐滴加入到上(1)的透析液中,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)后裝入透析袋對(duì)0.02MPH7.4PB液透析過(guò)夜。B.HRP標(biāo)記親和素取服P溶于蒸餾水中,加入新鮮配制的過(guò)碘酸鈉,混勻后4。C放置30分鐘,然后加入160mM乙二醇,室溫放置30分鐘。將5mg/raL的親和素蒸餾水溶液加入到上述溶液中,混勻后裝入透析袋對(duì)0.05MpH9.5的CB液中4'C攪拌透析過(guò)夜。C.生物素一親和素系統(tǒng)放大的T4-HRP標(biāo)記物將一.生物素化T4的產(chǎn)物和2.HRP標(biāo)記親和素的產(chǎn)物完全混合,在37。C下攪拌反應(yīng)1小時(shí)后加入等體積的甘油,保存于-20℃。3.如權(quán)利要求1,2中任意一個(gè)所述的試劑盒,其特征在于抗體預(yù)包被反應(yīng)板是不透光的白色微孔板。4.一種如權(quán)利要求1-3中任意一個(gè)試劑盒的制備方法,其特征在于,該方法包括下列步驟(1)T4標(biāo)準(zhǔn)品制備取一定量的T4原料溶解于DMF中,然后以人去激素血清將T4原料稀釋成一系列濃度。即可作為標(biāo)準(zhǔn)品使用。(2)酶標(biāo)物的制備采用前述的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記T4的標(biāo)記方法。(3)酶標(biāo)記物稀釋液的制備以0.1MPH7.5的Tris-HCl緩沖液為稀釋液,加入0.2%BSA以及一定量的阻斷劑。(4)包被抗體成為預(yù)包被反應(yīng)板以0.06MPH4.8的檸檬酸緩沖液為稀釋液將羊抗T4多抗稀釋至一定濃度,每個(gè)微孔加100微升,4℃靜置過(guò)夜。次日用含WBSA的0.02Mra7.4的PB灘:封閉未結(jié)合位點(diǎn),37℃1小時(shí)后拍干,真空包裝;(5)分裝試劑盒其余各種組份,按試劑盒需要量分裝在小瓶中;(6)檢定試劑盒的特異性、靈敏度、精密度、穩(wěn)定性合格;(7)組裝成為成品。5.—種應(yīng)用權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的試劑盒的檢測(cè)方法,其檢測(cè)步驟為(1)自4℃冰箱中取出試劑盒,室溫平衡15分鐘。(2)取出包被板條,插入板架上。(3)在反應(yīng)孔中分別加一定量的各濃度標(biāo)準(zhǔn)品和樣本,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)空白l孔,然后除空白孔外各孔均加入相同體積的酶標(biāo)記物,用微量震蕩器充分振蕩混勻,37℃溫育l小時(shí)。(4)甩去反應(yīng)液,每孔加滿輛釋后的洗滌液,洗板5次,最后在干凈的吸水紙上扣干。(5)各孔均加入相同體積的化學(xué)發(fā)光底物液,用微量震蕩器充分振蕩混合均勻,室溫避光反應(yīng)。(6)在發(fā)光測(cè)量?jī)x上依序測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)。(7)以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和RLU值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以各待測(cè)樣本的RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上査出該樣本的T4濃度。6.—種采用酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理定量測(cè)定甲狀腺素(T4)的方法,其特征在于采用權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)中所述的試劑盒作為工具。7.—種使用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記T4抗原的方法(生物素一親和素放大系統(tǒng)),其包括以下步驟A.生物素化T4(1)T4與BSA的連接取羧基己經(jīng)被甲酯化的T4lmg溶于0.2mLDMF中成5mg/mL的溶液,加入lmL濃度為0.5mg/mL的BSA(溶于0.05MpH6.8的PB中),混勻后加入200uL的戊二醛,混勻室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜。次日取出裝入透析袋并對(duì)0.05MpH9.4的CB液透析24小時(shí),中間換液3次,然后取出轉(zhuǎn)入玻璃瓶中;(2)生物素化T4取N羥基琥珀酰亞胺酯化的生物素溶于0.2mLDMF中,攪拌下逐滴加入到上(1)的透析液中,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)后裝入透析袋對(duì)0.02MPH7.4PB液透折過(guò)夜;B.HRP標(biāo)記親和素取服P溶于蒸餾水中,加入新鮮配制的過(guò)碘酸鈉,混勻后4'C放置30分鐘,然后加入160mM乙二醇,室溫放置30分鐘。將5mg/mL的親和素蒸餾水溶液加入到上述溶液中,混勻后裝入透析袋對(duì)0.05MpH9.5的CB液中4'C攪拌透析過(guò)夜;G..生物素一親和素系統(tǒng)放大的T4-HRP標(biāo)記物將一.生物素化T4的產(chǎn)物和2.HRP標(biāo)記親和素的產(chǎn)物完全混合,在37。C下攪拌反應(yīng)1小時(shí)后加入等體積的甘油,保存于-2(TC。8.—種用于T4試劑盒的發(fā)光底物的制備方法,其特征在于包括以下步驟A液在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH8.5的Tris-HC1緩沖液。在此緩沖液中加入Lurainol、Tween20以及苯并熒蒽(結(jié)構(gòu)如下圖所示),混合均勻。B液在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸,配制成O.1MpH4.6的檸檬酸緩沖液,在此溶液中加入30%過(guò)氧化氫溶液。使用方法使用前將A液與B液按1:1比例混合后使用。<formula>seeoriginaldocumentpage4</formula>全文摘要本發(fā)明屬于免疫診斷
技術(shù)領(lǐng)域
,本發(fā)明公開了一種甲狀腺素(T4)酶促化學(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒,本發(fā)明的試劑盒由T4標(biāo)準(zhǔn)品,抗體預(yù)包被反應(yīng)板,辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記物,稀釋液,洗滌液和化學(xué)發(fā)光底物液組成。本發(fā)明試劑盒具有快速,簡(jiǎn)便,靈敏,價(jià)廉,重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),是甲狀腺功能亢進(jìn)(甲亢)和減退(甲減)的診斷和療效評(píng)價(jià)的重要指標(biāo),有較高的臨床使用價(jià)值,本發(fā)明提供了這種試劑盒的制備方法。文檔編號(hào)G01N33/543GK101201354SQ200610165848公開日2008年6月18日申請(qǐng)日期2006年12月14日優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日發(fā)明者應(yīng)希堂,斯林,胡國(guó)茂申請(qǐng)人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司
網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1