專利名稱：甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒及其制備方法
甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒及其制備方法本發(fā)明涉及一種免疫分析醫(yī)學(xué)中的檢測(cè)試劑盒，具體設(shè)計(jì)一種甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒及其制備方法。該試劑盒結(jié)合了免疫磁微粒分離技術(shù)和突光免疫分析技術(shù)，檢測(cè)范圍寬，靈敏度高，抗干擾強(qiáng)。甲狀腺疾病是常見的內(nèi)分泌疾病，全球患病人數(shù)已超3億，中國患者超過6. 7千萬，且呈逐年增加。最新的《中國十城市甲狀腺病流行病學(xué)調(diào)查》統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，我國十城市的甲亢患病率為3.7%、甲減患病率為6.5%、甲狀腺結(jié)節(jié)患病率為18.6%。因甲狀腺疾病具有多發(fā)性，臨床癥狀多樣性及復(fù)雜性的特點(diǎn)，血清甲狀腺激素測(cè)定在臨床中應(yīng)用十分廣泛。本試劑盒用于定量檢測(cè)人血清中的總甲狀腺素(TT4)的含量。 T4是甲狀腺分泌的主要產(chǎn)物，也是構(gòu)成下丘腦-垂體前葉-甲狀腺調(diào)節(jié)系統(tǒng)完整性不可缺少的成份。對(duì)合成代謝有影響作用。T4由二分子的二碘酪氨酸(DIT)在甲狀腺內(nèi)偶聯(lián)生成。T4與甲狀腺球蛋白結(jié)合貯存在甲狀腺濾泡的殘腔中，在TSH的調(diào)節(jié)下分泌釋放。T4及其相關(guān)的甲狀腺激素T3負(fù)責(zé)對(duì)人體中各種生化過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，這些過程是正常新陳代謝和神經(jīng)活動(dòng)的基礎(chǔ)。盡管T3具有很強(qiáng)的生物能量，但T4通常以約50倍于循環(huán)T3的形式存在于人血清中。血清中99%以上的T4以與其它蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在，不具生物學(xué)活性。由于血清中運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)的濃度易受外源性和內(nèi)源性作用的影響，因此，在檢測(cè)血清T4濃度的過程中需考慮到結(jié)合蛋白質(zhì)的狀況。如果忽略這一點(diǎn)，會(huì)導(dǎo)致反映甲狀腺代謝狀況檢測(cè)的錯(cuò)誤結(jié)果。血清總T4檢測(cè)是最早應(yīng)用于臨床檢測(cè)甲狀腺功能的甲狀腺激素，對(duì)于評(píng)價(jià)甲狀腺功能可以說功不可沒。正常成人血清TT4水平為64-154nmol/L(5-12ug/dl)。T4水平升高見于甲亢，高TBG血癥(妊娠，口服雌激素及口服避孕藥，家族性)，急性甲狀腺炎，亞急性甲狀腺炎，急性肝炎，肥胖癥，應(yīng)用甲狀腺激素時(shí)，進(jìn)食富含甲狀腺激素的甲狀腺組織等。水平降低可見于甲減，低TBG血癥(腎病綜合征，慢性肝病，蛋白丟失性腸病，遺傳性低TBG血癥等)，全垂體功能減退癥，下丘腦病變，劇烈活動(dòng)等。T4測(cè)定可用于甲亢、原發(fā)性和繼發(fā)性甲減的診斷以及TSH抑制治療的監(jiān)測(cè)等，具有較高的臨床診斷價(jià)值。免疫學(xué)測(cè)定是以抗體-抗原的特異性識(shí)別、抗體標(biāo)記技術(shù)和示蹤技術(shù)為基礎(chǔ)的定量技術(shù)。在腫瘤標(biāo)志物的體液檢測(cè)中具有廣泛應(yīng)用。現(xiàn)有的甲狀腺激素的測(cè)定方法有平衡透析法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附分析法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法、電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)及微孔板酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。但這些方法都具有一定局限性，，如平衡透析法操作步驟繁瑣，操作時(shí)間長；放射免疫分析方法的試劑具有放射性，會(huì)對(duì)操作人員的身體健康產(chǎn)生影響，操作不能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；酶聯(lián)免疫分析方法靈敏度低，步驟繁瑣；時(shí)間分辨熒光免疫分析法與電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法都需要較為昂貴的稀土元素作為試劑，不利于大范圍的推廣使用；微孔板酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析法則受到固相載體表面積的限制，無法實(shí)現(xiàn)較寬范圍的檢測(cè)。
在實(shí)際的免疫檢測(cè)中，由于待測(cè)樣品中所含的雜質(zhì)成分較多，一定程度上影響了檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，所以從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中快速分離、純化出目的待測(cè)無，是臨床檢驗(yàn)工作者面臨的難題之一。免疫磁微粒技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親合力的各種免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)，使其致敏為免疫磁微粒，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好；操作簡單；不影響被分離細(xì)胞或其它生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點(diǎn)，在外加磁場(chǎng)作用下定向運(yùn)動(dòng)，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。免疫磁微粒分析技術(shù)與熒光發(fā)光免疫分析技術(shù)結(jié)合檢測(cè)待測(cè)物，可大大提高檢測(cè) 的靈敏度和準(zhǔn)確性，它以毫米級(jí)磁微粒為載體，利用表面有機(jī)物提供的羧基活性集團(tuán)與蛋白質(zhì)氨基共價(jià)結(jié)合，采用抗體進(jìn)行“搭橋”成免疫磁微粒，可進(jìn)行抗原、抗體反應(yīng)。該技術(shù)的新穎之處有(I)采用微小的磁微粒作為固相可增加包被表面積，從而增加了抗原抗體的有效包被量，不僅節(jié)省了原料，而且有助于建立寬分為的免疫檢測(cè)方法，尤其適合于高濃度臨床樣本的測(cè)定，避免HOOK效應(yīng)的發(fā)生；(2)利用順磁鐵微粒為固相載體，外包抗原或抗體，增加抗原、抗體的接觸面積及底物發(fā)光面積，提高反應(yīng)的靈敏度，并采用旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)使磁微粒起攪拌作用及分離結(jié)合抗原-抗體與游離抗體的作用。鑒于國內(nèi)化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光分析儀器幾乎全為國外廠商生產(chǎn)，而絕大多數(shù)廠商采用儀器加試劑盒捆綁銷售的壟斷模式，并在儀器中人為設(shè)置排它性檢測(cè)程序，從而抬高了配套試劑盒價(jià)格，增加了檢測(cè)成本。而時(shí)間分辨熒光免疫分析法在我國的起步較晚，很多測(cè)量儀器及試劑還要依靠進(jìn)口 ；很多國產(chǎn)分析軟件的編制還存在操作繁瑣，功能不全，界面不簡潔等缺點(diǎn)。本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒及其制備方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒，包括甲狀腺素系列標(biāo)準(zhǔn)品，T4-IgG包被的磁微粒，堿性磷酸酶標(biāo)記的甲狀腺素抗體，熒光發(fā)光底物，樣本稀釋液，濃縮洗漆液，還包括一個(gè)反應(yīng)測(cè)試杯。所述反應(yīng)測(cè)試杯為不透明聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯中的一種材料制成。所述甲狀腺素系列標(biāo)準(zhǔn)品為多克隆抗體或單克隆抗體。所述的熒光發(fā)光底物，包括凍干粉和底物溶解液；其中，底物凍干粉為磷酸-4-甲基傘形酮；底物溶解液為2-氨基-2甲基-I丙酮。所述濃縮洗滌液為，濃度0. 01-0. 05M、pH值為7. 0-7. 6的磷酸鹽緩沖液，且緩沖液中含有0. 01-0. 05%的吐溫20和終濃度為8-14g/L的氯化鈉。所述樣本稀釋液為磷酸鹽緩沖液。一種甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒的制備方法，采用如下工藝步驟A)甲狀腺素系列標(biāo)準(zhǔn)品的制備用去激素人血清甲狀腺素純品稀釋成標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度為 0-360ng/ml ；B)T4-IgG包被磁微粒的制備將粒徑為0. 5-lmm的磁微粒靜置于含1_1. 5ug/mlT4-IgG，濃度為0. OlM的碳酸鹽緩沖液中，室溫混勻10-30min后37°C過夜，取出，用稀釋好的濃縮洗滌液清洗1-3次，4°C封閉液過夜，洗1-3次并抽真空干燥，平均分配到反應(yīng)測(cè)試杯中；C)堿性磷酸酶標(biāo)記的甲狀腺素抗體標(biāo)記物的制備T4單克隆抗體采用過碘酸鈉法與堿性磷酸酶交聯(lián)，用酶標(biāo)記物稀釋液進(jìn)行稀釋，稀釋比例為I : 3000，制成酶標(biāo)工作液；D)熒光發(fā)光底物的制備去離子水中含0. 01-0. 05mM磷酸_4_甲基傘形酮，制成凍干粉；底物溶解液為，濃度0. 1-0. 5M、pH值9. 0-11. 0的2-氨基-2-甲基_1丙酮；E)樣本稀釋液的制備濃度為0. 01-0. 05M的磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 6。F)濃縮洗滌液的制備向步驟E中的磷酸鹽緩沖液中加入體積百分比為0. 01-0. 05%吐溫20和終濃度為8-14g/L的氯化鈉；
G)分裝步驟取步驟C中制得的酶標(biāo)工作液100ul-200ul平均分配到步驟B中含有磁微粒的反應(yīng)杯中，并凍干封口 ；H)將上述試劑組裝成試劑盒。所述步驟B中,磁微粒為直徑0. 05-lmm粒徑、四氧化三鐵內(nèi)核、表面包裹帶有氨基活性基團(tuán)的聚合物。所述步驟B中，封閉液是含有質(zhì)量百分比濃度為0. 05 % -0. 5 %明膠和0. 05% -0. 2%疊氮鈉的pH為7. 4的濃度為0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液。所述步驟C中，酶標(biāo)記物稀釋液為，含有0. 4mg/ml ANS和0. 05% BSA的Tris-CL緩沖液，緩沖液的PH值為8. O。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，使用的磁微粒具有超順磁、高分散、表面積大的特點(diǎn)。對(duì)樣本的前處理要求低，樣品前處理過程簡單快捷，可高速、大通量的檢測(cè)大批樣本，便于操作和生產(chǎn)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例,一、甲狀腺素磁微粒突光發(fā)光免疫分析試劑盒的制備A)甲狀腺素系列標(biāo)準(zhǔn)品的制備(I)將60ml的正常人血清等份裝入四個(gè)容量瓶中，然后分別加入8. Og活性炭，倒置用漩渦振蕩器混合均勻，振蕩8h后，以6000rpm，離心20min，將上清過濾，向?yàn)V液中加入體積百分比濃度為0. 05% Proclin-300，冷凍保存。(2)向上述步驟中得到的去激素人血清中加入不同量的T4純品稀釋成標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)電化學(xué)發(fā)光測(cè)定濃度后，分裝成濃度為0ng/ml, 15ng/ml,45ng/ml,90ng/ml, 180ng/ml和360ng/ml的6瓶T4校準(zhǔn)品。B) T4-IgG包被磁微粒的制備將粒徑為0. 5-lmm的磁微粒靜置于含I. 5ug/ml T4_IgG，濃度為0. OlM的碳酸鹽緩沖液中，室溫混勻30min后37°C過夜，取出，用稀釋好的濃縮洗滌液清洗I次，4°C封閉液過夜，洗3次并抽真空干燥，每反應(yīng)測(cè)試杯中放置10粒。C)堿性磷酸酶標(biāo)記的甲狀腺素抗體標(biāo)記物的制備
用含有0. 4mg/ml ANS和0. 05 % BSA的Tris-CL，pH8. 0緩沖液配制成酶標(biāo)稀釋液。T4單克隆抗體用過碘酸鈉法與堿性磷酸酶交聯(lián)。并加入如上述稀釋液，以I 3000稀釋成酶標(biāo)工作液。D)熒光發(fā)光底物的制備在 去離子水中加入濃度為0. OlmM磷酸_4_甲基傘形酮，冷凍干燥，制成底物凍干粉。在去離子水中加入濃度為0. IM 2-氨基-2-甲基-I丙酮，pH10. 0，制成底物溶解液。E)樣本稀釋液的制備濃度為0. 05M的磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 2。F)濃縮洗滌液的制備向步驟E中的磷酸鹽緩沖液中加入體積百分比為0. 05%吐溫20和終濃度為14g/L的氯化鈉。G)分裝步驟取步驟C中制得的酶標(biāo)工作液150ul平均分配到步驟B中含有磁微粒的反應(yīng)杯中，并凍干封口。H)將用上述方法制備的各組分分裝并裝入試劑盒中。以檢測(cè)100個(gè)樣本的試劑盒為例，包括(I) T4系列標(biāo)準(zhǔn)品共6瓶，Iml/瓶。(2)內(nèi)含有反應(yīng)體系的密閉反應(yīng)杯100個(gè)。(3)樣本稀釋液I瓶，IOOml/瓶。(4)熒光發(fā)光底物凍干粉I瓶，凈重20g ;底物溶解液I瓶IOOml ;在使用前將底物溶解液倒入熒光發(fā)光底物凍干粉瓶中，混合均勻。(5)濃縮洗滌液一瓶100ml，使用時(shí)用去離子水稀釋20倍。二、本發(fā)明試劑盒的使用方法如下I)試劑的準(zhǔn)備A.將試劑盒置室溫(18_26°C )平衡20分鐘。B.從試劑盒中取出濃縮洗滌液，用去離子水以I : 20配制成工作液。C.發(fā)光底物凍干粉充分溶解于底物溶解液中。2)樣本準(zhǔn)備取人空腹晨血清樣本,3000rpm離心IOmin,去上層血清進(jìn)行分析。3)操作步驟A.取出所需數(shù)量的反應(yīng)杯置于板架上。B.加入標(biāo)準(zhǔn)品1-6和待測(cè)樣本，每反應(yīng)杯20ul。C.加入樣本稀釋液每反應(yīng)杯150ul。D.置于磁力混合分離器上37°C孵育IOmin。E.棄去液體，每反應(yīng)杯加入稀釋后的濃縮洗滌液500ul，反復(fù)洗滌五次，去洗液。F.每反應(yīng)杯加入200ul熒光發(fā)光底物。G.于熒光分光光度計(jì)中檢測(cè)FU值。4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算以T4系列標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，F(xiàn)U值Logit轉(zhuǎn)換為縱坐標(biāo)，進(jìn)行直線回歸，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣本的FU值代入方程即可求出對(duì)應(yīng)濃度值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對(duì)本實(shí)施例中制備的試劑盒進(jìn)行檢定，結(jié)果如下I、試劑盒靈敏度測(cè)定平均測(cè)定10個(gè)Stl標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，計(jì)算其FU的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，帶入線性方程，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的濃度值，并重復(fù)該操作5次，得到該試劑盒的最低檢出限，本試劑盒的最低檢測(cè)限為3ng/ml。2、試劑盒精密度實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例I制備的試劑盒分別取三批進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定低、中、高三種不同濃度的血清，平行測(cè)定10次，得出每次分析的批內(nèi)和多次分析的批間變異。其批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%。3、試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒，包括甲狀腺素系列標(biāo)準(zhǔn)品，T4-IgG包被的磁微粒，堿性磷酸酶標(biāo)記的甲狀腺素抗體，熒光發(fā)光底物，樣本稀釋液，濃縮洗滌液，還包括一個(gè)反應(yīng)測(cè)試杯。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒，其特征在于所述反應(yīng)測(cè)試杯為不透明聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯中的一種材料制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒，其特征在于所述甲狀腺素抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒，其特征在于所述的熒光發(fā)光底物，包括凍干粉和底物溶解液；其中，底物凍干粉為磷酸-4-甲基傘形酮；底物溶解液為2-氨基-2甲基-I丙酮。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為，濃度O. 01-0. 05M、pH值為7. 0-7. 6的磷酸鹽緩沖液，且緩沖液中含有O.01-0. 05%的吐溫20和終濃度為8-14g/L的氯化鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒，其特征在于所述樣本稀釋液為磷酸鹽緩沖液。
7.一種甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒的制備方法，采用如下工藝步驟 A)甲狀腺素系列標(biāo)準(zhǔn)品的制備用去激素人血清稀釋甲狀腺素純品，其濃度為0_360ng/ml ； B)T4-IgG包被磁微粒的制備將粒徑為O. 5-lmm的磁微粒靜置于含1_1. 5ug/mlT4-IgG，濃度為O. OlM的碳酸鹽緩沖液中，室溫混勻10-30min后37°C過夜，取出，用稀釋好的濃縮洗滌液清洗1-3次，4°C封閉液過夜，洗1-3次并抽真空干燥，平均分配到反應(yīng)測(cè)試杯中； C)堿性磷酸酶標(biāo)記的甲狀腺素抗體標(biāo)記物的制備T4單克隆抗體采用過碘酸鈉法與堿性磷酸酶交聯(lián)，用酶標(biāo)記物稀釋液進(jìn)行稀釋，稀釋比例為I : 3000，制成酶標(biāo)工作液； D)熒光發(fā)光底物的制備去離子水中含O.01-0. 05mM磷酸-4-甲基傘形酮，制成凍干粉；底物溶解液為，濃度O. 1-0. 5M、pH值9. 0-11. O的2-氨基-2-甲基_1丙酮； E)樣本稀釋液的制備濃度為O.01-0. 05M的磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 6。
F)濃縮洗滌液的制備向步驟E中的磷酸鹽緩沖液中加入體積百分比為O.01-0. 05%吐溫20和終濃度為8-14g/L的氯化鈉； G)分裝步驟取步驟C中制得的酶標(biāo)工作液100ul-200ul平均分配到步驟B中含有磁微粒的反應(yīng)杯中，并凍干封口 ； H)將上述試劑組裝成試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒的制備方法，其特征在于所述步驟B中，磁微粒為直徑O. 05-lmm粒徑、四氧化三鐵內(nèi)核、表面包裹帶有氨基活性基團(tuán)的聚合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒的制備方法，其特征在于所述步驟B中，封閉液是含有質(zhì)量百分比濃度為0.05%-0.5%明膠和O. 05% -O. 2%疊氮鈉的pH為7. 4的濃度為O. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒的制備方法，其特征在于所述步驟C中，酶標(biāo)記物稀釋液為，含有O. 4mg/ml ANS和O. 05% BSA的Tris-CL 緩沖液，緩沖液的PH值為8. O。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫分析醫(yī)學(xué)中的檢測(cè)試劑盒，具體設(shè)計(jì)一種甲狀腺素磁微粒熒光發(fā)光免疫分析試劑盒，包括甲狀腺素系列標(biāo)準(zhǔn)品，T4-IgG包被的磁微粒，堿性磷酸酶標(biāo)記的甲狀腺素抗體，熒光發(fā)光底物，樣本稀釋液，濃縮洗滌液，還包括一個(gè)反應(yīng)測(cè)試杯。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，使用的磁微粒具有超順磁、高分散、表面積大的特點(diǎn)。對(duì)樣本的前處理要求低，樣品前處理過程簡單快捷，可高速、大通量的檢測(cè)大批樣本，便于操作和生產(chǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102662068SQ20121011685
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月19日
發(fā)明者曹紋野, 李子樵 申請(qǐng)人:上海藍(lán)怡科技有限公司