專利名稱：用于檢測(cè)和/或定量人類dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、診斷學(xué)領(lǐng)域，更具體來(lái)說(shuō)屬于分析和法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明還屬于核酸擴(kuò)增和定量領(lǐng)域，更具體來(lái)說(shuō)屬于DNA定量領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在所有DNA分型方法中，以及各種其他科學(xué)領(lǐng)域的DNA檢測(cè)中，測(cè)定從法醫(yī)樣品以及其他樣品回收的DNA的量是一個(gè)關(guān)鍵步驟。例如對(duì)于多重DNA分型試劑盒來(lái)說(shuō)，為了產(chǎn)生最優(yōu)結(jié)果，通常需要輸入的DNA在0.5至2ng的狹窄范圍內(nèi)。因此，為了確保陽(yáng)性結(jié)果是陽(yáng)性結(jié)果和/或陰性結(jié)果是由不存在DNA造成的陰性結(jié)果，DNA的定量是絕對(duì)重要的。此夕卜，法醫(yī)DNA測(cè)試實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求人類特異性的DNA定量。這是由于分離技術(shù)可能將人類DNA與細(xì)菌和其他外源DNA —起回收而造成的。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了允許對(duì)人類特異性DNA進(jìn)行定量的許多方法步驟，包括初始印跡(start-blot)技術(shù)、基于液體的雜交測(cè)定法和實(shí)時(shí)PCR (聚合酶鏈反應(yīng))。目前，由于實(shí)時(shí)PCR的動(dòng)態(tài)范圍寬并且易于自動(dòng)化，實(shí)時(shí)PCR是主導(dǎo)技術(shù)?，F(xiàn)代的STR試劑盒已變得靈敏得多，并且即使使用少量DNA也能獲得良好結(jié)果。因此，對(duì)于允許精確和準(zhǔn)確定量甚至低濃度樣品中的人類DNA的方法、試劑盒和核酸區(qū)域存在著需求。已經(jīng)有某些定量和檢測(cè)試劑盒可用，然而它們具有嚴(yán)重的缺點(diǎn)。一種這樣的試劑盒是 Quantifiler Human 試劑盒(Applied Biosystems),另一種試劑盒是 QuantifilerDuo試劑盒(Applied Biosystems),另一種試劑盒是Plexor HY實(shí)時(shí)PCR定量試劑盒(Promega)0 Quantifiler Duo試劑盒和Plexor HY試劑盒兩者都祀向基因組上的常染色體和性染色體(Y染色體)靶標(biāo)。所述試劑盒的缺點(diǎn):根據(jù)LaSalle等，(Forensic ScienceInternational:Genetics, “通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行DNA定量的單拷貝和多拷貝方法的分析，’ (Analysis of Single and Mult1-copy Methods for DNA Quantification byReal-Time Polymerase Chain Reaction)),與 Plexor HY 相t匕，Quantifiler 試齊[J盒在定量中更準(zhǔn)確，但是具有較低的動(dòng)態(tài)范圍。Plexor HY由于擴(kuò)增多拷貝靶標(biāo)而提供較高的動(dòng)態(tài)范圍，但是準(zhǔn)確性較低。這種較低的準(zhǔn)確性可以歸因于多拷貝靶標(biāo)。如果由于例如靶標(biāo)拷貝數(shù)的不穩(wěn)定性，擴(kuò)增少于基因組上全套20個(gè)拷貝，那么常染色體與性染色體(Y)靶標(biāo)之間的擴(kuò)增比率可能發(fā)生變化。Plexor HY試劑盒的動(dòng)態(tài)范圍略好于其他試劑盒(LaSalle等，F(xiàn)orensic Science International:Genetics, “通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行DNA定量的單拷貝和多拷貝方法的分析”(Analysis of Single and Mult1-copy Methods for DNAQuantification by Real-Time Polymerase Chain Reaction))。在統(tǒng)計(jì)學(xué)t匕較中，LaSalle等證實(shí)了這兩種試劑盒之間的顯著差異。法醫(yī)學(xué)中的另一個(gè)重要參數(shù)是必須進(jìn)行分析的DNA的降解等級(jí)。由于Quantifiler Human和PlexoHY試劑盒的擴(kuò)增子的大小從62至133個(gè)堿基對(duì)(bp)不等，因此當(dāng)將試劑盒應(yīng)用于降解的DNA時(shí)， 預(yù)期可能存在顯著差異。
發(fā)明概述本發(fā)明解決了上面指出的問(wèn)題，并提供了如下所概述的以下解決方案。一方面，本發(fā)明涉及用于定量和/或檢測(cè)樣品中基因組的一個(gè)或多個(gè)核酸的方法，其中a.對(duì)所述核酸進(jìn)行擴(kuò)增，并且被擴(kuò)增的基因座是基因組中的多拷貝基因座，b.所述多拷貝基因座在至少兩個(gè)不同的染色體上具有拷貝，c.并且對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和/或定量。這種新方法與現(xiàn)有方法相比的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)是更高的靈敏度和被檢測(cè)靶標(biāo)的更高穩(wěn)定性。其他以前已知的靶標(biāo)在不同個(gè)體之間可能存在變化，這是由于重復(fù)元件傾向于在數(shù)目上變化(Pavelitz等，人類U2snRNA基因在分裂中期表現(xiàn)出永久性開(kāi)放的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和啟動(dòng)子角軍體(Human U2snRNA Genes Exhibit a Persistently Open TranscriptionalState and Promoter Disassembly at Metaphase), Molecular and CellularBiology, 20081, p.3573-3588 ;Liao等，編碼人類U2snRNA的串聯(lián)重復(fù)基因(RNU2基因座)的協(xié)同進(jìn)化參與快速染色體內(nèi)均勻化和稀有的染色體間基因轉(zhuǎn)變(Concerted evolution ofthe tandemly repeated genes encoding human U2snRNA(the RNU21ocus)involves rapidintrachromosomal homogenization and rare interchromosomal gene conversion),The EMBO Journal, Vol.16, N0.3, pp.588, 598, 1997 ； Jasinska 等，塑造人類轉(zhuǎn)錄組的重復(fù)序列(Repetitive sequences that shape the human transcriptome), FEBS Letters567(2004) 136-141)。理想情況下，所述基因座不是重復(fù)元件例如短的串聯(lián)重復(fù)序列，或本身不是具有下式的元件:(AwCxGyTz) 2-1_，其中W、X、y和z可以在O至10之間變化,并表示該單元中存在的核苷酸數(shù)目。所述單元可以被重復(fù)2至1000次。另一種重復(fù)元件是通常在端粒內(nèi)的衛(wèi)星DNA。其他也不適合的重復(fù)元件是短散在核元件(SINE)和長(zhǎng)散在核元件(LINE)。此外，本發(fā)明涉及基因組中的多拷貝基因座用于檢測(cè)和/或定量所述基因組的核酸的用途，其中所述多拷貝基因座不是重復(fù)元件并在至少兩個(gè)不同的染色體上具有拷貝。此外，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和/或定量人類核酸的試劑盒，其中所述試劑盒包含引物，所述引物在嚴(yán)緊的條件下與在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段上與SEQ ID N0.1或52的序列具有至少80%序列同一性的序列結(jié)合。在本文中使用下列縮寫:(1)HDA (解鏈酶依賴性擴(kuò)增)，(2) PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)，(3)gDNA (基因組DNA)，(4)FAM (6-羧基熒光素)，(5) SNP (單核苷酸多態(tài)性)，(6)NTC (無(wú)模板對(duì)照)，(7) BHQ (黑洞淬滅劑)，(8) qPCR (定量PCR)，(9) HEX (6-羧基-4，7，2’，4’，5’，7’ -六氯熒光素)。發(fā)明詳述用于定量和/或檢測(cè)樣品中基因組的一個(gè)或多個(gè)核酸的方法，其中a.對(duì)所述核酸進(jìn)行擴(kuò)增，并且被擴(kuò)增的基因座是基因組中的多拷貝基因座，b.所述多拷貝基因座在至少兩個(gè)不同的染色體上具有拷貝，c.并且對(duì)擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和/或定量。令人驚訝的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用于核酸的檢測(cè)和/或定量時(shí)，不是重復(fù)元件的多拷貝基因座優(yōu)于其他基因座。眾所周知，在不同個(gè)體之間重復(fù)元件的拷貝數(shù)可能不同。因此，本發(fā)明優(yōu)選涉及本文中引述的方法，其中所述多拷貝基因座不是重復(fù)元件?？偟膩?lái)說(shuō)，這些核酸可以具有原核或真核等任何來(lái)源。優(yōu)選情況下，它們是哺乳動(dòng)物的，更優(yōu)選為人類的。這是因?yàn)楸景l(fā)明的一個(gè)極大優(yōu)點(diǎn)是其在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。一個(gè)這樣的序列被顯示在SEQ ID N0.1中，另一個(gè)序列顯示在SEQ ID N0.52中。事實(shí)上，SEQ ID N0.1是SEQ ID N0.52的一部分。本發(fā)明人已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，該序列和/或與其具有序列相似性的序列可以在人類基因組中被多次找到。因此，理想情況下使用與這些序列結(jié)合的引物和/或探針。
權(quán)利要求
1.用于定量和/或檢測(cè)樣品中基因組的一個(gè)或多個(gè)核酸和/或用于分析人類DNA的可能的降解狀態(tài)和/或用于分析拷貝數(shù)變異(CNV)的方法，其中 a.對(duì)所述核酸進(jìn)行擴(kuò)增，并且被擴(kuò)增的基因座是基因組中的多拷貝基因座， b.所述多拷貝基因座在至少兩個(gè)不同的染色體上具有拷貝， c.并且對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和/或定量，并且 d.所述多拷貝基因座不是重復(fù)元件。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述基因座與SEQID N0.1或SEQ ID N0.52的序列在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段上具有至少80%的序列同一性。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述多拷貝基因座的至少4個(gè)不同拷貝被擴(kuò)增。
4.權(quán)利要求1至3的方法，其中擴(kuò)增方法是非等溫法或等溫法。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述擴(kuò)增方法選自定量實(shí)時(shí)PCR(rtPCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、多重置換擴(kuò)增(MDA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、解鏈酶依賴性擴(kuò)增(HDA)、SMART擴(kuò)增法(SMAP)、單引物等溫?cái)U(kuò)增(SPIA)、切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(NEAR)、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述擴(kuò)增方法是解鏈酶依賴性擴(kuò)增(HDA)或?qū)崟r(shí)PCR(rtPCR)o
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在60個(gè)堿基對(duì)和200個(gè)堿基對(duì)之間。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中用于擴(kuò)增的引物具有在18個(gè)核苷酸的區(qū)段上與SEQ ID N0.2、3、5、6、8、9、10、11和/或12的差異不超過(guò)5個(gè)核苷酸的核苷酸序列。
9.基因組中的多拷貝基因座用于檢測(cè)和/或定量所述基因組的核酸、用于分析人類DNA的可能的降解狀態(tài)或作為參比基因用于拷貝數(shù)變異(CNV)分析的用途，其中所述多拷貝基因座在至少兩個(gè)不同的染色體上具有拷貝。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述基因座與SEQID N0.1或SEQ ID N0.52的序列在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段上具有至少80%的序列同一性。
11.用于檢測(cè)和/或定量人類核酸的試劑盒，其中所述試劑盒包含引物，所述引物在嚴(yán)緊的條件下與在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段上與SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.52的序列具有至少80%的序列同一性的序列結(jié)合。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述試劑盒中至少一個(gè)引物具有在18個(gè)核苷酸的區(qū)段上與SEQ ID N0.2、3、5、6、8、9、10、11和/或12的差異不超過(guò)5個(gè)核苷酸的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和/或定量樣品中基因組的一個(gè)或多個(gè)核酸的方法、試劑盒和各種核酸序列的用途。其中對(duì)所述核酸進(jìn)行擴(kuò)增，并且被擴(kuò)增的基因座是基因組中的多拷貝基因座，所述多拷貝基因座在至少兩個(gè)不同的染色體上具有拷貝，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和/或定量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103180460SQ201180045929
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月23日
發(fā)明者安迪·溫德, 弗蘭切斯卡·迪帕斯奎爾, 薩比恩·韋爾納, 薩沙·斯特勞布 申請(qǐng)人:凱杰有限公司