專(zhuān)利名稱(chēng)：肝臟的類(lèi)器官、其用途以及獲得它們的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝臟的類(lèi)器官、其用途以及獲得它們的方法。
背景技術(shù)：
肝臟的基本結(jié)構(gòu)單位是肝小葉。每個(gè)小葉由肝細(xì)胞板組成，所述肝細(xì)胞板內(nèi)襯有向中央輸出靜脈呈放射狀排列的血竇毛細(xì)血管。肝小葉大致呈六邊形，六個(gè)角中的每一個(gè)由存在的肝門(mén)三聯(lián)體(門(mén)靜脈、膽管和肝動(dòng)脈)劃分。盡管肝細(xì)胞是主要的肝臟薄壁細(xì)胞類(lèi)型，它們與膽管上皮細(xì)胞(cholangiocyte)(膽管上皮細(xì)胞(biliary epithelial cell))、內(nèi)皮細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫(kù)普弗(Kupffer)細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和肝星形細(xì)胞協(xié)同起作用。該復(fù)雜的結(jié)構(gòu)是肝功能的關(guān)鍵。肝臟干細(xì)胞的存在仍然是有爭(zhēng)議的。一方面，某種損傷發(fā)生時(shí)，肝臟中的組織維持和肝臟再生并非由干細(xì)胞而是由成熟細(xì)胞(肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞)的分裂驅(qū)動(dòng)的。然而，抑制肝細(xì)胞增殖的肝臟受損模型同樣表明該器官響應(yīng)于損傷而再生的能力。這表明可以將肝臟看作是具有兼性干細(xì)胞的器官。目前，從肝細(xì)胞或通過(guò)胚胎干細(xì)胞(ES)或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的分化而獲得的肝臟培養(yǎng)物不能更長(zhǎng)時(shí)間的擴(kuò)增和自我更新。最近，在小腸中鑒定出特異性表達(dá)于循環(huán)的隱窩基底柱狀(CBC)細(xì)胞中的基因Lgr5，所述隱窩基底柱狀細(xì)胞是散布于Paneth細(xì)胞之間的小細(xì)胞(Barker et al.，2007.Nature449:1003-1007)。利用將GFP/他莫昔芬(tamoxifen)誘導(dǎo)的Cre重組酶盒整合至Lgr5基因座的小鼠，甚至是在Cre誘導(dǎo)14個(gè)月之后，通過(guò)世系追蹤評(píng)估表明，Lgr5+CBC細(xì)胞構(gòu)成能夠產(chǎn)生上皮細(xì)胞的全部細(xì)胞類(lèi)型的多能干細(xì)胞。

最近發(fā)現(xiàn)除了 Lgr5,還有Lgr6而非Lgr4是成體干細(xì)胞特有的標(biāo)志物。Lgr5表達(dá)于大腦、腎臟、肝臟、視網(wǎng)膜、胃、腸、胰腺、乳腺、毛囊、卵巢、腎上腺髓質(zhì)和皮膚的干細(xì)胞中，而Lgr6表達(dá)于大腦、肺、乳腺、毛囊和皮膚的干細(xì)胞中。在此我們開(kāi)發(fā)了培養(yǎng)成體肝臟祖細(xì)胞和獲得肝臟的類(lèi)器官的方法，所述肝臟的類(lèi)器官表現(xiàn)出更長(zhǎng)時(shí)間的維持，能夠分化成肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞譜系，并且維持分離的肝臟碎塊的基本生理機(jī)能。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了用于獲得肝臟的類(lèi)器官的方法，其中所述方法包括在第一“擴(kuò)增”培養(yǎng)基(在此又被稱(chēng)為EM)中培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選地，接著在第二“分化”培養(yǎng)基(在此又被稱(chēng)為DM)中培養(yǎng)細(xì)胞。肝臟的類(lèi)器官可以通過(guò)培養(yǎng)單個(gè)Lgr5+干細(xì)胞，含有至少一個(gè)Lgr5+干細(xì)胞的細(xì)胞群和/或肝臟碎塊獲得。在此，其中“培養(yǎng)基中的細(xì)胞”是指如下含義:包括單個(gè)Lgr5+干細(xì)胞，含有至少一個(gè)Lgr5+干細(xì)胞的細(xì)胞群和/或肝臟碎塊。在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增培養(yǎng)基包含EGF、Wnt激動(dòng)劑、FGF和煙酰胺。優(yōu)選地，Wnt激動(dòng)劑是R-spondinl，因而擴(kuò)增培養(yǎng)基被稱(chēng)為“ERFNic”。特別優(yōu)選的擴(kuò)增培養(yǎng)基還包含HGF 且被稱(chēng)為 “ERFHNic”。
在一個(gè)實(shí)施方案中，分化培養(yǎng)基包含EGF、TGF-0抑制劑、FGF和Notch抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，TGF-β抑制劑是Α83-01和/或Notch抑制劑是DAPT。該分化培養(yǎng)基在此被稱(chēng)為“EAFD”，并且是本發(fā)明優(yōu)選的分化培養(yǎng)基。任選地，F(xiàn)GF可由HGF替代，或可選擇地，分化培養(yǎng)基中可同時(shí)含有或不含F(xiàn)GF和HGF。還可以添加地塞米松。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞最初可以培養(yǎng)于還包含Wnt和Noggin的擴(kuò)增培養(yǎng)基中，例如含有EGF、Noggin、R-spondin和Wnt，以及任選地FGF、HGF和煙酰胺的“ENRW”培養(yǎng)基。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基對(duì)于開(kāi)始幾日刺激細(xì)胞的初期擴(kuò)增是最佳的。因而，該第一擴(kuò)增培養(yǎng)基在此有時(shí)又被稱(chēng)為EM1。在一些實(shí)施方案中，大約I日、2日、3日、4日、5日、6日、7日或更久，例如2周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個(gè)月或更久，14個(gè)月或更久之后，將如七和Noggin去除。然后可以在如以上所述不含Wnt或Noggin的本發(fā)明的擴(kuò)增培養(yǎng)基中擴(kuò)增細(xì)胞。該第二擴(kuò)增培養(yǎng)基在此有時(shí)又被稱(chēng)為EM2。在一些實(shí)施方案中，在EM2中培養(yǎng)細(xì)胞大約I日、2日、3日、4日、5日、6日、7日或更長(zhǎng)的時(shí)間，如3、4、5、10、20或更多周。然后可以將培養(yǎng)基更換為如以上所述的最佳分化培養(yǎng)基，其包含TGF- β抑制劑和Notch抑制劑。通常，分化培養(yǎng)基不含fct激動(dòng)劑、R-spondin或煙酰胺。這促進(jìn)細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞分化。這些細(xì)胞適合于移植到人或動(dòng)物。本發(fā)明還提供了肝臟的類(lèi)器官。本申請(qǐng)首次描述了離體培養(yǎng)肝臟的類(lèi)器官。

發(fā)明詳述第一方面，本發(fā)明提供了獲得和/或培養(yǎng)肝臟碎塊或肝臟的類(lèi)器官的方法，其中所述方法包括:在存在培養(yǎng)基的條件下，與細(xì)胞外基質(zhì)相接觸培養(yǎng)上皮干細(xì)胞和/或含有所述上皮干細(xì)胞的分離的組織碎塊，所述培養(yǎng)基包含添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基:作為促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子的表皮生長(zhǎng)因子和FGF，所述FGF能夠結(jié)合FGFR2或FGFR4且優(yōu)選FGFlO,煙酰胺，以及優(yōu)選地,Wnt激動(dòng)劑，優(yōu)選R-spondin 1、R_spondin2、R_spondin3或R-spondin4和/或Wnt_3a。優(yōu)選地,還添加HGF。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了獲得和/或培養(yǎng)肝臟碎塊或肝臟的類(lèi)器官的方法，其中所述方法包括:在存在培養(yǎng)基的條件下，與細(xì)胞外基質(zhì)相接觸培養(yǎng)上皮干細(xì)胞和/或含有所述上皮干細(xì)胞的分離的組織碎塊，所述培養(yǎng)基包含添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基:BMP抑制劑，Wnt激動(dòng)劑，作為促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子的表皮生長(zhǎng)因子、FGF(其能夠結(jié)合FGFR2或FGFR4，優(yōu)選FGF10)和HGF，胃泌素，煙酰胺，B27，N2和N-乙酰半胱氨酸。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法允許培養(yǎng)上皮干細(xì)胞和/或來(lái)自含有所述干細(xì)胞的肝臟的分離的碎塊，同時(shí)保留了保持未分化表型和自我維持能力的干細(xì)胞的存在。更令人驚奇地是，觀測(cè)到本發(fā)明的方法允許單個(gè)分離的上皮干細(xì)胞在缺乏干細(xì)胞壁龕時(shí)長(zhǎng)成肝臟的類(lèi)器官。干細(xì)胞存在于人和小鼠成體的許多器官中。雖然成體干細(xì)胞在個(gè)體組織中的精確特性可能存在很大差異，成體干細(xì)胞共有至少以下特性:它們保持未分化的表型；其后代可向相關(guān)組織中存在的全部譜系分化；它們終生保持自我維持的能力；以及它們能夠使相關(guān)組織受損后再生。干細(xì)胞存在于特化的部位，干細(xì)胞壁龕，其提供了維持所述干細(xì)胞群的適當(dāng)?shù)募?xì)胞間接觸和信號(hào)。
上皮干細(xì)胞能夠形成組成上皮細(xì)胞的不同細(xì)胞類(lèi)型。一些諸如皮膚或腸的上皮細(xì)胞表現(xiàn)出快速的細(xì)胞更新，表明存在的干細(xì)胞必定連續(xù)地增殖。另一些諸如肝臟或胰臟的上皮細(xì)胞在正常條件下表現(xiàn)出非常緩慢的更新?？梢酝ㄟ^(guò)許多不同的實(shí)驗(yàn)方案來(lái)進(jìn)行肝臟上皮干細(xì)胞的分離。雖然本發(fā)明人并不希望受任何特定理論的束縛，在此假設(shè)組織受損時(shí)存在于肝臟內(nèi)的干細(xì)胞群負(fù)責(zé)肝臟再生。認(rèn)為激活時(shí)負(fù)責(zé)該受損-應(yīng)答再生的細(xì)胞群表達(dá)標(biāo)志物L(fēng)gr5。通過(guò)用肝毒性化合物CC14注射敲入Lgr5-LacZ的小鼠來(lái)模擬肝臟損傷，本發(fā)明人首次證實(shí)肝臟損傷誘導(dǎo)Lgr5表達(dá)于肝臟中活躍再生的位置處(參見(jiàn)實(shí)施例4)。本發(fā)明人還表明注射fct激動(dòng)劑R-spondin引起肝管中的Wnt信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)。雖然本發(fā)明人并不希望受任何特定理論的束縛，在此假設(shè)再生干細(xì)胞/祖細(xì)胞在肝臟損傷之后可以由fct信號(hào)通路激活。如果需要的話，如在此所述，可以接著從肝臟/肝臟碎塊中分離Lgr5陽(yáng)性細(xì)胞。因而本發(fā)明提供了從肝臟獲得/分離Lgr5+細(xì)胞的方法，包括誘導(dǎo)肝臟損傷或通過(guò)例如用R-spondin刺激Wnt信號(hào)通路。這是有用的，因?yàn)樵谝恍?shí)施方案中，Lgr5+細(xì)胞是體外獲得肝臟的類(lèi)器官的起點(diǎn)(雖然本發(fā)明的培養(yǎng)基的應(yīng)用允許通過(guò)添加諸如R-spondin的Wnt激動(dòng)劑來(lái)產(chǎn)生Lgr5+細(xì)胞，因而為了實(shí)施本發(fā)明，從肝臟獲得Lgr5+細(xì)胞并非是必需的)。還提供了通過(guò)該方法獲得的Lgr5+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞優(yōu)選不表達(dá)星形細(xì)胞標(biāo)志物，例如SMA。相反地,這樣的細(xì)胞優(yōu)選表達(dá)一種或多種肝臟祖細(xì)胞標(biāo)志物或干細(xì)胞標(biāo)志物，如Sox9。優(yōu)選地，與成體肝臟相比，一種或多種肝臟祖細(xì)胞標(biāo)志物或干細(xì)胞標(biāo)志物(如Sox9)的表達(dá)在所述細(xì)胞中上調(diào)。本發(fā)明還提供了用于再生肝臟的方法，包括刺激Wnt信號(hào)通路。這樣的方法在治療肝臟病癥中是有用的?？梢栽隗w內(nèi)、離體的分離的肝臟或者體外的肝臟碎塊或肝細(xì)胞群中，通過(guò)損傷或通過(guò)刺激fct信號(hào)通路在肝細(xì)胞中進(jìn)行Lgr5表達(dá)的誘導(dǎo)。在離體或體外進(jìn)行Lgr5表達(dá)誘導(dǎo)的實(shí)施方案中，可以將Lgr5陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)任何合適的方法給予有需要的患者，例如通過(guò)注射或通過(guò)植入。在一些實(shí)施方案中，將植入的細(xì)胞包含于生物相容的基質(zhì)中。在一些實(shí)施方案中，在治療中使用之前，將細(xì)胞離體擴(kuò)增。在本發(fā)明的優(yōu)·選方法中，將所述上皮干細(xì)胞從肝臟碎塊或肝臟膽管分離，更優(yōu)選地，從膽管組織分離。膽管組織的分離方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)所熟知的。例如，膽管可如在此所附的實(shí)施例中所描述的從肝臟分離。簡(jiǎn)而言之，可以在冷(4-10° C)的培養(yǎng)基，優(yōu)選改進(jìn)型DMEM/F12 (Invitrogen)中清洗成體肝臟組織，然后將組織破碎成大約5mm的塊，然后再用冷解離緩沖液(含有膠原酶、分散酶和FBS的DMEM培養(yǎng)基)清洗。優(yōu)選地，用解離緩沖液于大約37° C下孵育組織碎塊約2h。然后，可以用IOml移液管將組織碎塊充分懸浮于IOml冷(4-10° C)的分離緩沖液中。優(yōu)選地，將含有死細(xì)胞的第一上清液丟棄，并且優(yōu)選用解離緩沖液(如10-15ml)懸浮沉淀。進(jìn)一步充分懸浮組織碎塊之后，上清液中富集了膽管。可以以這種方法獲得含有膽管的上清液，并且在顯微鏡下收集膽管并將其保存于冷培養(yǎng)液(DMEM+5-10%FBS)中?？梢灾貜?fù)該方法，直到收集了至少10-20個(gè)膽管/孔。然后，可以將分離的膽管沉淀。優(yōu)選地，分離的膽管以大約20個(gè)膽管/孔的比率接種于50ul基質(zhì)膠(matrigel)中。與成熟的肝細(xì)胞在死亡之前短時(shí)間內(nèi)匯合生長(zhǎng)相反，本發(fā)明分離的肝臟上皮干細(xì)胞自我更新且無(wú)限期地生長(zhǎng)。已發(fā)現(xiàn)自我更新的細(xì)胞群是能夠在其表面表達(dá)Lgr5的細(xì)胞群。Lgr5陰性細(xì)胞不會(huì)自我更新。術(shù)語(yǔ)“自我更新”應(yīng)當(dāng)理解為表示細(xì)胞自我繁殖同時(shí)保持本發(fā)明細(xì)胞的原始增殖和分化特性的能力。這樣的細(xì)胞通過(guò)分裂增殖形成克隆，所述克隆進(jìn)一步分裂成克隆并由此無(wú)需外部干預(yù)而擴(kuò)增成細(xì)胞群的大小，而不會(huì)進(jìn)化成分化潛能更受限的細(xì)胞。優(yōu)選的方法基于本發(fā)明的肝臟干細(xì)胞在其表面表達(dá)Lgr5和/或Lgr6的事實(shí)；這些蛋白屬于大的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族(參見(jiàn)例如W02009/022907，其內(nèi)容全部并入本文)。Lgr亞家族在攜帶對(duì)配體結(jié)合重要的大的富含亮氨酸的胞外域上是獨(dú)特的。因而優(yōu)選的方法包括如前所述的由所述上皮組織制備細(xì)胞懸浮液，將所述細(xì)胞懸浮液與Lgr5和/或Lgr6結(jié)合化合物(如抗體)相接觸，將Lgr5和/或Lgr6結(jié)合化合物分離，以及從所述結(jié)合化合物中分離干細(xì)胞。優(yōu)選的是，從分離的膽管中手動(dòng)產(chǎn)生含有上皮干細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液。優(yōu)選地，將通過(guò)手動(dòng)破壞這種方法產(chǎn)生的小的類(lèi)器官碎塊以大約1:6的比率分開(kāi)。如果必要的話，可以在胰蛋白酶中以大約1:2稀釋率短時(shí)間(僅2或3分鐘)孵育這樣的碎塊。已發(fā)現(xiàn)在此階段，用胰蛋白酶處理上皮干細(xì)胞得到非常低的存活率:如果將細(xì)胞分成獨(dú)立的細(xì)胞，那么只有表達(dá)Lgr5的那些細(xì)胞存活。這部分非常少(大約占總細(xì)胞群的12%)。優(yōu)選的Lgr5和/或Lgr6結(jié)合化合物包括抗體,如特異性識(shí)別且結(jié)合Lgr5或Lgr6的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，如包括小鼠和大鼠單克隆抗體的單克隆抗體(參見(jiàn)例如W02010/016766，其內(nèi)容整體并入本文)。利用這樣的抗體，例如借助于本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的磁珠或通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)，可以分離表達(dá)Lgr5和/或Lgr6的干細(xì)胞。利用本發(fā)明的方法，分離表達(dá)Lgr5和/或Lgr6的一個(gè)單細(xì)胞且將本發(fā)明的方法應(yīng)用其上是可能的。因此，肝臟的類(lèi)器官可源自一個(gè)單細(xì)胞。干細(xì)胞壁龕

優(yōu)選地，在模擬所述干細(xì)胞天然存在的至少一部分細(xì)胞壁龕的微環(huán)境中培養(yǎng)分離的干細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)在生物材料的存在下培養(yǎng)所述干細(xì)胞而模擬這種細(xì)胞壁龕，所述生物材料如代表控制干細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵調(diào)控信號(hào)的基質(zhì)、支架和培養(yǎng)基底。這樣的生物材料包括天然的、半合成的和合成的生物材料，和/或其混合物。支架提供了二維或三維的網(wǎng)狀物。適合于這種支架的合成材料包括選自多孔固體、納米纖維和水凝膠的聚合物，所述水凝膠如，例如肽，包括自組裝的肽，由聚乙二醇磷酸酯、聚乙二醇延胡索酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚纖維素醋酸酯和/或它們的共聚物組成的水凝膠(參見(jiàn)例如Sahaet al., 2007.Curr Opin Chem Biol.11 (4):381 - 387;Saha et al., 2008.BiophysicalJournal95:4426 - 4438; Little et al.，2008.Chem.Revl08, 1787 - 1796)。如技術(shù)人員所熟知的，機(jī)械性能如，例如支架的彈性，影響干細(xì)胞的增殖、分化和遷移。優(yōu)選的支架包括生物可降解的(共)聚合物，其在植入受試者之后由天然存在的成分取代，例如以促進(jìn)組織再生和/或創(chuàng)傷愈合。更優(yōu)選地，所述支架在植入受試者之后基本上不引起免疫應(yīng)答。所述支架補(bǔ)充有天然、半合成或合成的配體，其提供了干細(xì)胞增殖和/或分化和/或遷移所需的信號(hào)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述配體包括確定的氨基酸片段。所述合成聚合物的實(shí)例包括Phironic F127嵌段共聚物表面活性劑(BASF),以及Ethisorb (Johnson andJohnson)。
細(xì)胞壁龕部分由干細(xì)胞和周?chē)?xì)胞以及由細(xì)胞在所述壁龕中產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)決定。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，將分離的肝臟碎塊或分離的膽管或上皮干細(xì)胞附著于ECM。ECM由多種多糖、水、彈性蛋白和糖蛋白組成，其中所述糖蛋白包括月父原蛋白、桌蛋白(entactin/nidogen)、纖連蛋白和層粘連蛋白。ECM由結(jié)締組織細(xì)胞分泌。已知包含不同組分的不同類(lèi)型的ECM，包括不同種類(lèi)的糖蛋白和/或糖蛋白的不同組合。所述ECM可通過(guò)在去除這些細(xì)胞并添加分離的肝臟碎塊或分離的膽管或分離的上皮干細(xì)胞之前，通過(guò)在容器中培養(yǎng)產(chǎn)生ECM的細(xì)胞如成纖維細(xì)胞來(lái)提供。產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞的實(shí)例是主要產(chǎn)生膠原蛋白和蛋白聚糖的軟骨細(xì)胞，主要產(chǎn)生IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、間質(zhì)前膠原蛋白和纖連蛋白的成纖維細(xì)胞，以及主要產(chǎn)生膠原蛋白(1、III和V型)、硫酸軟骨素蛋白多糖、透明質(zhì)酸、纖連蛋白和肌腱蛋白-C的結(jié)腸肌纖維母細(xì)胞?？蛇x擇地，通過(guò)商購(gòu)提供所述ECM。商購(gòu)可獲得的細(xì)胞外基質(zhì)的實(shí)例是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(Invitrogen)和來(lái)自Engelb reth-Holm-Swarm (EHS)小鼠肉瘤細(xì)胞的基膜制劑(如Matrigel (BDBiosciences))?？梢允褂煤铣傻募?xì)胞外基質(zhì)材料,如ProNectin (Sigma Z378666)。如果需要的話，可以使用細(xì)胞外基質(zhì)材料的混合物。利用ECM培養(yǎng)干細(xì)胞提高干細(xì)胞的長(zhǎng)期存活和未分化的干細(xì)胞的持續(xù)存在。缺乏ECM時(shí)，不能更久的培養(yǎng)干細(xì)胞培養(yǎng)物且未觀測(cè)到未分化的干細(xì)胞的持續(xù)存在。此外，ECM的存在允許培養(yǎng)三維的組織類(lèi)器官，其在缺乏ECM時(shí)無(wú)法培養(yǎng)。一般將細(xì)胞外基質(zhì)材料涂布于細(xì)胞培養(yǎng)皿，但是(另外地或可選擇地)可以以溶液提供?？梢允褂眉slmg/ml,或約I μ g/cm2至約250 μ g/cm2或約I μ g/cm2至約150 μ g/cm2的纖連蛋白溶液來(lái)涂布細(xì)胞培養(yǎng)皿。在一些實(shí)施方案中，用纖連蛋白以8 μ g/cm2至125 μ g/cm2涂布細(xì)胞培養(yǎng)皿。本發(fā)明方法中使用的優(yōu)選ECM包含至少兩種不同的糖蛋白，如兩種不同類(lèi)型的膠原蛋白或膠原蛋白和層粘連蛋白。ECM可以是合成的水凝膠細(xì)胞外基質(zhì)或天然存在的ECM。更優(yōu)選的ECM由Matrigel (BD Biosciences)提供,其包含層粘連蛋白、巢蛋白和膠原蛋白IV0本發(fā)明的組合物可包含血清或可以不含血清和/或不含血清替代物，如本文其他地方所述。優(yōu)選地，培養(yǎng)基和細(xì)胞制備物符合FDA生物產(chǎn)品要求標(biāo)準(zhǔn)的在線GMP工藝以確保產(chǎn)品的連續(xù)性。培養(yǎng)基本發(fā)明中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基包括受本文所提供的限制的任何合適的細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)基一般包含許多成分，其對(duì)于支持所培養(yǎng)細(xì)胞的維持是必需的?？紤]到以下公開(kāi)的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易配制合適的成分組合。本發(fā)明的培養(yǎng)基通常是含有標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)成分的營(yíng)養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)成分如氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、碳源和緩沖液，如下文中更詳細(xì)的描述。本發(fā)明的培養(yǎng)基一般在去離子蒸餾水中配制。一般在使用之前通過(guò)例如紫外光、加熱、輻射或過(guò)濾來(lái)滅菌本發(fā)明的培養(yǎng)基以防止污染?？蓪⑴囵B(yǎng)基冷凍(如于-20° C或-80° C)以?xún)?chǔ)存或運(yùn)輸。培養(yǎng)基可包含一種或多種抗生素以防止污染。培養(yǎng)基可具有內(nèi)毒素，其含量低于0.1內(nèi)毒素單位/ml或者0.05內(nèi)毒素單位/ml。本領(lǐng)域眾所周知確定培養(yǎng)基內(nèi)毒素含量的方法。優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)基是用基于碳酸鹽的緩沖液緩沖至pH7.4(優(yōu)選具有pH7.2-7.6或至少pH7.2且不高于pH7.6)的限定的合成培養(yǎng)基，同時(shí)在含有5%至10%的CO2,或至少5%且不超過(guò)10%的CO2，優(yōu)選5%的CO2的空氣中培養(yǎng)細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)普通常識(shí)可以理解，可在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中用作基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)基種類(lèi)?？赡苓m合的細(xì)胞培養(yǎng)基可商購(gòu)獲得，并且包括但不限于:達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)，最小必需培養(yǎng)基(MEM)，Knockout-DMEM(KO-DMEM)，Glasgow最小必需培養(yǎng)基(G-MEM)，伊格爾基本培養(yǎng)基(BME)，DMEM/Ham’s F12，改進(jìn)型DMEM/Ham’s F12,伊思考夫改良杜爾貝可培養(yǎng)基和最小基本培養(yǎng)基(MEM)，Ham’s F-10, Ham’ s F_12，199培養(yǎng)基，以及RPMI1640培養(yǎng)基。優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)基選自補(bǔ)充有谷氨酰胺、胰島素、青霉素/鏈霉素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的DMEM/F12和RPMI1640。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用改進(jìn)型DMEM/F12或改進(jìn)型RPMI，其對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)物是最佳的且已含有胰島素。在這種情況下，優(yōu)選地，所述改進(jìn)型DMEM/F12或改進(jìn)型RPMI培養(yǎng)基補(bǔ)充有谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素。.
在一些實(shí)施方案中，基本培養(yǎng)基包含改進(jìn)型DMEM F12、羥乙基哌嗪乙磺酸、青霉素/鏈霉素、谷氨酰胺、N乙酰半胱氨酸、B27、N2和胃泌素。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)由包含N2和胃泌素以及青霉素/鏈霉素的基本培養(yǎng)基開(kāi)始，但是之后取出這些成分。例如，在一些實(shí)施方案中，N2和胃泌素 以及青霉素/鏈霉素存在于本發(fā)明的EMl培養(yǎng)基中，但是不存在于EM2或DM中。例如，在一些實(shí)施方案中，N2和胃泌素以及青霉素/鏈霉素存在于本發(fā)明的EMl和EM2培養(yǎng)基中，但不存在于DM中。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，基本培養(yǎng)基是改進(jìn)型DMEM/F12或DMEM變型，所述DMEM變型中補(bǔ)充有青霉素/鏈霉素、N2、B27、谷氨酰胺和胃泌素。在優(yōu)選實(shí)施方案中，基本培養(yǎng)基包含胃泌素。在一些實(shí)施方案中，基本培養(yǎng)基還包含NAc和/或B27。進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充有純化的天然、半合成和/或合成的生長(zhǎng)因子，并且不含不明確的成分，如胎牛血清或小牛血清。各種不同血清替代物的制劑可以通過(guò)商購(gòu)得到且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。使用血清替代物時(shí)，根據(jù)常規(guī)技術(shù)可以使用按培養(yǎng)基體積計(jì)約1%至約30%的血清替代物。擴(kuò)增培養(yǎng)基(EM2):本發(fā)明一方面提供了細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含添加以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基或由添加以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基組成:作為促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子的表皮生長(zhǎng)因子和FGF，所述FGF能夠結(jié)合FGFR2或FGFR4且優(yōu)選FGF10，煙酰胺，以及優(yōu)選地，Wnt激動(dòng)劑，優(yōu)選R-spondinl。該培養(yǎng)基被稱(chēng)為EM2。優(yōu)選地，Wnt激動(dòng)劑是R-spondinl。包含EGF、R-spondinl、FGF和煙酰胺的培養(yǎng)基在此被稱(chēng)為ERFNiC。在一些實(shí)施方案中，EM2培養(yǎng)基不含Noggin，更優(yōu)選地，不含BMP-抑制劑。在一些實(shí)施方案中，EM2培養(yǎng)基不含Wnt，例如Wnt-3a。在一些實(shí)施方案中，除FGF之外還存在HGF。包含除FGF之外的HGF的優(yōu)選培養(yǎng)基是 ERFHNic (EGF+R-spondin (優(yōu)選 R-spondinl) +FGF (優(yōu)選 FGF10) +HGF+ 煙酰胺)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，ERFHNic培養(yǎng)基是長(zhǎng)期擴(kuò)增細(xì)胞的最佳培養(yǎng)基。缺乏HGF時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)基中保持存活不超過(guò)三個(gè)月。進(jìn)一步地，與存在HGF所培養(yǎng)的細(xì)胞相比，缺乏HGF時(shí)，10代之后，細(xì)胞顯示生長(zhǎng)不利，如由更低的增殖率所證實(shí)的。具體地，15代之后，缺乏HGF的細(xì)胞不會(huì)以與存在HGF的細(xì)胞相同的速率長(zhǎng)成類(lèi)器官。因而，發(fā)現(xiàn)HGF對(duì)于在長(zhǎng)期培養(yǎng)中維持良好的增殖率是必需的。因而本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的ERFHNic培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至少2周，至少I(mǎi)個(gè)月，至少2個(gè)月，更優(yōu)選地，至少3個(gè)月、至少4個(gè)月、至少5個(gè)月、至少6個(gè)月、至少7個(gè)月、至少8個(gè)月、至少9個(gè)月、至少10個(gè)月、至少15個(gè)月、至少20個(gè)月、至少24個(gè)月、至少25個(gè)月、至少30個(gè)月或更久，例如3年或更久。在實(shí)踐中，本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括利用E2持續(xù)細(xì)胞的大約20-30代。例如，細(xì)胞可以分裂20-30次，一般一周一次。優(yōu)選地，細(xì)胞會(huì)以每周約4倍或一周2次群體倍增的速率擴(kuò)增。本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用本發(fā)明的ERFHNic培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至少10代，例如，至少11、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少60代，或者15至35代，例如大約20-30代。在一些實(shí)施方案中，TGF-β抑制劑如Α83-01也存在于ΕΜ2培養(yǎng)基中。這在培養(yǎng)人細(xì)胞或類(lèi)器官時(shí)特別有用。在一些實(shí)施方案中，Α83-01以400至600ηΜ的濃度存在，例如450-550ηΜ、470_530ηΜ或大約500ηΜ。在ΕΜ2中存在TGF-β抑制劑的實(shí)施方案中，優(yōu)選不存在Notch抑制劑。擴(kuò)增培養(yǎng)基(EMl):一方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含添加以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基或由添加以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基組成:EGF，BMP抑制劑，R-spondin和Wnt。優(yōu)選地，BMP抑制劑是Noggin，并且EMl培養(yǎng)基被稱(chēng)為“ENRW” (EGF，Noggin,R-spondin和Wnt)。該培養(yǎng)基被稱(chēng)為EMl。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)包含Wnt和Noggin的培養(yǎng)基對(duì)于刺激細(xì)胞初期擴(kuò)增是理想的。因而，在一些實(shí)施方案中，EMl培養(yǎng)基只使用I代或I周，但是同樣設(shè)想EMl培養(yǎng)基可 使用大約一年，因?yàn)槠鋵?duì)細(xì)胞無(wú)害。因而，在一些實(shí)施方案中，從第O日至第10日使用EMl培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，例如第0-7日，第0-6日，第0-5日，第0-4日，第0-3日，第0-2日，第0-1日，其中第O日是細(xì)胞從其來(lái)源組織分離的那一日，第I日是隨后的那一日，或者使用EMl培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞I周或更久，例如2、3、4周或更久，或者1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12個(gè)月或更久。在一些實(shí)施方案中，EMl培養(yǎng)基僅在培養(yǎng)的第一日或者前兩日使用。在一些實(shí)施方案中，使用EMl培養(yǎng)基持續(xù)I代或多代，例如，1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、15、20、25、30或更多代，例如，20-30代。在一些實(shí)施方案中，在冷凍步驟或任何其他運(yùn)輸步驟之后使用EMl培養(yǎng)基，所述運(yùn)輸步驟涉及不與最佳生長(zhǎng)結(jié)合的培養(yǎng)基或溫度變化。EMl培養(yǎng)基補(bǔ)充有一種或多種選自以下的化合物:FGF、HGF、煙酰胺、胃泌素、B27、N-乙酰半胱氨酸和N2。在從冷凍庫(kù)存或單細(xì)胞開(kāi)始培養(yǎng)的情況下，EMl培養(yǎng)基優(yōu)選補(bǔ)充有ROCK抑制劑。Y27632是用于本發(fā)明中的優(yōu)選的ROCK抑制劑。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中提供了細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含添加以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基或由添加以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基組成:表皮生長(zhǎng)因子，能夠結(jié)合FGFR2或FGFR4的FGF，優(yōu)選FGF10以及HGF，這些作為促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子，胃泌素，煙酰胺，B27, N2和N-乙酰半胱氨酸，并且優(yōu)選地，BMP抑制劑,優(yōu)選Noggin ；以及Wnt 激動(dòng)劑，優(yōu)選 R-spondinl 和 / 或 Wnt_3a。還可以將B27 (Invitrogen), N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和 N2 (Invitrogen),胃泌素(Sigma)以及煙酰胺(Sigma)添加至以上所限定的培養(yǎng)基中，并且認(rèn)為其可刺激細(xì)胞增殖。在本發(fā)明的背景下，煙酰胺在此又被稱(chēng)為“Nic”?！癗2 補(bǔ)充劑”可購(gòu)自 Invitrogen, Carlsbad, CA ;www.1nvitrogen.com;目錄號(hào) 17502-048 ;以及 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria ;www.paa.com;目錄號(hào)F005-004 ；Bottenstein&Sato, PNAS, 76(1):514-517, 1979。N2 補(bǔ)充劑由 PAA LaboratoriesGmbH以100倍的液體濃縮液提供，其包含500μ g/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白，500 μ g/ml牛胰島素，
0.63 μ g/ml黃體酮，1611 μ g/ml腐胺和0.52 μ g/ml亞硒酸鈉?？蓪2補(bǔ)充劑以濃縮液添加至培養(yǎng)基中，或在添加至培養(yǎng)基之前稀釋。其可以I倍終濃度或其他終濃度來(lái)使用。N2補(bǔ)充劑的使用是將轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、黃體酮、腐胺和亞硒酸鈉并入本發(fā)明的培養(yǎng)基中的方便方式?！癇27 補(bǔ)充劑”(購(gòu)自 Invitrogen, Carlsbad, CA;www.1nvitrogen.com;當(dāng)前目錄號(hào) 17504-044 ；以及 PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria; www.paa.com;目錄號(hào)F01-002 ；Brewer et al., J Neurosci Res.，35 (5): 567-76，1993)可用于配制培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含生物素、膽固醇、亞油酸、亞麻酸、黃體酮、腐胺、視黃醇、視黃醇乙酸酯、亞硒酸鈉、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、DL-a-生育酚(維生素E)、白蛋白、胰島素以及轉(zhuǎn)鐵蛋白。B27補(bǔ)充劑由PAA Laboratories GmbH以50倍的液體濃縮液提供，除其它成分外其包含生物素、膽固醇、亞油酸、亞麻酸、黃體酮、腐胺、視黃醇、視黃醇乙酸酯、亞硒酸鈉、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、DL-α-生育酚(維生素E)、白蛋白、胰島素以及轉(zhuǎn)鐵蛋白。這些成分中至少亞麻酸、視黃醇、視黃醇乙酸酯和三碘甲狀腺原氨酸(T3)是核激素受體激動(dòng)劑?？蓪27補(bǔ)充劑以濃縮液添加至培養(yǎng)基中，或在添加至培養(yǎng)基之前稀釋。其可以I倍終濃度或其他終濃度來(lái)使用。B27補(bǔ)充劑的使用是將生物素、膽固醇、亞油酸、亞麻酸、黃體酮、腐胺、視黃醇、視黃醇乙酸酯、亞硒酸鈉、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、DL-a-生育酚(維生素E)、白蛋白、胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白并入本發(fā)明的培養(yǎng)基中的方便方式。

BMP抑制劑優(yōu)選添加至基本培養(yǎng)基的成分是BMP抑制劑。BMP作為二聚配體結(jié)合至由兩種不同受體絲氨酸/蘇氨酸激酶，I型和II型受體組成的受體復(fù)合物。II型受體使I型受體磷酸化，導(dǎo)致該受體激酶的活化。隨后I型受體使特異受體底物(SMAD)磷酸化，致使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起轉(zhuǎn)錄活性。BMP抑制劑定義為結(jié)合BMP分子以形成復(fù)合物的因子，其中所述BMP活性例如通過(guò)阻止或抑制BMP分子與BMP受體的結(jié)合而被中和。可選擇地，所述抑制劑是擔(dān)當(dāng)拮抗劑或逆轉(zhuǎn)激動(dòng)劑的因子。這種類(lèi)型的抑制劑與BMP受體結(jié)合并阻止BMP與所述受體的結(jié)合。后面這種因子的實(shí)例是抗體，其結(jié)合BMP受體并阻止BMP與抗體結(jié)合受體的相結(jié)合?？蓪MP抑制劑以這樣的量添加至培養(yǎng)基中，如在相同細(xì)胞類(lèi)型中所評(píng)估的，相對(duì)于缺乏所述抑制劑時(shí)的BMP活性水平，該量有效抑制細(xì)胞中BMP依賴(lài)性活性O(shè)最多90%，優(yōu)選最多80%，更優(yōu)選最多70%，更優(yōu)選最多50%，更優(yōu)選最多30%，更優(yōu)選最多10%，更優(yōu)選0%。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，BMP活性可通過(guò)測(cè)定BMP的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)確定，例如如Zilberberg et al., 2007.BMC Cell Biol.8:41 中所示例的。已知幾類(lèi)天然的BMP結(jié)合蛋白，包括Noggin(Peprotech),腱蛋白和包含腱蛋白結(jié)構(gòu)域的腱蛋白樣蛋白(R&D systems)，卵泡抑素和包含卵泡抑素結(jié)構(gòu)域的卵泡抑素相關(guān)蛋白(R&D systems)，DAN和包含DAN半胱氨酸-結(jié)(knot)結(jié)構(gòu)域的DAN樣蛋白(R&Dsystems),硬化蛋白 /SOST (R&D systems),核心蛋白聚糖(decorin, R&D systems),以及α -2 巨球蛋白(R&D systems)。在本發(fā)明的方法中優(yōu)選使用的BMP抑制劑選自Noggin、DAN和DAN-樣蛋白(包括Cerberus和Greml in (R&D systems))。這些可擴(kuò)散的蛋白能夠以不同程度的親和力結(jié)合BMP配體并抑制它們接近信號(hào)受體。在基本培養(yǎng)基中添加這些BMP抑制劑中的任何一種阻止了干細(xì)胞損失。
優(yōu)選的BMP抑制劑是Noggin。在本發(fā)明培養(yǎng)基的背景下，Noggin在此又被稱(chēng)為“N”。優(yōu)選地，將Noggin以至少10ng/ml,更優(yōu)選至少20ng/ml,更優(yōu)選至少50ng/ml,更優(yōu)選至少100ng/ml的濃度添加至基本培養(yǎng)基中。更加優(yōu)選的濃度是大約100ng/ml或正好100ng/ml。在培養(yǎng)干細(xì)胞期間，可以將所述BMP抑制劑在需要時(shí)(例如每日或隔日)添加至培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，將BMP抑制劑每隔一日添加至培養(yǎng)基中。雖然需要時(shí)(例如每日或隔日)可更換培養(yǎng)基，但是優(yōu)選每隔三日更換。Wnt激動(dòng)劑可添加至基本培養(yǎng)基的另一成分是Wnt激動(dòng)劑。在本發(fā)明培養(yǎng)基的背景下，Wnt激動(dòng)劑在此又被稱(chēng)為“W”。Wnt信號(hào)通路由Wnt蛋白結(jié)合至卷曲蛋白(Frizzled)受體家族成員的細(xì)胞表面受體時(shí)發(fā)生的一系列事件來(lái)限定。這導(dǎo)致Dishevelled家族蛋白的活化,所述Dishevelled家族蛋白抑制蛋白復(fù)合物包括軸蛋白(axin)、GSK-3和蛋白APC降解細(xì)胞內(nèi)β_連環(huán)蛋白(β-catenin)。所得到的富集的核β _連環(huán)蛋白增強(qiáng)了通過(guò)TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄。將Wnt激動(dòng)劑定義為細(xì)胞中激活TCF/LEF-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的因子。因而Wnt激動(dòng)劑選自結(jié)合并激活卷曲蛋白受體家族成員的真正的Wnt激動(dòng)劑,包括任何及全部的Wnt家族蛋白，細(xì)胞內(nèi)連環(huán)蛋白降解的抑制劑以及TCF/LEF的激活劑。將所述Wnt激動(dòng)劑以這樣的量添加至培養(yǎng)基中，如在相同細(xì)胞類(lèi)型中所評(píng)估的，相對(duì)于缺乏所述分子時(shí)的所述fct活性水平，該量有效刺激細(xì)胞中Wnt活性至少10%、更優(yōu)選至少20%、更優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少100%。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，可以通過(guò)測(cè)定fct的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)確定Wnt活性，例如通過(guò)pTOPFLASH和pFOPFLASH Tcf熒光素酶報(bào)告構(gòu)建體(Korinek et al.，1997.Science275:1784 - 1787)。Wnt激動(dòng)劑可包括分泌型糖蛋白，其包括Wnt-l/Int-1 ;Wnt_2/Irp (Int-Ι相關(guān)蛋白)；Wnt_2b/13 ；ffnt-3/Int-4 ；ffnt-3a (R&D systems) ；ffnt-4 ；ffnt-5a ；ffnt-5b ；ffnt-6(Kirikoshi H et al.2001.Biochem Biophys Res Com283:798-805) ；ffnt-7a(R&Dsystems) ；ffnt-7b ；ffnt-8a/8d ；ffnt-8b ；ffnt-9a/14 ；ffnt-9b/14b/15 ；ffnt-10a ；Wnt-10b/12 ;Wnt-ll ;以及 Wnt-16。人 Wnt 蛋白的概況由 “THE WNT FAMILY OF SECRETEDPROTEINS，，，R&D Systems Catalog, 2004 提供。另外的Wnt激動(dòng)劑包括分泌型蛋白的R-spondin家族，其與Wnt信號(hào)通路的激活和調(diào)控相關(guān)，且由 4個(gè)成員(R-spondinl (NU206, Nuvelo, San Carlos, CA)、R_spondin2 ((R&Dsystems)、R_spondin3 和 R-spondin-4)組成；以及 Norrin (又被稱(chēng)為 Norrie 病蛋白或NDP) (R&D systems),其是分泌型調(diào)控蛋白，由于以高親和力結(jié)合卷曲蛋白_4受體而類(lèi)似Wnt蛋白起作用并誘導(dǎo)Wnt信號(hào)通路的激活(Kestutis Planutis et al.(2007)BMC CellBiol.8:12)。
可以將模擬R-spondin活性的化合物用作本發(fā)明的Wnt激動(dòng)劑。最近發(fā)現(xiàn)R-spondin與Lgr5相互作用。因而，Lgr5激動(dòng)劑如激動(dòng)型抗_Lgr5抗體是可用于本發(fā)明中的Wnt激動(dòng)劑的例子。在本發(fā)明培養(yǎng)基的背景下，R-spondin在此又被稱(chēng)為“R”。最近被鑒定的Wnt信號(hào)通路的小分子激動(dòng)劑氨基嘧啶衍生物同樣作為Wnt激動(dòng)劑被明顯包括(Liu et al.(2005) Angew Chem Int Ed Engl.44, 1987-90)。已知的GSK抑制劑包括小干擾RNA(siRNA;CelI Signaling)、鋰(Sigma)> kenpaullone(Biomol International;Leost, M.et al.(2000)Eur.J.Biochem.267，5983 - 5994)、6_ 溴靛玉紅-30-丙酮肟(Mei jer, L.et al.(2003) Chem.Biol.10，1255 - 1266)、SB216763 和 SB415286 (Sigma-Aldrich)，以及防止 GSK-3 與軸蛋白相互作用的FRAT家族成員和FRAT衍生的肽。綜述由Meijer et al., (2004), Trends inPharmacological Sciences25, 471-480提供，在此通過(guò)引用并入。測(cè)定GSK-3抑制水平的方法和測(cè)定是本領(lǐng)域人員所熟知的，包括例如Liao et al2004, Endocrinology, 145(6):2941-9)中所描述的方法和測(cè)定。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Wnt激動(dòng)劑選自Wnt家族成員、R-spondinl_4(例如，R-spondinl或R_spondin4)、Norrin以及GSK抑制劑中的抑制或多種。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將至少一種Wnt激動(dòng)劑添加至基本培養(yǎng)基對(duì)于肝臟上皮干細(xì)胞或分離的膽管或分離的肝臟碎塊的增殖是重要的。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Wnt激動(dòng)劑包括R-spondinl或由R-spondinl組成。優(yōu)選地，將R-spondin I以至少200ng/ml、更優(yōu)選至少300ng/ml、更優(yōu)選至少500ng/ml的濃度添加至基本培養(yǎng)基中。還更優(yōu)選的R-spondinl濃度是大約500ng/ml或正好500ng/ml。在培養(yǎng)干細(xì)胞期間，可將所述Wnt家族成員在需要時(shí)(例如每日或隔日)添加至培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，將fct家族成員每隔一日添加至培養(yǎng)基中。雖然需要時(shí)(例如每日或隔日)可更換培養(yǎng)基，但是優(yōu)選每隔三日更換。在優(yōu)選實(shí)施方案中，Wnt激動(dòng)劑選自R-spondin、Wnt_3a和Wnt_6。更優(yōu)選地，R-spondin和Wnt_3a都用作Wnt激動(dòng)劑。該組合是特別優(yōu)選的，因?yàn)榱钊梭@奇地，該組合對(duì)類(lèi)器官形成具有協(xié)同效應(yīng)。優(yōu)選的濃度對(duì)于R-spondin是l-500ng/ml,例如l-10ng/ml、10-100ng/ml、l_50ng/ml、10-200ng/ml、200 至 500ng/ml、30ng/ml,對(duì)于 Wnt3a 是 lOOng/ml至 lOOOng/ml,例如 lOOng/ml 或 1000ng/ml。優(yōu)選地，Wnt激動(dòng)劑是Wnt配體,例如，如Wnt3a,并且可以新鮮添加至培養(yǎng)基中?？蛇x擇地，Wnt配體通過(guò)用表達(dá)所述Wnt配體的合適的表達(dá)構(gòu)建體感染細(xì)胞系轉(zhuǎn)染或者感染細(xì)胞系而表達(dá)于細(xì)胞系中。培養(yǎng)所述細(xì)胞系并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔收獲包含分泌型fct配體的培養(yǎng)基。例如，細(xì)胞在其一達(dá)到匯合且停止生長(zhǎng)時(shí)就產(chǎn)生fct3a。將來(lái)自未用所述表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞的培養(yǎng)基用作對(duì)照。收獲并檢測(cè)條件培養(yǎng)基，例如在熒光素酶表達(dá)受TCF反應(yīng)元件控制的試驗(yàn)中來(lái)檢測(cè)諸如Wnt3a的Wnt激動(dòng)劑的存在(Korinek et al.、1997.Science275:1784 - 1787)。在再生組織的培養(yǎng)物中使用時(shí)，將培養(yǎng)基稀釋。如本領(lǐng)域人員所熟知的，有時(shí)添加過(guò)量的Wnt配體與添加過(guò)少的Wnt配體一樣，對(duì)于培養(yǎng)是有害的。因此，條件培養(yǎng)基的實(shí)際稀釋度將取決于試驗(yàn)中確定 的fct配體的量。促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子
添加至基本培養(yǎng)基的又一成分是促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子的組合，其選自表皮生長(zhǎng)因子(EGF，(優(yōu)選來(lái)自P印rotech)，能夠結(jié)合FGFR2或FGFR4的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)(同樣優(yōu)選來(lái)自Peprotech)。能夠結(jié)合FGFR2 (FGF受體)或FGFR4的FGF優(yōu)選FGF4、FGF7或FGFlO (優(yōu)選來(lái)自P印rotech)，最優(yōu)選FGFlO。優(yōu)選使用全部3種EGF、FGF和HGF。在本發(fā)明培養(yǎng)基的背景下，EGF在此又被稱(chēng)為“E”，F(xiàn)GF在此又被稱(chēng)為“F”，以及HGF在此又被稱(chēng)為“H”。EGF對(duì)于各種培養(yǎng)的外胚層和中胚層細(xì)胞是有效的促細(xì)胞分裂因子，并且對(duì)體內(nèi)和體外特定細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)中一些成纖維細(xì)胞的分化具有深刻的影響。EGF前體作為膜結(jié)合分子存在，其被蛋白水解切割以形成刺激細(xì)胞的53個(gè)氨基酸的肽激素。EGF通過(guò)結(jié)合至定位EGF受體的質(zhì)膜發(fā)揮其對(duì)靶細(xì)胞的作用。EGF受體是跨膜蛋白酪氨酸激酶。EGF結(jié)合至受體導(dǎo)致激酶的活化以及隨后的受體自磷酸化。自磷酸化對(duì)于受體與其底物的相互作用是必需的。由EGF激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括磷脂酰肌醇通路,導(dǎo)致蛋白激酶C的活化并增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，以及致使MAP激酶活化的ras通路。這些通路參與調(diào)控細(xì)胞增殖，分化和存活(Herbst, 2004，Int Journal of radiationoncology, 59, 2, S21-S26)。優(yōu)選地,將EGF以5至500ng/ml或至少5且不高于500ng/ml的濃度添加至基本培養(yǎng)基中。優(yōu)選的濃度是至少10、20、25、30、40、45或50ng/ml且不高于500、450、400、350、300、250、200、150或100ng/ml。更優(yōu)選的濃度是至少50且不高于100ng/ml。甚至更優(yōu)選的濃度是約50ng/ml或50ng/ml。FGF10是屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)蛋白家族的蛋白。FGF家族成員具有廣泛的促細(xì)胞分裂和細(xì)胞存活活性，并且參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)生、組織修復(fù)、腫瘤生長(zhǎng)和入侵。FGF通過(guò)與細(xì)胞表面酪氨酸激酶受體(FGFR)相互作用來(lái)刺激細(xì)胞。已鑒定出四種密切相關(guān)的受體(FGFR1 - FGFR4)。已顯示FGFRl - FGFR3基因編碼多種亞型，并且這些亞型可能是確定配體特異性的關(guān)鍵。大部分FGF結(jié)合多于一種受體(Ornitz J Biol Chem.1998Feb27; 273 (9): 5349-57)。然而，F(xiàn)GF10 和 FGF7 在 FGF 中是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈儍H與特 異的FGFR2亞型(被稱(chēng)為FGFR2b，其僅由上皮細(xì)胞專(zhuān)門(mén)表達(dá))相互作用(Igarashi, J Biol Chem.1998273 (21): 13230-5)。FGF10 是優(yōu)選的能夠結(jié)合 FGFR2 或FGFR4 的 FGF。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/離散因子(HGF/SF)是通過(guò)結(jié)合至原癌性c_Met受體之后激活酪氨酸激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)來(lái)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和形態(tài)發(fā)生的形態(tài)發(fā)生因子。對(duì)于FGF10和HGF可以使用相同的濃度。對(duì)于FGF10，優(yōu)選的濃度是20、50、100、500ng/ml,不高于 500ng/ml。對(duì)于 HGF,優(yōu)選的濃度是 1、10、20、50ng/ml,不高于 50ng/ml。培養(yǎng)干細(xì)胞期間，需要時(shí)(例如，每日或每隔一日)優(yōu)選將所述促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子(即EGF、FGF10和HGF)的組合添加至培養(yǎng)基中。優(yōu)選的是每隔一日添加。雖然需要時(shí)(例如每日或每隔一日)可以更換培養(yǎng)基，但是優(yōu)選每隔三日更換。在一些實(shí)施方案中，諸如A83-01的TGF-β抑制劑也存在于EMl培養(yǎng)基中。這在培養(yǎng)人細(xì)胞或類(lèi)器官時(shí)是特別有用的。在一些實(shí)施方案中，A83-01以400-600nM，例如450-550nM、470-530nM或大約500nM.的濃度存在。在EMl中存在TGF-β抑制劑的實(shí)施方案中，優(yōu)選不存在Notch抑制劑。本發(fā)明優(yōu)選的擴(kuò)增培養(yǎng)基
實(shí)施例中描述了優(yōu)選的培養(yǎng)基和利用這些培養(yǎng)基的方法。例如，細(xì)胞培養(yǎng)基可包含添加了以下成分的基本培養(yǎng)基或由添加了以下成分的基本培養(yǎng)基組成=EGF和R-spondinl，并補(bǔ)充有FGF10，HGF和煙酰胺；例如，EGF(50ng/ml)和R-spondinl (lug/ml)，并補(bǔ)充有 FGFlO (100ng/ml)，HGF (25_50ng/ml)和煙酰胺(1-1OmM)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該培養(yǎng)基對(duì)于長(zhǎng)期擴(kuò)增細(xì)胞是優(yōu)選的。因此，該細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選用作本發(fā)明的EM2。優(yōu)選地，基本培養(yǎng)基補(bǔ)充有B27，N2和200ng/ml N-乙酰半胱氨酸。在一些實(shí)施方案中，基本培養(yǎng)基是改進(jìn)型DMEM/F12。然而，可以使用任何其他合適的基本培養(yǎng)基。實(shí)施例中描述了另一優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)基和使用該培養(yǎng)基的方法，優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基包含補(bǔ)充有以下成分的改進(jìn)型DMEM/F12或由補(bǔ)充有以下成分的改進(jìn)型DMEM/F12組成:B27、N2、200ng/ml N-乙酰半胱氨酸、50ng/ml EGF> I μ g/ml R-spondinl、IOnM 胃泌素、lOOng/ml FGF10、IOmM煙酰胺和50ng/ml HGF以及50%Wnt條件培養(yǎng)基，以及優(yōu)選I O-1 OOng/ml Noggin。Wnt條件培養(yǎng)基包含改進(jìn)型DMEM、P/S、B27、N2以及還有FCS。用Wnt3A表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞產(chǎn)生Wnt。幾日之后獲得整個(gè)培養(yǎng)基(即具有分泌的fct)并用作Wnt來(lái)源。因此，本發(fā)明提供了細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含添加了以下成分的人或動(dòng)物細(xì)胞的基本培養(yǎng)基或由添加了以下成分的人或動(dòng)物細(xì)胞的基本培養(yǎng)基組成:表皮生長(zhǎng)因子，能夠結(jié)合FGFR2或FGFR4的FGF，優(yōu)選FGF10以及HGF，這些作為促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子，胃泌素、煙酰胺、B27、N2和N-乙酰半胱氨酸，以及優(yōu)選地，BMP抑制劑，更優(yōu)選Noggin,和Wnt 激動(dòng)劑，更優(yōu)選 R-spondinl 和 / 或 Wnt_3a。因而本發(fā)明包括第一優(yōu)選的培養(yǎng)基，其包含添加了以下成分的人或動(dòng)物細(xì)胞的基本培養(yǎng)基或由添加了以下成分的人或動(dòng)物細(xì)胞的基本培養(yǎng)基組成:作為促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子的表皮生長(zhǎng)因子、FGF10和HGF，胃泌素、煙酰胺、B27、N2和N-乙酰半胱氨酸，BMP抑制劑，更優(yōu)選Noggin,和Wnt 激動(dòng)劑，更優(yōu)選 R-spondinl 和 Wnt_3a。該培養(yǎng)基可以用作本發(fā)明的EMl細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)刺激細(xì)胞的初期擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，用作EMl細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)基包含本發(fā)明的EM2培養(yǎng)基的全部成分且另外包含Wnt-3a和Noggin。在補(bǔ)充有N-乙酰半胱氨酸，B27和N2的基本培養(yǎng)基的實(shí)施方案中，以下成分優(yōu)選添加至培養(yǎng)基中:EGF、R-spondinl、胃泌素、FGF10、煙酰胺和HGF以及Wnt-條件培養(yǎng)基。優(yōu)選地，基本培養(yǎng)基補(bǔ)充有依照以上所述量的N-乙酰半胱氨酸、EGF、R-spondinl、胃泌素、FGF10、煙酰胺和HGF以及Wnt條件培養(yǎng)基。例如，在一些實(shí)施方案中，基本培養(yǎng)可補(bǔ)充有150ng/ml至250ng/mlN-乙酰半胱氨酸；優(yōu)選地，基本培養(yǎng)基補(bǔ)充有大約或正好200ng/ml N-乙酰半胱氨酸。例如，在一些實(shí)施方案中，基本培 養(yǎng)基可補(bǔ)充有40ng/ml至60ng/ml EGF ;優(yōu)選地，基本培養(yǎng)基補(bǔ)充有大約或正好50ng/ml EGF。例如，在一些實(shí)施方案中，基本培養(yǎng)基可補(bǔ)充有0.5 μ g/ml至1.5 μ g/ml R-spondinl ;優(yōu)選地,基本培養(yǎng)基補(bǔ)充有大約或正好I μ g/ml R-spondinl。例如,在一些實(shí)施方案中，基本培養(yǎng)基可補(bǔ)充有5nM至15nM胃泌素；優(yōu)選地，基本培養(yǎng)基補(bǔ)充有大約或正好IOnM胃泌素。例如，在一些實(shí)施方案中，基本培養(yǎng)基可補(bǔ)充有25-200ng/ml FGF10，例如70ng/ml至130ng/ml FGFlO ;優(yōu)選地，基本培養(yǎng)基補(bǔ)充有大約或正好100ng/ml FGF10。例如，在一些實(shí)施方案中，基本培養(yǎng)基可補(bǔ)充有5mM至15mM煙酰胺；優(yōu)選地，基本培養(yǎng)基補(bǔ)充有大約或正好IOmM煙酰胺。例如，在一些實(shí)施方案中，基本培養(yǎng)基可補(bǔ)充有25ng/ml至100ng/ml HGF,例如35ng/ml至65ng/ml HGF ;優(yōu)選地，基本培養(yǎng)基補(bǔ)充有大約或正好50ng/ml HGF。例如，在一些實(shí)施方案中，基本培養(yǎng)基可補(bǔ)充有35%至65%Wnt條件培養(yǎng)基；優(yōu)選地，基本培養(yǎng)基補(bǔ)充有大約或正好50%Wnt條件培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，胃 泌素和N2中的一種或兩種并不存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，基本培養(yǎng)基是改進(jìn)型DMEM/F12。優(yōu)選地，該第一培養(yǎng)基(例如，EM1、EM2或者EMl和EM2 二者)在本發(fā)明培養(yǎng)方法的開(kāi)始兩周使用。然而，其可用于更短的時(shí)間段，例如1、2、3、5、7或10日，或者更長(zhǎng)的時(shí)間段，例如3、4、5、10、20周或更久，5個(gè)月或更久，例如，6、7、8、9、10、11、12個(gè)月或更久。分化培養(yǎng)基(DM):另一方面，提供了第二細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含添加了以下成分的人或動(dòng)物細(xì)胞的基本培養(yǎng)基或由添加了以下成分的人或動(dòng)物細(xì)胞的基本培養(yǎng)基組成:EGF、TGF-β抑制劑和Notch抑制劑。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該培養(yǎng)基對(duì)于分化細(xì)胞是有用的。用于分化細(xì)胞的培養(yǎng)基在此可被稱(chēng)為DM。優(yōu)選地，第二細(xì)胞培養(yǎng)基還包含F(xiàn)GF和/或HGF。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二培養(yǎng)基包含添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基或由添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基組成:作為促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子的表皮生長(zhǎng)因子，F(xiàn)GF10和HGF ；Notch抑制劑；以及TGF-β 抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，TGF-β抑制劑是Α83-01和/或Notch抑制劑是DAPT。在另一實(shí)施方案中，DM細(xì)胞培養(yǎng)基還包含地塞米松。優(yōu)選的第二細(xì)胞培養(yǎng)基和利用該培養(yǎng)基的方法描述于實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基包含添加了以下成分的基本培養(yǎng)基或由添加了以下成分的基本培養(yǎng)基組成:50ng/ml EGF、100ng/ml FGF10、50nM A8301和IOuM DAPT0與任何其他合適的基本培養(yǎng)基一樣，改進(jìn)型DMEM/F12可用作基本培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞培養(yǎng)基不含R-spondin或Wnt。在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞培養(yǎng)基不含fct激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞培養(yǎng)基不含煙酰胺。在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞培養(yǎng)基不含BMP抑制劑。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，R-spondinl和煙酰胺都抑制成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物CYP3A11的表達(dá)卻促進(jìn)成肝母細(xì)胞標(biāo)志物白蛋白的表達(dá)。因此，為了增強(qiáng)細(xì)胞分化成更成熟的肝臟命運(yùn)，本發(fā)明人從細(xì)胞培養(yǎng)中去除R-spondin和煙酰胺。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)特異性膽管轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在含有R-spondinl的擴(kuò)增培養(yǎng)基中高度上調(diào)，表明培養(yǎng)物基因表達(dá)不平衡地偏向更多的膽管細(xì)胞命運(yùn)。Notch和TGF-β信號(hào)通路影響體內(nèi)膽管細(xì)胞命運(yùn)。實(shí)際上，缺失Rbpj (實(shí)現(xiàn)活性Notch信號(hào)通路所必需的)導(dǎo)致異常的小管發(fā)生(Zong Y.Development2009),而向肝臟外植體添加TGF-β利于體外膽管分化(Clotman F.Genes and Development2005) 0由于Notch和TGF-β信號(hào)通路在肝臟培養(yǎng)物中都高度上調(diào)(圖9)，本發(fā)明人推測(cè)抑制膽管細(xì)胞命運(yùn)可能觸發(fā)細(xì)胞向更多的肝細(xì)胞表型分化。發(fā)現(xiàn)向優(yōu)選不含R-spondin或Wnt的分化培養(yǎng)基中添加TGF-β抑制劑(如Α8301)和Notch抑制劑(如DAPT)增強(qiáng)成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，并且增加肝細(xì)胞樣細(xì)胞的數(shù)量(例如，參見(jiàn)實(shí)施例2)。Notch是可通過(guò)多重蛋白水解切割而激活的跨膜表面受體，其中的一種由具有蛋白酶活性的蛋白復(fù)合體(被稱(chēng)為Y-分泌酶)切割。Y-分泌酶是在膜內(nèi)實(shí)施其切割活性的蛋白酶。Y-分泌酶是多元復(fù)合酶，并且由至少四種不同的蛋白組成，即早老蛋白(早老蛋白I或2)、nicastrin, PEN-2和APH-1。早老蛋白是Y -分泌酶的催化中心。配體結(jié)合Notch受體時(shí)經(jīng)過(guò)構(gòu)象變化，這允許通過(guò)金屬蛋白酶ADAM蛋白酶作用而脫落胞外域。在這之后緊接著是Y-分泌酶復(fù)合體作用，其導(dǎo)致Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NI⑶)的釋放。NICD易位至細(xì)胞核與CSL(C-啟動(dòng)子結(jié)合因子/重組信號(hào)序列結(jié)合蛋白Jk /無(wú)毛阻抑物(Supressor-of-Hairless)/Lagl)相互作用。NIO)的結(jié)合將CSL由轉(zhuǎn)錄阻遏物轉(zhuǎn)化為致使Notch靶基因表達(dá)的激活劑。在本發(fā)明的背景下可使用的優(yōu)選的Notch抑制劑實(shí)例是:Y-分泌酶抑制劑，如DAPT或二苯并氮卓(dibenzazepine，DBZ)或苯二氮卓(benzodiazepine, BZ)或LY-411575,這些是能夠減少配體介導(dǎo)的Notch活化的抑制劑(例如通過(guò)Notch的顯性陰性配體或通過(guò)顯性陰性Notch或通過(guò)能夠至少部分阻斷Notch配體與Notch之間的相互作用的抗體)，或者ADAM蛋白酶的抑制劑。TGF-β信號(hào)通路參與許多細(xì)胞功能，包括細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞命運(yùn)和細(xì)胞凋亡。信號(hào)通路一般由TGF-β超家族配體與II型受體的結(jié)合開(kāi)始，這募集I型受體并使其磷酸化。然后I型受體使SMAD磷酸化，其充當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，并調(diào)控靶基因的表達(dá)?？蛇x擇地，TGF-β信號(hào)通路可激活MAP激酶信號(hào)通路，例如通過(guò)ρ38ΜΑΡ激酶。TGF-β超家族配體包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(ΒΜΡ)，生長(zhǎng)分化因子(GDF)，抗穆勒氏管激素(AMH)，激活素，nodal以及TGF- β。TGF- β抑制劑是降低TGF- β信號(hào)通路活性的因子。本領(lǐng)域已知許多破壞TGF- β信號(hào)通路的方式，其可與本發(fā)明結(jié)合使用。例如，TGF-β信號(hào)通路可由以下方式破壞:通過(guò)小干擾RNA策略抑制TGF-β表達(dá)；抑制弗林蛋白酶(furin，使TGF-β激活的蛋白酶)；通過(guò)生理學(xué)抑制劑抑制通路，如由Noggin、DAN或DAN-樣蛋白抑制BMP ;用單克隆抗體中和TGF-β 受體激酶1(又被稱(chēng)為激活素受體樣激酶^1^5)31^4、41^6、41^7或其他TGF-β相關(guān)的受體激酶的小分子抑制劑抑制；通過(guò)過(guò)表達(dá)其生理學(xué)抑制劑Smad7或通過(guò)利用硫氧還蛋白作為Smad錨著蛋白使Smad不能活化來(lái)抑制Smad2和Smad3信號(hào)通路(Fuchs, 0.1nhibition of TGF-Signaling for the Treatment of Tumor Metastasis andFibrotic Diseases.Current Signal Transduction Therapy, Volume6, NumberI, January2Oil, pp.29-43(15))。已知確定物質(zhì)是否是TGF-β抑制劑的多種方法，并且這些方法可與本發(fā)明結(jié)合使用。例如，細(xì)胞檢測(cè)可在用在包含驅(qū)動(dòng)熒光素酶報(bào)告基因的人PA1-1啟動(dòng)子或Smad結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中。相對(duì)于對(duì)照組的熒光素酶活性的抑制可用作化合物活性的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)(De Gouville et al., Br J Pharmacol.2005May; 145 (2): 166 - 177)
ο
根據(jù)本發(fā)明，TGF-β抑制劑可以是蛋白、肽、小分子、小干擾RNA、反義寡核苷酸、適體或抗體。抑制劑可以是天然存在的或合成的?？捎糜诒景l(fā)明中的優(yōu)選小分子TGF-β抑制劑的實(shí)例包括列于表I中的小分子抑制劑:表I靶向受體激酶的小分子TGF- β抑制劑
權(quán)利要求
1.獲得和/或培養(yǎng)肝臟碎塊或肝臟的類(lèi)器官的方法，其中所述方法包括: 在存在培養(yǎng)基的條件下，與細(xì)胞外基質(zhì)相接觸培養(yǎng)上皮干細(xì)胞和/或含有所述上皮干細(xì)胞的分離的組織碎塊，所述培養(yǎng)基包含添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基:作為促細(xì)胞分裂因子的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和FGF，所述FGF能夠結(jié)合FGFR2或FGFR4且優(yōu)選FGF10,煙酰胺，以及優(yōu)選地，Wnt激動(dòng)劑，優(yōu)選R-spondinl、R_spondin2、R_spondin3或R-spondin4。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述肝臟碎塊源自膽管。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述肝臟碎塊受到損傷，如機(jī)械損傷。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基本培養(yǎng)基是改進(jìn)型DMEM/F12。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將以下成分的一種或多種，優(yōu)選2種、3種、4種或全部添加到所述基本培養(yǎng)基中:BMP抑制劑、胃泌素、B27、N2和N-乙酰半胱氨酸。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中將以下成分全部添加到所述基本培養(yǎng)基中:EGF、BMP抑制劑、R-spondin和Wnt激動(dòng)劑。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述BMP抑制劑選自NoggiruDAN和DAN樣蛋白，所述DAN樣蛋白包括Cerberus和Gremlin ;和/或 所述Wnt激動(dòng)劑選自Wnt、Wnt-3a、Norrin和GSK-抑制劑中的一種或多種；和/或所述 R-spondin 選自 R-spondinl、R_spondin2、R_spondin3 和 R_spondin4。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中還將HGF添加到所述基本培養(yǎng)基中。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在培養(yǎng)至少一日之后，將培養(yǎng)基更換為不含BMP抑制劑或Wnt激動(dòng)劑的培養(yǎng)基。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述不含BMP抑制劑或Wnt激動(dòng)劑的培養(yǎng)基包含添加了以下成分的基本培養(yǎng)基:作為促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、FGF以及HGF，所述FGF能夠結(jié)合FGFR2或FGFR4且優(yōu)選FGF10，煙酰胺，以及R-spondinl、R_spondin2、R_spondin3、R_spondin4 中的任意一種。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中將EGF、R-spondinl、FGF10、HGF和煙酰胺全部添加到所述基本培養(yǎng)基中，或者任選地，添加R_spondin4替代R-spondinl。
12.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在培養(yǎng)至少兩周之后，將培養(yǎng)基更換為不含BMP抑制劑或Wnt激動(dòng)劑的培養(yǎng)基。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中第二培養(yǎng)基包含添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基:EGF，F(xiàn)GF和/或HGF，TGF- β抑制劑以及Notch抑制劑。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中將以下成分全部添加到所述基本培養(yǎng)基中:作為促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子的表皮生長(zhǎng)因子、FGF和HGF，所述FGF能夠結(jié)合FGFR2或FGFR4 ；Notch抑制劑以及TGF-β抑制劑。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述FGF是FGF10。
16.如權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述Notch抑制劑是Y-分泌酶抑制劑，任選DAPT或二苯并氮卓(DBZ)或苯二氮卓(BZ)或LY-411575。
17.如權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TGF-β抑制劑是蛋白、肽或小分子。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述TGF-β抑制劑是選自以下的小分子抑制劑:A83-01SB-431542、SB-505124, SB-525334, LY364947、SD-208、SJN2511。
19.如權(quán)利要求13至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中將以下成分的一種或多種，優(yōu)選2種、3種或全部添加到所述基本培養(yǎng)基中胃泌素、B27、N2和N-乙酰半胱氨酸。
20.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括 在以下細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述上皮干細(xì)胞和/或所述分離的組織碎塊，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基或由添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基組成EGF，BMP抑制劑，R-spondin以及Wnt ；以及 隨后在以下細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述上皮干細(xì)胞和/或所述分離的組織碎塊，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基或由添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基組成作為促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子的表皮生長(zhǎng)因子、FGF和HGF，所述FGF能夠結(jié)合FGFR2或FGFR4且優(yōu)選FGF10，煙酰胺，以及優(yōu)選地，Wnt激動(dòng)劑，優(yōu)選R-spondinl或 R_spondin4 ；以及 隨后在以下細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述上皮干細(xì)胞和/或所述分離的組織碎塊，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基或由添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基組成EGF，F(xiàn)GF和/或HGF，TGF- β抑制劑以及Notch抑制劑。
21.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述肝臟的類(lèi)器官源自一個(gè)表達(dá)Lgr5的單細(xì)胞。
22.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其不含飼養(yǎng)細(xì)胞。
23.成體肝臟干細(xì)胞群，其通過(guò)以顯著水平天然表達(dá)標(biāo)志物L(fēng)gr5、HnfIa和Hnf4中的一種或多種來(lái)表征。
24.如權(quán)利要求23所述的成體肝臟干細(xì)胞群，其中所述成體肝臟干細(xì)胞是人成體肝臟干細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求23或24所述的成體肝臟干細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群通過(guò)權(quán)利要求I至21中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
26.肝臟的類(lèi)器官，其包含權(quán)利要求23、24或25所述的至少一種細(xì)胞類(lèi)型。
27.如權(quán)利要求26所述的肝臟的類(lèi)器官，其還包含至少一種肝細(xì)胞和至少一種膽管上皮細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求26或27所述的肝臟的類(lèi)器官，其表達(dá)以下標(biāo)志物中的至少一種肝細(xì)胞標(biāo)志物，如白蛋白、B-I整合素、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白和谷氨酰胺合成酶；和/或至少一種膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物，如角蛋白7和19。
29.如權(quán)利要求26至28中任一項(xiàng)所述的肝臟的類(lèi)器官，其包含至少I(mǎi)xlO3細(xì)胞至5xl04細(xì)胞的群，例如至少I(mǎi)xlO3細(xì)胞至5xl03細(xì)胞的群。
30.如權(quán)利要求26至29中任一項(xiàng)所述的肝臟的類(lèi)器官，其包含囊狀結(jié)構(gòu)，以及在其外部的具有至少一個(gè)芽和中央腔的細(xì)胞層。
31.如權(quán)利要求26至30中任一項(xiàng)所述的肝臟的類(lèi)器官，其具有以下特征中的一種或多種(例如2種、3種、4種或全部5種)(a)具有的細(xì)胞密度>5 X IO5細(xì)胞/cm3，優(yōu)選>10 X IO5細(xì)胞/cm3;(b)具有相當(dāng)于2-30層細(xì)胞的厚度，優(yōu)選相當(dāng)于2-15層細(xì)胞的厚度；(c)細(xì)胞在三維空間相互接觸；(d)顯示健康肝臟組織固有的功能，(e)具有細(xì)長(zhǎng)的形狀，具有兩個(gè)限定的區(qū)。
32.如權(quán)利要求23至31中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群或類(lèi)器官，其能夠分泌白蛋白。
33.如權(quán)利要求23至32中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群或類(lèi)器官，其分泌尿素。
34.如權(quán)利要求23至33中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群或類(lèi)器官，其顯示明顯的糖原累積。
35.如權(quán)利要求23至34中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群或類(lèi)器官，其具有可誘導(dǎo)的細(xì)胞色素P450活性。
36.如權(quán)利要求23至35中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群或類(lèi)器官，其中所述細(xì)胞在形態(tài)上呈現(xiàn)肝細(xì)胞樣。
37.如權(quán)利要求23至36中任一項(xiàng)所述的肝臟的類(lèi)器官，其中所述肝臟的類(lèi)器官與細(xì)胞外基質(zhì)相接觸。
38.如權(quán)利要求23至37中任一項(xiàng)所述的肝臟的類(lèi)器官，其可以被培養(yǎng)至少I(mǎi)個(gè)月，至少2個(gè)月，至少3個(gè)月，至少4個(gè)月，至少5個(gè)月，至少6個(gè)月，至少7個(gè)月，至少8個(gè)月，至少10個(gè)月，至少15個(gè)月，至少20個(gè)月，至少24個(gè)月或更久。
39.如權(quán)利要求23至38中任一項(xiàng)所述的人肝細(xì)胞群或人肝臟的類(lèi)器官，其表達(dá)以下干細(xì)胞標(biāo)簽基因中的至少一種，優(yōu)選全部LGR4、TACSTDl/Epcam、CD44、SOX9、SP5、CD24、PROMl、CDCA7 和 ELF3。
40.如權(quán)利要求23至39中任一項(xiàng)所述的人肝細(xì)胞群或人肝臟的類(lèi)器官，其表達(dá)以下重編程基因中的至少一種，優(yōu)選全部KLF4、MYC、P0U5F1和S0X2。
41.如權(quán)利要求23至40中任一項(xiàng)所述的人肝細(xì)胞群或人肝臟的類(lèi)器官，其表達(dá)以下肝細(xì)胞/膽管上皮細(xì)胞特異性基因中的至少一種，優(yōu)選全部HNF1A、HNF1B、HNF4A、HHEX,0NECUT1、0NECUT2、PROXl、CDH1、F0XA2、GATA6、FOXMl、CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPG, GLUL,KRT7、KRT19 和 MET。
42.如權(quán)利要求23至41中任一項(xiàng)所述的人肝細(xì)胞群或人肝臟的類(lèi)器官，其不表達(dá)以下肝細(xì)胞/膽管上皮細(xì)胞特異性基因中的至少一種，優(yōu)選全部NEUR0G2、IGFlR和⑶34、AFP、GCG 和 PTF1A，例如其不表達(dá) NEUR0G2、IGFlR 和 CD34。
43.如權(quán)利要求23至42中任一項(xiàng)所述的人肝細(xì)胞群或人肝臟的類(lèi)器官，其表達(dá)以下肝細(xì)胞特異性基因中的至少一種，優(yōu)選全部TTR、ALB、FAH、TAT、CYP3A7、APOAU HMGCSUPPARG, CYP2B6、CYP2C18、CYP2C9、CYP2J2、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4F8、CYP4V2 和SCARBl。
44.權(quán)利要求23至43中任一項(xiàng)所述的肝臟的類(lèi)器官在藥物發(fā)現(xiàn)篩選、毒性測(cè)定或再生醫(yī)學(xué)中的用途。
45.細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基 作為促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子的表皮生長(zhǎng)因子、FGF和HGF，所述FGF能夠結(jié)合FGFR2或FGFR4 且優(yōu)選 FGFlO， 胃泌素，煙酰胺，B27, N2和N-乙酰半胱氨酸；以及優(yōu)選地， BMP抑制劑；和 fct激動(dòng)劑。
46.細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基作為促細(xì)胞分裂生長(zhǎng)因子的表皮生長(zhǎng)因子和FGF，所述FGF能夠結(jié)合FGFR2或FGFR4且優(yōu)選FGF10，煙酰胺，以及優(yōu)選地，Wnt激動(dòng)劑,優(yōu)選R-spondinl和/或Wnt_3a。
47.如權(quán)利要求46所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含HGF。
48.細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基或由添加了以下成分的動(dòng)物或人細(xì)胞的基本培養(yǎng)基組成EGF、FGF和/或HGF、TGF-i3抑制劑以及Notch抑制劑。
49.權(quán)利要求45至48中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基用于在細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)上皮干細(xì)胞或分離的組織碎塊的用途。
50.如權(quán)利要求49所述的用途，其用于獲得和/或培養(yǎng)肝臟碎塊或肝臟的類(lèi)器官。
51.用于再生肝臟或用于獲得表達(dá)Lgr5的細(xì)胞的方法，其包括刺激肝臟中的Wnt信號(hào)通路。
52.權(quán)利要求23至43中任一項(xiàng)所述的肝臟的類(lèi)器官或細(xì)胞群用于治療肝臟失調(diào)、病癥或疾病的用途。
53.治療肝臟失調(diào)、病癥或疾病的方法，其包括將權(quán)利要求23至43中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群或肝臟的類(lèi)器官給予有需要的患者。
全文摘要
本發(fā)明涉及肝臟的類(lèi)器官、其用途以及獲得它們的方法。
文檔編號(hào)C12N5/074GK103237888SQ201180044709
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者梅里特克賽爾·胡克奧爾特加, 約翰尼斯·卡洛魯斯·克萊威爾斯 申請(qǐng)人:荷蘭皇家科學(xué)院