用于制備視網(wǎng)膜組織和視網(wǎng)膜相關(guān)細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制備視網(wǎng)膜組織和視網(wǎng)膜相關(guān)細胞如視網(wǎng)膜先祖細胞和視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞等的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]作為由多能干細胞制備三維視網(wǎng)膜組織的方法，被證明的是通過在無血清培養(yǎng)基中形成均質(zhì)的多能干細胞的團聚體，將其在基底膜制劑存在下進行懸浮培養(yǎng)，并且在器官培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)來獲得多層視網(wǎng)膜組織的方法(非專利文獻I和專利文獻I )，以及通過在含有抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中形成均質(zhì)的多能干細胞的團聚體，將其在基底膜制劑存在下進行懸浮培養(yǎng)，并且在含血清培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)來獲得多層視網(wǎng)膜組織的方法(非專利文獻2和專利文獻2)。
[0003][文獻列表]
[0004]專利文獻
[0005]專利文獻1:W0 2011/055855
[0006]專利文獻2:WO2013/077425
[0007]非專利文獻
[0008]非專利文獻1:恥忉代，472，51-56(2011)
[0009]非專利文獻2:CellStem Cell ,10(6) ,771-785(2012)
[0010]發(fā)明概述
[0011]發(fā)明要解決的問題
[0012]需要開發(fā)由多能干細胞制備視網(wǎng)膜組織的方法。
[0013]解決問題的手段
[0014]本發(fā)明提供由多能干細胞制備視網(wǎng)膜組織和視網(wǎng)膜相關(guān)細胞如視網(wǎng)膜先祖細胞和視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞等的方法。
[0015]因此，本發(fā)明提供:
[0016][ I ]用于制備視網(wǎng)膜先祖細胞的方法，所述方法包括
[0017](I)第一步，在無血清培養(yǎng)基中對多能干細胞進行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細胞的團聚體，和
[0018](2)第二步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(I)中形成的團聚體進行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，由此獲得含視網(wǎng)膜先祖細胞的團聚體(下文中有時被稱為本發(fā)明的制備方法I);
[0019][2]用于制備視網(wǎng)膜組織的方法，所述方法包括
[0020](I)第一步，在無血清培養(yǎng)基中對多能干細胞進行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細胞的團聚體，
[0021](2)第二步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(I)中形成的團聚體進行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，由此獲得含視網(wǎng)膜先祖細胞的團聚體，和
[0022](3)第三步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(2)中形成的團聚體進行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種，由此獲得含有視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團聚體(下文中有時被稱為本發(fā)明的制備方法2)；
[0023][3]用于制備視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞的方法，所述方法包括
[0024](I)第一步，在無血清培養(yǎng)基中對多能干細胞進行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細胞的團聚體，
[0025](2)第二步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(I)中形成的團聚體進行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，由此獲得含視網(wǎng)膜先祖細胞的團聚體，和
[0026](3)第三步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(2)中形成的團聚體進行懸浮培養(yǎng)直至目標(biāo)視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞出現(xiàn)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種，由此獲得含有含目標(biāo)視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞的視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團聚體(下文中有時被稱為本發(fā)明的制備方法3)；
[0027][4]前述[I]至[3]中任一項的方法，其中所述多能干細胞是靈長類動物多能干細胞；
[0028][5]前述[I]至[4]中任一項所述的方法，其中所述多能干細胞是人多能干細胞；
[0029][6]前述[I]至[5]中任一項所述的方法，其中所述步驟(I)和步驟(2)在血清代替物存在下進行；
[0030][7]前述[I]至[6]中任一項所述的方法，其中所述懸浮培養(yǎng)在不存在基底膜制劑的情況下進行；
[0031][8]前述[I]至[7]中任一項所述的方法，其中所述作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)是一個或多個選自由以下各項組成的組的蛋白質(zhì):BMP2、BMP4、BMP7和⑶F7;
[0032][9]前述[I]至[8]中任一項所述的方法，其中所述作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)在自步驟(I)中的懸浮培養(yǎng)開始起的第I天至第15天之間被添加到所述培養(yǎng)基；
[0033][10]用于評估毒性或藥物效力的試劑，所述試劑包含視網(wǎng)膜先祖細胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞，所述細胞或組織是通過前述[I]至[9]中任一項所述的方法制備的；
[0034][11]評估測試物質(zhì)的毒性或藥物效力的方法，所述方法包括將視網(wǎng)膜先祖細胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞與所述測試物質(zhì)接觸，并且檢測所述物質(zhì)對所述細胞或組織的影響，所述細胞或組織是通過前述[I ]至[9]中任一項所述的方法制備的；
[0035][12]用于由視網(wǎng)膜組織的紊亂所致的疾病的治療劑，所述治療劑包含視網(wǎng)膜先祖細胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞，所述細胞或組織是通過前述[I]至[9]中任一項所述的方法制備的；
[0036][13]治療由視網(wǎng)膜組織的紊亂所致的疾病的方法，所述方法包括移植有效量的視網(wǎng)膜先祖細胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞至需要所述移植的受試者，所述細胞或組織是通過前述[I]至[9]中任一項所述的方法制備的；
[0037][14]視網(wǎng)膜先祖細胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞，其用于治療由視網(wǎng)膜組織的紊亂所致的疾病，所述細胞或組織是通過前述[I]至[9]中任一項所述的方法制備的；
[0038]等等。
[0039]發(fā)明效果
[0040]根據(jù)本發(fā)明的制備方法，可以高效制備視網(wǎng)膜先祖細胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞。在本發(fā)明的制備方法中，因為視網(wǎng)膜先祖細胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞可以通過在不向培養(yǎng)基添加基底膜制劑的情況下(即，在不存在基底膜制劑的情況下)對團聚體進行懸浮培養(yǎng)來獲得，獲得的細胞或組織被來源于異源物種的組分污染的風(fēng)險降低。根據(jù)本發(fā)明的制備方法，可以有效提供視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜相關(guān)細胞如視網(wǎng)膜先祖細胞和視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞以用于化學(xué)物質(zhì)等的毒性或效力評估、移植治療等目的。
[0041 ] 附圖簡述
[0042]圖1顯示在不向培養(yǎng)基添加作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的情況下，來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第18天的光場圖像(A)和熒光圖像(B)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有100ng/ml的BMP2的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第18天的光場圖像(C)和熒光圖像(D)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第18天的光場圖像(E)和熒光圖像(F)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有100ng/ml的BMP7的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第18天的光場圖像(G)和熒光圖像(H)，以及在開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有100ng/ml的⑶F7的培養(yǎng)基中的、來源于dRAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第18天的光場圖像(I)和熒光圖像(J)。
[0043]圖2顯示在不向培養(yǎng)基添加作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的情況下，來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第26天的光場圖像(A)、熒光圖像(B)和FACS柱狀圖(C)，在開始懸浮培養(yǎng)的同時(第O天)補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第26天的光場圖像(D)和熒光圖像(E)和FACS柱狀圖(F)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第I天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第26天的光場圖像(G)、熒光圖像(H)和FACS柱狀圖(I)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第2天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第26天的光場圖像(J)、熒光圖像(K)和FACS柱狀圖(L)，以及在開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第26天的光場圖像(M)、熒光圖像(N)和FACS柱狀圖(O)。
[0044]圖3顯示在不向培養(yǎng)基添加作用于BMP4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的情況下，來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第24天的光場圖像(A)和熒光圖像(B)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第6天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第24天的光場圖像(C)和熒光圖像(D)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第9天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第24天的光場圖像(E)和熒光圖像(F)，在開始懸浮培養(yǎng)起的第12天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第24天的光場圖像(G)和熒光圖像(H)，以及在開始懸浮培養(yǎng)起的第15天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中的、來源于dRAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體在開始懸浮培養(yǎng)起的第24天的光場圖像(I)和熒光圖像(J)。
[0045]圖4顯示在于開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)直至懸浮培養(yǎng)開始起的第26天的來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體的冷凍切片的GFP熒光圖像(A)、使用抗-ChxlO抗體的熒光免疫染色圖像(B)和Hoechst染色圖像
(C)。
[0046]圖5顯示在于開始懸浮培養(yǎng)起的第3天補充有1.5nM的BMP4的培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)直至懸浮培養(yǎng)開始起的第117天的來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體的冷凍切片的使用抗-恢復(fù)蛋白(Recoverin)抗體的免疫染色圖像(A)、使用抗-NrI抗體的免疫染色圖像(B)、使用抗-RXR-γ抗體的免疫染色圖像(C)、使用抗-ChxlO抗體的免疫染色圖像
(D)、使用抗-鈣視網(wǎng)膜蛋白(Calretinin)抗體的免疫染色圖像(E)和使用抗-鈣結(jié)合蛋白(Calbindin)抗體的免疫染色圖像(F)。
[0047]圖6顯示在于開始懸浮培養(yǎng)起的第6天補充有1.5ηΜ的ΒΜΡ4的培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)直至懸浮培養(yǎng)開始起的第50天的來源于RAX::GFP敲入的人胚胎干細胞的團聚體的冷凍切片的使用抗-ChxlO抗體的免疫染色圖像(A)、使用抗-Pax6抗體的免疫染色圖像(B)、使用抗-Crx抗體的免疫染色圖像(C)和使用抗-Brn3b抗體的免疫染色圖像(D)。
[0048]實施方案描述
[0049]以下詳細說明用于實施本發(fā)明的方案。
[0050]本發(fā)明中的“載體”表示能夠?qū)⑺璧亩嗪塑账嵝蛄修D(zhuǎn)移到目標(biāo)細胞中的載體。此種載體的實例包括能夠在宿主細胞如原核細胞，酵母，動物細胞，植物細胞，昆蟲細胞，動物個體和植物個體中自發(fā)復(fù)制的載體，能夠被整合到宿主細胞的染色體中的載體，在適于多核苷酸轉(zhuǎn)錄的位置處含有啟動子的載體等。
[0051]在這些載體中，適于克隆的載體有時被稱為“克隆載體”。克隆載體的實例包括通常具有包含多個限制酶位點的多個克隆位點的載體。例如，可以提及的是SambrookJ和Russell^D-WjauMolecular Cloning(第3版)，，，Appendix 3(Volume 3) ,Vectors andBacterial strains.A3.2(Cold Spring Harbor USA，2