ibronectin))進(jìn)行涂覆處理后的培養(yǎng)容器。粘附培養(yǎng)的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度，CO2濃度和
O2濃度可以適當(dāng)?shù)卮_定。在此情況中，培養(yǎng)可以在存在已知的分化誘導(dǎo)物質(zhì)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的情況下進(jìn)行。分化誘導(dǎo)物質(zhì)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的實(shí)例包括N G F(B1chem.B1phys.Res.Commun.，199，552(1994))，視黃酸(Dev.B1l.，168，342(1995)；J.Neurosc1.,16,1056(1996))，BMP抑制因子(Nature，376，333-336( 1995))，IGF(Genes&Development，15，3023-8(2003))，BDNF，NT3，NT4等。
[0148]制備的視網(wǎng)膜組織和視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞可以使用細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)是否存在等作為指示，或在需要時(shí)將其組合來確認(rèn)。獲得的視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞也可以通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)來確定。所需的特定細(xì)胞也可以基于所述標(biāo)記物表達(dá)模式和細(xì)胞形態(tài)學(xué)來分離。
[0149]通過本發(fā)明的制備方法1-3獲得的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞也可以用于篩選用于由視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞的紊亂所致的疾病的治療藥物，或用于細(xì)胞處理的移植材料，用于疾病研究的材料或用于由其他病因?qū)W所致的細(xì)胞損傷的治療藥物用藥物發(fā)現(xiàn)材料。此外，其可以用于化學(xué)物質(zhì)等的毒性和藥物效力評(píng)估中的毒性如光毒性等的研究、測(cè)試等。
[0150]由視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞的紊亂所致的疾病的實(shí)例包括有機(jī)汞中毒，氯喹視網(wǎng)膜病(chloroquine retinopathy)，色素性視網(wǎng)膜炎(retinitis pigmentosa)，年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degenerat1n)，青光眼(glaucoma)，糖尿病視網(wǎng)膜病(diabetic retinopathy)，新生兒視網(wǎng)膜病(neonatal retinopathy)等。
[0151]通過本發(fā)明的制備方法1-3制備的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞可以用作移植用視網(wǎng)膜，其用于補(bǔ)充受損的細(xì)胞或處于細(xì)胞損傷狀態(tài)的紊亂的組織本身(例如，用于移植手術(shù))等。
實(shí)施例
[0152]以下通過參考實(shí)施例來更詳細(xì)地說明本發(fā)明，實(shí)施例不被視為是限制性的。
[0153]實(shí)施例1:含視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體的制備實(shí)施例
[0154]將RAX::GFP敲入的人ES細(xì)胞(KhES-1來源的；Cell Stem Cell，2012，10(6)771-785)根據(jù) “Ueno，M.等PNAS 2006，103(25)，9554-9559” 和 “Watanabe，K.等Nat B1tech2007，25，681-686”中所述的方法培養(yǎng)。作為培養(yǎng)基，使用通過向DMEM/F 12培養(yǎng)基(Sigma)添加20%KSR(Knockout? Serum Replacement ； Invitrogen) ,0.1mM 2-疏基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，Ix非必需氨基酸，5ng/ml bFGF獲得的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)的ES細(xì)胞通過使用TrypLEExpress (Invitrogen)分散成單細(xì)胞，并且將單分散的ES細(xì)胞以非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板(sumi1n球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，Ltd.)的每一個(gè)孔I.2 X 14個(gè)細(xì)胞懸浮在 100μ1的無血清培養(yǎng)基中并且在37°C，5%C02進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。作為用于其的無血清培養(yǎng)基，使用通過向F-12培養(yǎng)基和頂DM培養(yǎng)基的1:1混合物添加10%1?1?，45(^1 1_—硫代甘油，Ix化學(xué)上明確的脂質(zhì)濃縮物，20μΜ Υ27632獲得的無血清培養(yǎng)基。在自懸浮培養(yǎng)開始起的第3天，添加人重組ΒΜΡ4 (R&D)(終濃度1.5nM)，ΒΜΡ2 (R&D)(終濃度100ng/ml)，ΒΜΡ7 (R&D)(終濃度10ng/ml)和GDF7(R&D)(終濃度100ng/ml)中任一并且進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。還在不添加任何作用于BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的條件下進(jìn)行類似的培養(yǎng)。用上述沒有補(bǔ)充任何作用于BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基替換孔中一半量的培養(yǎng)基，每3天一次。在自懸浮培養(yǎng)開始起的第18天，進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。當(dāng)在不添加作用于BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的條件下培養(yǎng)時(shí)，幾乎觀察不到指示視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的誘導(dǎo)的表達(dá)GFP的細(xì)胞(圖1A，B)。形成對(duì)比的是，在包括添加BMP2(圖1C，D)，BMP4(圖1E，F(xiàn))，BMP7(圖1G，H)和⑶F7(圖1I，J)中任一的培養(yǎng)條件下，表達(dá)GFP的細(xì)胞明顯增加。
[0155]實(shí)施例2:視網(wǎng)膜組織的制備實(shí)施例-1
[0156]將RAX::GFP敲入的人ES細(xì)胞(KhES-1來源的；Cell Stem Cell，2012，10(6)771-785)根據(jù) “Ueno，M.等PNAS 2006，103(25)，9554-9559” 和 “Watanabe，K.等Nat B1tech2007，25，681-686”中所述的方法培養(yǎng)。作為培養(yǎng)基，使用通過向DMEM/F12培養(yǎng)基(Sigma)添加20%KSR(Knockout? Serum Replacement ； Invitrogen) ,0.1mM 2-疏基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，Ix非必需氨基酸，5ng/ml bFGF獲得的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)的ES細(xì)胞通過使用TrypLEExpress (Invitrogen)分散成單細(xì)胞，并且將單分散的ES細(xì)胞以非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板(sumi1n球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，Ltd.)的每一個(gè)孔I.2 X 14個(gè)細(xì)胞懸浮在 100μ1的無血清培養(yǎng)基中并且在37°C，5%C02進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。作為用于其的無血清培養(yǎng)基，使用通過向F-12培養(yǎng)基和頂DM培養(yǎng)基的1:1混合物添加10%1?1?，45(^1 1_—硫代甘油，Ix化學(xué)上明確的脂質(zhì)濃縮物，20μΜ Υ27632獲得的無血清培養(yǎng)基。在自懸浮培養(yǎng)開始的同時(shí)起的任何時(shí)間點(diǎn)，自懸浮培養(yǎng)開始起的第I天，自懸浮培養(yǎng)開始起的第2天和自懸浮培養(yǎng)開始起的第3天，添加人重組BMP4(R&D)(終濃度1.5ηΜ)，并且進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。還在不添加作用于BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的條件下進(jìn)行類似的培養(yǎng)。用上述沒有補(bǔ)充作用于BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基替換孔中一半量的培養(yǎng)基，每3天一次。在自懸浮培養(yǎng)開始起的第18天，將團(tuán)聚體從96孔板轉(zhuǎn)移到懸浮培養(yǎng)皿，并且在通過向F-12培養(yǎng)基和頂DM培養(yǎng)基的1:1混合物添加10%KSR,450yM 1-一硫代甘油，Ix化學(xué)上明確的脂質(zhì)濃縮物獲得的無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。在自懸浮培養(yǎng)開始起的第26天，進(jìn)行熒光顯微鏡觀察和通過FACS的GFP陽性細(xì)胞的測(cè)量。
[0157]在不添加作用于BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的條件下(圖2A，B，C)以及在在開始懸浮培養(yǎng)的同時(shí)不添加BMP4的條件下(圖2D，E，F(xiàn))沒有發(fā)現(xiàn)指示視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的誘導(dǎo)的表達(dá)GFP的細(xì)胞。形成對(duì)比的是，在自懸浮培養(yǎng)開始起的第I天(圖2G，H，I)，自懸浮培養(yǎng)開始起的第2天(圖2 J，K，L)和自懸浮培養(yǎng)開始起的第3天(圖2M，N，O)的任何時(shí)間點(diǎn)不添加BMP4的條件下，表達(dá)GFP的細(xì)胞明顯增加。在所有條件中，在形成的RAX::GFP陽性組織的外部沒有觀察到RAX::GFP陰性組織。根據(jù)通過FACS的測(cè)量結(jié)果，在于開始懸浮培養(yǎng)起的第3天添加BMP4的條件下，不少于85%的細(xì)胞是GFP陽性的(圖20)。以上結(jié)果揭示，在自開始懸浮培養(yǎng)起的第I天以后(優(yōu)選在第3天)添加作用于BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)對(duì)于制備含有視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團(tuán)聚體是有效的。
[0158]實(shí)施例3:視網(wǎng)膜組織的制備實(shí)施例-2
[0159]將RAX::GFP敲入的人ES細(xì)胞(KhES-1來源的；Cell Stem Cell，2012，10(6)771-785)根據(jù) “Ueno，M.等PNAS 2006，103(25)，9554-9559” 和 “Watanabe，K.等Nat B1tech2007，25，681-686”中所述的方法培養(yǎng)。作為培養(yǎng)基，使用通過向DMEM/F 12培養(yǎng)基(Sigma)添加20%KSR(Knockout?血清代替物；Invitrogen)，0.ImM 2-巰基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，Ix非必需氨基酸，5ng/ml bFGF獲得的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)的ES細(xì)胞通過使用TrypLE Express(Invitrogen)分散成單細(xì)胞，并且將單分散的ES細(xì)胞以非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板(sumi 1n球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，Ltd.)的每一個(gè)孔1.2 X 14個(gè)細(xì)胞懸浮在100μ1的無血清培養(yǎng)基中，并且在37°C，5%C02進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。作為用于其的無血清培養(yǎng)基，使用通過向F-12培養(yǎng)基和頂DM培養(yǎng)基的1:1混合物添加10% KSR，450μΜ I _—硫代甘油，Ix化學(xué)上明確的脂質(zhì)濃縮物，20μΜ Υ27632獲得的無血清培養(yǎng)基。在自開始懸浮培養(yǎng)起的第6天，自開始懸浮培養(yǎng)起的第9天，自開始懸浮培養(yǎng)起的第12天和自開始懸浮培養(yǎng)起的第15天的任何時(shí)間點(diǎn)，添加人重組BMP4(R&D)(終濃度1.5nM)，并且進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。在不添加作用于BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的條件下進(jìn)行類似的培養(yǎng)。用上述沒有補(bǔ)充作用于BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基替換孔中一半量的培養(yǎng)基，每3天一次。在自懸浮培養(yǎng)開始起的第18天，將團(tuán)聚體從96孔板轉(zhuǎn)移到懸浮培養(yǎng)皿，并且在通過向F-12培養(yǎng)基和IMDM培養(yǎng)基的1:1混合物添加10%KSR，450yM 1-—硫代甘油，Ix化學(xué)上明確的脂質(zhì)濃縮物獲得的無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。在自懸浮培養(yǎng)開始起的第24天，進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。
[0160]結(jié)果，在不添加作用于BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的條件下，沒有發(fā)現(xiàn)指示視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的誘導(dǎo)的表達(dá)GFP的細(xì)胞(圖3A，B)。形成對(duì)比的是，在于自開始懸浮培養(yǎng)起的第6天(圖3C，D)，開始懸浮培養(yǎng)起的第9天(圖3E，F(xiàn))和開始懸浮培養(yǎng)起的第12天(圖3G，H)的任何時(shí)間點(diǎn)添加BMP4的條件下，表達(dá)GFP的細(xì)胞明顯增加。在于開始懸浮培養(yǎng)起的第15天添加BMP4的條件下，表達(dá)GFP的細(xì)胞被誘導(dǎo)但是效率低(圖31，J)。在所有條件中，在形成的RAX::GFP陽性組織的外部沒有觀察到RAX::GFP陰性組織。以上結(jié)果揭示在開始懸浮培養(yǎng)起的第15天或之前添加作用于BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)對(duì)于制備含有視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團(tuán)聚體是有效的。
[0161]實(shí)施例4:視網(wǎng)膜組織的制備實(shí)施例-3
[0162]在自懸浮培養(yǎng)開始起的第18天，將實(shí)施例1中獲得的含有表達(dá)GFP的細(xì)胞的團(tuán)聚體從96孔板轉(zhuǎn)移到懸浮培養(yǎng)皿中，并且在通過向F-12培養(yǎng)基和IMDM培養(yǎng)基的1:1混合物添加10%KSR,450yM 1-一硫代甘油，Ix化學(xué)上明確的脂質(zhì)濃縮物獲得的無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。在自懸浮培養(yǎng)開始起的第26天，用4%多聚甲醛溶液固定團(tuán)聚體，制備冷凍切片，并且通過免疫染色方法確認(rèn)組織結(jié)構(gòu)。
[0163]在自懸浮培養(yǎng)開始起的第26天，所有層都是RAX::GFP陽性的，而外層對(duì)于ChxlO是陽性的，其是視網(wǎng)膜干細(xì)胞標(biāo)記物(圖4A，B，C)。在RAX::GFP陽性的上皮的外部上不存在組織如非神經(jīng)外胚層。證明本發(fā)明的制備方法可以由人ES細(xì)胞高效制備視網(wǎng)膜組織。
[0164]實(shí)施例5:視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞的制備實(shí)施例
[0165]將RAX::GFP敲入的人ES細(xì)胞(KhES-1來源的；Cell Stem Cell，2012，10(6)771-785)根據(jù) “Ueno，M.等PNAS 2006，103(25)，9554-9559” 和 “Watanabe，K.等Nat B1tech2007，25，681-686”中所述的方法培養(yǎng)。作為培養(yǎng)基，使用通過向DMEM/F 12培養(yǎng)基(Sigma)添加20%KSR(Knockout?血清代替物；Invitrogen)，0.ImM 2-巰基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，Ix非必需氨基酸，5ng/ml bFGF獲得的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)的ES細(xì)胞通過使用TrypLE Express(Invitrogen)分散成單細(xì)胞，并且將單分散的ES細(xì)胞以非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板(sumi 1n球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，Ltd.)的每一個(gè)孔1.2 X 14個(gè)細(xì)胞懸浮在100μ1的無血清培養(yǎng)基中，并且在37°C，5%C02進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。作為用于其的無血清培養(yǎng)基，使用通過向F-12培養(yǎng)基和頂DM培養(yǎng)基的1:1混合物添加10% KSR，450μΜ I _—硫代甘油，Ix化學(xué)上明確的脂質(zhì)濃縮物，20μΜ Υ27632獲得的無血清培養(yǎng)基。在自