用于增殖病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開設(shè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、養(yǎng)魚業(yè)領(lǐng)域和出現(xiàn)在養(yǎng)殖魚密集群中的感染性疾病。具 體地，其設(shè)及增殖在娃科(Salmonidae)中導(dǎo)致疾病的病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是世界上發(fā)展最快的食品生產(chǎn)部分，且養(yǎng)魚業(yè)(魚養(yǎng)殖)將是滿足對(duì)于 動(dòng)物蛋白的增長(zhǎng)要求的主要貢獻(xiàn)者。然而，集約生產(chǎn)，包括飼養(yǎng)密集魚群，導(dǎo)致出現(xiàn)了幾種 新的傳染性疾病。
[0003] 于1999年首次檢出的屯、臟和骨骼肌炎癥化SMI，heart and skeletal muscle inf lammation)是養(yǎng)殖的大西洋娃(Salmosalar L.)中越來越重要的疾病。娃魚是娃科，條 福魚(ray-f inned f i sh)族，其是目前娃目分類中唯一存活的科。運(yùn)些也可W稱為娃科魚。 娃科包括娃魚（salmon)、縛魚（trout)、紅點(diǎn)娃魚（斑娃，chars)、淡水白娃（打eshwater whitefishes)和河縛（graylings)。（1)中討論了服MI。
[0004] 服MI往往發(fā)生在將魚轉(zhuǎn)移至海水之后的5-9個(gè)月，且由屯、外膜炎、屯、內(nèi)膜炎和屯、肌 炎、屯、肌壞死、紅骨骼肌的肌炎和壞死表征。累積死亡率可W達(dá)到20%，但是發(fā)病率更高，因 為受影響海域中的大多數(shù)魚表現(xiàn)出屯、臟中的組織病變。在大西洋娃中的其他疾病中也可W 看到屯、臟的病理變化，包括膜腺疾病(PD)和屯、肌病綜合癥(CMS)。（ 2)
[0005] 近年來發(fā)現(xiàn)HSMI與新型呼腸孤病毒（reovirus)、魚正呼腸孤病毒（PRV，piscine orthoreovirus)有關(guān)。使用高通量測(cè)序識(shí)別了病毒基因組，公開了PRV基因組。呼腸孤病毒 屬于呼腸孤病毒(Reoviridae)科且公知其感染胃腸系統(tǒng)和呼吸道。魚呼腸孤病毒屬于刺突 呼腸孤病毒(Spinareovirinae)亞科中現(xiàn)今分類的屬(3)。
[0006] 魚正呼腸孤病毒(PRV)具有斷開的雙鏈RNA基因組，屬于呼腸孤病毒科且是與正呼 腸孤病毒屬相關(guān)的唯一已知的魚病毒。其他已知的魚呼腸孤病毒分組在水生呼腸孤病毒 (Aquareovirus)屬中，但是系統(tǒng)進(jìn)化分析指示PRV屬于普通正呼腸孤病毒和水生呼腸孤病 毒屬的同根分支。PRV具有10個(gè)基因組片段，正呼腸孤病毒也是，但是同源蛋白質(zhì)之間的總 體氨基酸一致性非常低，特別是對(duì)于表面暴露的蛋白質(zhì)和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)尤其如此。然而，蛋 白質(zhì)功能中屯、的幾個(gè)氨基酸基序?qū)φ裟c孤病毒和PRV是保守的。與大多數(shù)的正呼腸孤病 毒不同，但與哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒(MRV)類似，PRV是非融合的（fusogenic)(4,5)DPRV普 遍分布于養(yǎng)殖的和野生的大西洋娃中，且屯、臟中高負(fù)荷的病毒是與HSMI發(fā)作一致的發(fā)現(xiàn)。 在挪威、加拿大和智利已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了養(yǎng)殖的大西洋娃中PRV的普遍存在，且在挪威的野生大西 洋娃和斑縛（brown houtKSalmo trutta L.)、和加拿大的野生大麻哈魚（Qium salmon) (Oncorhynchus ke化）、虹縛魚（O.mykiss)和割喉縛(O.clarkii)中也檢測(cè)到了該病毒。PRV 感染導(dǎo)致疾病的機(jī)制在很大程度上仍然是未知的。（6,7)。
[0007] Finstad等人(8)通過免疫組織化學(xué)(針對(duì)PRV表面蛋白〇1的抗體)示出PRV存在于 屯、肌細(xì)胞和血細(xì)胞中。血細(xì)胞中的存在看起來在屯、肌細(xì)胞中的病毒檢測(cè)之前。
[000引因此魚正呼腸孤病毒(PRV)是屯、臟和骨骼肌炎癥化SMI)的病原體。HSMI通過浸潤 單核CDS陽性細(xì)胞由屯、外膜炎、屯、內(nèi)膜炎和屯、肌炎W及紅骨骼肌中的屯、肌炎表征(9)。
[0009] PRV編碼外層纖維蛋白（outer-fiber proteinKol/oC)的同源蛋白，其存在于正 呼腸孤病毒屬中的大部分成員中。在MRV中，曰1蛋白起病毒血凝素和細(xì)胞粘附蛋白（cell attachment protein)的作用，且用于運(yùn)種結(jié)合的重要的氨基酸殘基在PRVol蛋白中是部分 保守的(4)。
[0010] 通常使用的魚細(xì)胞系中的PRV培養(yǎng)目前為止還沒有成功。通過RT-qPCR測(cè)得PRV的 負(fù)荷與原初和實(shí)驗(yàn)感染的娃魚兩者中的疾病發(fā)展相關(guān)。
[0011] 主要在魚在海水中的生長(zhǎng)階段期間觀察到HSMI，受影響海域發(fā)病率接近于100%， 而累積死亡率在可忽略值至20 %變化。受影響的魚中典型的大體病理變化（gross pathologic changes)包括循環(huán)障礙的跡象，包括蒼白屯、臟、腹水、肝黃、脾腫和血管周圍脂 肪的疲點(diǎn)（2)。目前基于屯、臟和紅骨骼肌中的組織病理發(fā)現(xiàn)診斷HSMI。通過RT-qPCR測(cè)得屯、 臟中的病毒負(fù)荷和通過免疫組織化學(xué)示出的屯、肌細(xì)胞中存在的病毒蛋白兩者都與組織屯、 臟病變的發(fā)展相關(guān)，并指示PRV在屯、臟組織中復(fù)制（8,9)。盡管屯、臟病變是HSMI診斷中的主 要焦點(diǎn)，但是已經(jīng)在脾臟和前腎化ead kidney)中檢測(cè)到PRV，其病毒負(fù)荷高于屯、臟的病毒 負(fù)荷，且已經(jīng)將源自患病魚的屯、臟、肝臟、腎臟/脾臟和血漿的接種物成功用于再現(xiàn)疾病 (1)。
[0012] 在娃魚的PRV挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)中，存在相對(duì)長(zhǎng)的溫育(培養(yǎng))期，即從注射6挑戰(zhàn)周(wpc)直 到觀察到屯、肌炎的首次跡象，W及在共居魚（同居魚，cohabitant fish)中出現(xiàn)病理變化之 前的另外4周?？雌饋硌装Y變化起始于屯、室外部部分，從屯、外膜延伸并具體沿著小血管結(jié)構(gòu) 到達(dá)致密層(9)。此外，在運(yùn)些早期階段觀察到輕度屯、內(nèi)膜炎。與內(nèi)部海綿層相反，屯、室的外 部致密部分高度血管化。有趣地，在來自實(shí)驗(yàn)PRV挑戰(zhàn)的魚的屯、臟剖面上使用免疫組織化 學(xué)，檢測(cè)到屯、臟病變之前病毒存在于血細(xì)胞中的明顯圖像。檢測(cè)的PRV陽性細(xì)胞包括紅細(xì)胞 和白細(xì)胞樣細(xì)胞兩者，但是可利用的物質(zhì)不適用于進(jìn)一步表征運(yùn)些細(xì)胞。（8)
[0013] 之前針對(duì)來自四次單獨(dú)的HSMI發(fā)作的現(xiàn)場(chǎng)物質(zhì)（field material)的研究通過電 子顯微術(shù)化M)在紅細(xì)胞中一致檢測(cè)到病毒樣顆粒(VLP)，且在前腎中的巨隧細(xì)胞中也描述 了類似的化P(l〇)。已經(jīng)在娃魚的許多物種的紅細(xì)胞中檢測(cè)到類似形態(tài)的化P，且在沒有特 定的病因通知的情況下將運(yùn)些發(fā)現(xiàn)統(tǒng)稱為紅細(xì)胞包涵體綜合征化IBS, Erythrocytic inclusions body syn化ome) (11)。沒有進(jìn)一步表征EIBS相關(guān)的化P包涵體，且沒有證明它 們是否表示一種或幾種病毒物種。因此，沒有驗(yàn)證PRV病毒血癥的存在。
[0014] W02011041790提供了魚呼腸孤病毒診斷組合物，然而呈現(xiàn)了用于重新得到病毒的 可替代來源且其中沒有示出該組合物的接種疫苗效應(yīng)的證據(jù)。
[0015] 因此，已經(jīng)證明了 PRV增殖非常困難，且運(yùn)對(duì)于針對(duì)病毒的疫苗發(fā)展W及對(duì)于生產(chǎn) 病毒抗原是強(qiáng)大的限制。此外，還尋找了用于病毒傳染性的測(cè)試系統(tǒng)，其之后將對(duì)診斷、消 毒等測(cè)試具有較大價(jià)值。
[0016] 因此，對(duì)于識(shí)別出一種增殖和得到PRVW及其他正呼腸孤病毒的能夠克服或緩解 本領(lǐng)域認(rèn)識(shí)到的問題的方式，存在需要。本領(lǐng)域進(jìn)一步需要識(shí)別重新得到能夠生產(chǎn)例如滅 活形式病毒的疫苗產(chǎn)品的更大量的正呼腸孤病毒，諸如PRV的方式，所述滅活形式的病毒可 W用于治療和/或預(yù)防疾病，諸如娃科，諸如娃魚中的疾病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 通過提供用于使用諸如有核魚紅細(xì)胞(nucleated piscine eirt虹o^te)的有核 紅細(xì)胞（即，具有細(xì)胞核的紅細(xì)胞）增殖和分離正呼腸孤病毒的體外方法（離體方法，ex vivo method),本公開已經(jīng)克服或至少緩解了現(xiàn)有技術(shù)中的問題。該方法包括在有核紅細(xì) 胞中體外增殖正呼腸孤病毒W(wǎng)及此后分離增殖的正呼腸孤病毒。正呼腸孤病毒具體是感染 魚的正呼腸孤病毒。正呼腸孤病毒具體還是屬于占據(jù)有核魚紅細(xì)胞的生態(tài)位（小生境， ecological niche)的復(fù)制譜系（replicating lineage)的正呼腸孤病毒，即在有核魚紅細(xì) 胞體內(nèi)感染和復(fù)制的正呼腸孤病毒。有核魚紅細(xì)胞可W是例如來自娃科，諸如娃魚、縛魚、 虹縛魚、紅點(diǎn)娃魚、淡水白娃和河縛，具體是娃魚的紅細(xì)胞。示例性的正呼腸孤病毒是魚呼 腸孤病毒（PRV)。另一種示例性的呼腸孤病毒是黑魚呼腸孤病毒（舌頭魚呼腸孤病毒， snakehead reovirus)(SKRV或T9231)(25)。
[0018] 用于增殖和分離正呼腸孤病毒的所述體外方法可W包括W下步驟:a)共培養(yǎng)基本 不含正呼腸孤病毒的有核魚紅細(xì)胞(諸如娃科紅細(xì)胞，例如來自娃魚的紅細(xì)胞)與被正呼腸 孤病毒感染的有核魚紅細(xì)胞(諸如娃科紅細(xì)胞，例如，來自娃魚的紅細(xì)胞)和/或包含正呼腸 孤病毒源的任何其他物質(zhì)W得到混合培養(yǎng)物;b)溫育步驟a)中得到的混合培養(yǎng)物，C)從步 驟b)的所述混合培養(yǎng)物中除去被正呼腸孤病毒感染的紅細(xì)胞，d)可選地重復(fù)步驟a)至C)的 操作，和e)從步驟C)的紅細(xì)胞中分離正呼腸孤病毒。如本文別處所提到的，正呼腸孤病毒可 W是感染魚的正呼腸孤病毒，諸如PRV。正呼腸孤病毒還可W是在有核紅細(xì)胞，諸如有核魚 紅細(xì)胞，諸如娃科紅細(xì)胞，諸如娃魚的紅細(xì)胞中復(fù)制的任何正呼腸孤病毒。
[0019] 在運(yùn)種方法中，步驟b)的溫育可W進(jìn)行約4天W上，諸如約4-45天，例如約14天W 上。進(jìn)一步地，可W將步驟a)至d)的操作重復(fù)至少2次，諸如約2-10次，但不限于此。
[0020] 本文所提到的娃科可W是娃魚、縛魚、虹縛魚、紅點(diǎn)娃魚、淡水白娃和河縛，具體是 娃魚。
[0021] 本文還公開了制備包含正呼腸孤病毒的疫苗組合物的體外方法，所述方法包括在 諸如有核魚紅細(xì)胞的有核紅細(xì)胞中體外增殖正呼腸孤病毒，W及此后分離增殖的正呼腸孤 病毒，隨后滅活分離的正呼腸孤病毒，W及此后制備包含所述滅活的正呼腸孤病毒的疫苗 組合物。本文件還設(shè)及通過本文所公開的用于增殖和分離正呼腸孤病毒的方法制備的疫苗 組合物。
[0022] 制備包含正呼腸孤病毒的疫苗組合物的運(yùn)種體外方法可W包括W下步驟:a)共培 養(yǎng)基本不含正呼腸孤病毒的有核紅細(xì)胞(諸如有核魚紅細(xì)胞，諸如娃科紅細(xì)胞，諸如來自娃 魚的紅細(xì)胞)與被正呼腸孤病毒感染的有核紅細(xì)胞(諸如有核魚紅細(xì)胞，諸如娃科紅細(xì)胞， 諸如來自娃魚的紅細(xì)胞)和/或包含正呼腸孤病毒源的任何其他物質(zhì)W得到混合培養(yǎng)物;b) 溫育步驟a)中得到的混合培養(yǎng)物，C)從步驟b)的所述混合培養(yǎng)物中除去被正呼腸孤病毒感 染的紅細(xì)胞，d)可選地重復(fù)步驟a)至C)的操作，和e)從步驟C)的紅細(xì)胞中分離正呼腸孤病 毒，隨后滅活步驟e)中得到的正呼腸孤病毒，W及此后制備包含所述滅活的正呼腸孤病毒 的組合物。如本文別處所提到的，正呼腸孤病毒可W是感染魚的正呼腸孤病毒，諸如PRV。正 呼腸孤病毒還可W是在有核紅細(xì)胞，諸如有核魚紅細(xì)胞，諸如娃科紅細(xì)胞，諸如娃魚的紅細(xì) 胞中復(fù)制的正呼腸孤病毒。當(dāng)正呼腸孤病毒是魚呼腸孤病毒(PRV)時(shí)，疫苗組合物可W用于 治療和/或預(yù)防屯、臟和骨骼肌炎癥化SMI)。
[0023] 本文進(jìn)一步提供了用于診斷娃科魚中屯、臟和骨骼肌炎癥化SMI)或PRV病毒存在的 體外方法，所述方法包括：
[0024] a)從生物血樣(生物血液樣品）中分離紅細(xì)胞，b)檢測(cè)由步驟a)得到的所述紅細(xì)胞 中魚呼腸孤病毒(PRV)的存在?？蒞通過RT-qPCR進(jìn)行運(yùn)種檢測(cè)。檢測(cè)紅細(xì)胞中魚呼腸孤病 毒的存在是屯、臟和骨骼肌炎癥化SMI)(或其可能發(fā)展）的指示。
[0025] 本文件還公開了有核紅細(xì)胞用于增殖正呼腸孤病毒的體外用途。所述正呼腸孤病 毒可W是感染魚的正呼腸孤病毒。所述正呼腸孤病毒還可W是在有核紅細(xì)胞中復(fù)制的正呼 腸孤病毒，諸如PRV。正呼腸孤病毒可W是魚呼腸孤病毒(PRV)。有核紅細(xì)胞可W是有核魚紅 細(xì)胞，諸如娃科紅細(xì)胞，諸如娃魚紅細(xì)胞或來自縛魚、紅點(diǎn)娃魚、淡水白娃或河縛的紅細(xì)胞。
【附圖說明】
[0026] 圖1.在挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)1中通過RT-qPCR檢測(cè)PRV。（ A)與屯、臟和骨骼肌(SM)相比，血液中 的平均Ct值和SDd(B)與脾臟和前腎化K)相比，血液中的平均Ct值和SDd(c)與從相同魚取樣 的每種組織(屯、臟、骨骼肌、脾臟、前腎)相比，在血液中檢測(cè)的PRV Ct值的配對(duì)分析。將結(jié)果 給出為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均Ct值差值。使用配對(duì)T測(cè)試分析數(shù)據(jù)</<0.05 ;^<0.01; < 0.001 林*;0.000!林料。
[0027] 圖2.(A)由血液、RBC和脾臟中的平均Ct值和SD給出挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)2中通過RT-qPCR的 PRV檢測(cè)。在右側(cè)單獨(dú)示出了來自血漿的PCR結(jié)果，因?yàn)閬碜圆缓獫{的細(xì)胞的RNA輸入不能 直接與分析的其他樣品物質(zhì)比較。（B)與來自相同魚的脾臟比較的在血液中檢測(cè)的PRV Ct 值的配對(duì)分析，給出為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均^值差值。使用配對(duì)1'測(cè)試分析數(shù)據(jù)。^<0.05;^< 0.01 ;<0.00!林*。
[0028] 圖3.在7Wpc的屯、臟屯、室內(nèi)的組織病理變化，包括屯、外膜炎（箭頭(arrowhead))和 致密層(compact皿layer)(箭狀標(biāo)記(arrow))的炎癥，與服MI診斷一致。
[0029] 圖4.通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)挑戰(zhàn)2的分離RBC中的PRV蛋白的檢測(cè)。(A)示出了用于細(xì)胞 內(nèi)染色的篩選策略（gating strategy)的密度曲線。FS，前向散射（forward scatter) ;SS， 側(cè)向散射(side scatter)。（B)代表背景巧光的針對(duì)細(xì)胞內(nèi)染色的Owpc的陰性對(duì)照。（C)來 自在5、7和8wpc的細(xì)胞內(nèi)染色的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。針對(duì)每個(gè)樣品計(jì)數(shù)50000個(gè)細(xì)胞。由于技 術(shù)性困難，將單獨(dú)的巧巧騰在外。(D)側(cè)向散射(SS)和來自在0、5、7和8wpc的巧光強(qiáng)度(PRV 曰1)的曲線圖。在巧日8wpc指示PRV陰性Π 、低陽性η和高陽性群。
[0030] 圖5.在紅細(xì)胞中巧光標(biāo)記PRVol蛋白。用艦化丙晚(propidium iodide)染色細(xì)胞 核。（A)通過免疫巧光（IF)顯微術(shù)檢測(cè)陽性RBC。標(biāo)記的細(xì)胞在伸長(zhǎng)的成熟RBC(箭狀標(biāo)記)至 類似于不成熟紅細(xì)胞(箭頭)的更球形細(xì)胞的形態(tài)上變化。（B)陰性細(xì)胞(a)和在細(xì)胞質(zhì)中包 含少量較小包涵體(b)的不同染色模式、散射的顆粒染色（C)和大細(xì)胞質(zhì)包涵體(d)的IF顯 微術(shù)。（C)示出細(xì)胞核周圍區(qū)域的病毒包涵體(a，b，c)和更散射染色模式(d)的共聚焦顯微 圖像。（D)通過階段對(duì)比（phase contrast) (a，d)，通過IF顯微術(shù)(b，e)檢測(cè)和通過圖像疊加 (c，f)共定位的細(xì)胞質(zhì)包涵體。
[0031] 圖6.透射電子顯微圖像。A)具有病毒包涵體(箭狀標(biāo)記）的紅細(xì)胞。B)包含呼腸孤 病毒樣顆粒的包涵體。C)具有完整的膜樣結(jié)構(gòu)的包涵體。D)具有部分完整的膜樣結(jié)構(gòu)或不 存在膜樣結(jié)構(gòu)的包涵體(箭頭）dE)具有病毒顆粒和層狀結(jié)構(gòu)的混合物的包涵體(箭頭）。
[0032] 圖7.通過流式細(xì)胞術(shù)表面檢測(cè)挑戰(zhàn)2的分離RBC中的PRV蛋白。(A)示出表面染色的 篩選策略的密度曲線圖。FS，前向散射；SS，側(cè)向散射。（B)代表背景巧光針對(duì)表面染色的 Owpc的陰性對(duì)照。（C)來自5、7和8wpc的表面染色的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。針對(duì)每個(gè)樣品計(jì)數(shù) 50000個(gè)細(xì)胞。由于技術(shù)性困難，將單獨(dú)的巧5排除在外。
[0033] 圖8示出引入來自被PRV感染的魚的病毒感染的紅細(xì)胞6天和13天后初始紅細(xì)胞（ .打姐veeryt虹ocytes)中病毒計(jì)數(shù)(RT-qPCR絕對(duì)定量）的平均增加。
[0034] 圖9通過體外感染PRV產(chǎn)生的由qPCR的病毒負(fù)荷。(A)在開始體外感染之前，篩選來 自于體內(nèi)感染的魚i 1和i2W及幼魚(原初的魚、未感染魚，na'ive fish)n 1的分離RBC的PRVo 1蛋白。在il和i2中指出了PRV低陽性(+)和高陽性(++)群。針對(duì)每個(gè)樣品計(jì)數(shù)50000個(gè)細(xì)胞。 (B) 在針對(duì)所有樣品(n = 6)給出的體外感染實(shí)驗(yàn)期間，通過qPCR檢測(cè)平均PRV計(jì)數(shù)(和SD)。 (C) 此外，計(jì)數(shù)平均PRV(和SD)并通過分離被il溶解物(n = 3)和i2溶解物(n = 3)感染的原初 RBC不出。使用威氏配對(duì)符號(hào)秩次檢驗(yàn)(Wilcoxon matched pairs signed rank test)分析 數(shù)據(jù)。^<0.05。
[0035] 圖10.體外感染實(shí)驗(yàn)期間RBC的免疫巧光顯微術(shù)。巧光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)期間體外感染的 RBC中的紅細(xì)胞中的PRVo 1蛋白。用艦化丙晚染色細(xì)胞核。在1 dpi (A)或6dpi沒有觀察到陽性 細(xì)胞。在12化i(B)和19化i(C)，作為在階段對(duì)比中還可見的細(xì)胞質(zhì)包涵體在幾個(gè)單個(gè)細(xì)胞 中觀察到大量的PRVol蛋白。注意到圓形細(xì)胞和PRV陽性細(xì)胞的細(xì)胞核。
[0036] 圖11.針對(duì)體外PRV感染的抗病毒反應(yīng)。針對(duì)抗病毒基因表達(dá)，在感染之前，W及在 引入PRV之后1、6、12和19天，通過RT-qPCR，分析被來自兩種不同PRV感染的魚i 1 - i 2的紅細(xì) 胞裂解物感染的Ξ條幼魚nl-n3的RBC?；谏扉L(zhǎng)因子化F)la參考基因的表達(dá)，歸一化水平。 將六個(gè)培養(yǎng)物中的每個(gè)相對(duì)于1dpi的平均倍數(shù)誘導(dǎo)示出為IF化(A)，Mx(B)和RIG-KC)。使 用威氏配對(duì)符號(hào)秩次檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。^<〇.05。
[0037] 圖12.表征RBC和從體內(nèi)PRV感染的RBC中分離的包涵體。用抗雙鏈RNA(dsRNA)、抗- PRV-ol染色從體內(nèi)感染的魚il和i2分離的培養(yǎng)的RBC，并通過共聚焦顯微術(shù)研究。用艦化丙 晚染色細(xì)胞核。（A)和(B)示出在培養(yǎng)物中1天后發(fā)現(xiàn)的典型PRVol蛋白和dsRNA陽性細(xì)胞； (C)強(qiáng)染色的細(xì)胞12化i，W及化)和巧)培養(yǎng)物中19天后發(fā)現(xiàn)的典型細(xì)胞。圖片示出了 W63X 放大的共聚焦顯微術(shù)的組合信號(hào)，比例尺= 1〇μπι。
[0038] 圖13.氯化頻哪氯醇(pinacyanol chloride)染色PRV感染的RBC。氯化頻哪氯醇染 色被PRV體內(nèi)感染的RBC，所述PRV是從受感染的魚i2中分離的并保持在培養(yǎng)物中。觀察到多 種大小和數(shù)目的細(xì)胞質(zhì)包涵體(A，B)。氯化頻哪氯醇染色被PRV體外感染的RBC(C-E)。感染 之前沒有在RBC中觀察到包涵體(C)。感染后12天，觀察到細(xì)胞質(zhì)包涵體(D)。感染后19天，檢 測(cè)到血影細(xì)胞(ghost cellKE)