ω3不飽和脂肪酸酶和二十碳五烯酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及具有ω 3不飽和化酶活性的新型多膚和編碼該多膚的基因、W及它們 在生成二十碳五締酸中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 高度不飽和脂肪酸是具有2個(gè)W上的不飽和鍵的脂肪酸，存在有ω6不飽和脂肪酸 的亞油酸（1^\、18:化-6)、丫-亞麻酸(61^\、18:化-6)、花生四締酸(41?4、20:411-6)、〇3不飽和 脂肪酸的α-亞麻酸^1^\、18:化-3)、二十碳五締酸化?4、20:511-3)、二十二碳六締酸(0^、 22:6η-3)等。高度不飽和脂肪酸除了作為生物體膜的主要構(gòu)成成分參與膜的流動(dòng)性調(diào)節(jié)W 夕h作為生物體功能性成分的前體也較為重要。ARA或ΕΡΑ在高等動(dòng)物體內(nèi)是前列腺素、血栓 燒、白Ξ締等的前體，而DHA是腦內(nèi)存在量最多的高度不飽和脂肪酸。EPA具有血小板凝集抑 制作用、血中中性脂肪降低作用、抗動(dòng)脈硬化作用、血液粘度降低作用、降血壓作用、抗炎作 用、抗腫瘤作用等生理作用，被用于藥品、食品、化妝品、飼料等各種領(lǐng)域。另外，近年來(lái)，從 預(yù)防生活習(xí)慣病的角度考慮，推薦積極攝取ω3不飽和脂肪酸，其是需求增加顯著的脂質(zhì)分 子種類。
[0003] 生物體的DHA或ΕΡΑ除了由食物攝取W外，在一部分生物中由ALA進(jìn)行生物合成。另 一方面，由于人無(wú)法生物合成ALA，所W畑A或EPA對(duì)人而言在營(yíng)養(yǎng)學(xué)上是必需氨基酸。EPA主 要大量包含于轄魚(yú)、緋魚(yú)、靖魚(yú)、娃魚(yú)、沙下魚(yú)、憐郵等的魚(yú)油、Shewanella livingstonensis等海洋性低溫細(xì)菌、Labyrinthulea綱（盤(pán)根足蟲(chóng)綱） 化abyrinthulomycetes)等的藻類等中。從運(yùn)些生物資源中提取或純化EPA的方法是已知 的。最通常進(jìn)行的是從魚(yú)油中純化EPA。但是，除了魚(yú)油中的EPA含量低W外，來(lái)自魚(yú)油的EPA 根據(jù)提取或純化方法還存在著殘留魚(yú)臭、或者被視為屯、臟病原因的芥酸的含量增加的問(wèn) 題。
[0004] 近年來(lái)，關(guān)系到能量問(wèn)題等，在細(xì)胞內(nèi)蓄積脂質(zhì)的產(chǎn)脂質(zhì)微生物受到關(guān)注，開(kāi)發(fā)了 W微生物學(xué)方式生產(chǎn)各種脂質(zhì)的方法。例如，正在研究利用了作為絲狀菌之一的屬于被抱 霉(Modierella)屬微生物的高度不飽和脂肪酸的生產(chǎn)方法。已知被抱霉屬微生物具有ω3 或ω6高度不飽和脂肪酸代謝途徑，并生產(chǎn)ΕΡΑ (非專利文獻(xiàn)1)。在專利文獻(xiàn)1中，公開(kāi)了培 養(yǎng)產(chǎn)生ΕΡΑ的被抱霉屬微生物而獲得ΕΡΑ的方法。在專利文獻(xiàn)2中，公開(kāi)了使用對(duì)高山被抱霉 (Modierella alpina)施行突變處理而獲得的突變株來(lái)生產(chǎn)ARA或ΕΡΑ的方法。在專利文獻(xiàn) 3中，公開(kāi)了使用將由高山被抱霉分離的ω 3不飽和化多膚的基因?qū)虢湍钢卸@得的轉(zhuǎn)化 株來(lái)生產(chǎn)ΕΡΑ等高度不飽和脂肪酸的方法。
[0005] 但是，被抱霉屬微生物的ω 3不飽和化酶的最適溫度低，在菌容易增殖的常溫條件 (2(TC程度)下無(wú)法充分地發(fā)揮作用。因此，即使在通常的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)被抱霉屬微生物， 也無(wú)法高效率地生產(chǎn)EPA。而且，被抱霉屬微生物的ω 3不飽和化酶優(yōu)先與碳鏈長(zhǎng)為18的脂 肪酸作用，所W在利用上述被抱霉屬微生物的現(xiàn)有方法中，難W高效率地生產(chǎn)碳鏈長(zhǎng)為20 的 ΕΡΑ。
[0006] 因此，尋求一種可W由碳鏈長(zhǎng)為20的脂肪酸(例如ARA)高效率地合成EPA的ω 3不 飽和化酶。專利文獻(xiàn)4中記載著由異枝水霉(Saprolegnia diclina)分離的ω3不飽和化酶， 專利文獻(xiàn)5中記載著由枝干疫霉(Phyto地thora ramorum)分離的Δ 17不飽和化酶，專利文 獻(xiàn)6中記載著由瓜果腐霉(Pythi皿aphanidermat皿)分離的Δ 17不飽和化酶。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)昭63-14697號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)平11-243981號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)2006-055104號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)4:日本特表2005-515776號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)5:日本特表2009-534032號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)6:日本特表2010-508019號(hào)公報(bào)； 非專利文獻(xiàn) 非專利文獻(xiàn)l:Appl. Microbiol. Biotecnol.，1989，32: 1-4。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引發(fā)明所要解決的課題 本發(fā)明設(shè)及提供:即使在20°c W上的常溫下也具有高的酶活性的ω 3不飽和化酶、W及 具有該ω 3不飽和化酶且可W高效率地生產(chǎn)W高濃度含有ΕΡΑ的油脂的產(chǎn)脂質(zhì)細(xì)胞。而且， 本發(fā)明還設(shè)及提供:利用了該產(chǎn)脂質(zhì)細(xì)胞的含有大量ΕΡΑ的油脂的工業(yè)生產(chǎn)方法。
[0009] 用于解決課題的手段 發(fā)明人進(jìn)行了各種研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了即使在常溫下也具有高的ω3不飽和化活性的 新型ω 3不飽和化酶、和編碼該酶的基因。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了 ：在導(dǎo)入有編碼上述ω 3不飽和 化酶的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，在常溫下ΕΡΑ或其他ω 3不飽和脂肪酸的產(chǎn)率提高。
[0010] 目Ρ，本發(fā)明提供多膚，所述多膚由與SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列有80%W上同源 的氨基酸序列構(gòu)成、并且具有ω 3不飽和化活性。
[0011] 本發(fā)明還提供編碼上述多膚的多核巧酸。
[0012] 本發(fā)明還提供包含上述多核巧酸的載體。
[0013] 本發(fā)明還提供導(dǎo)入有上述多核巧酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
[0014] 而且，本發(fā)明還提供含二十碳五締酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)方法，該方法包括:培養(yǎng)表達(dá)上 述多膚的細(xì)胞。
[0015] 而且，本發(fā)明還提供二十碳五締酸的生產(chǎn)方法，該方法包括:純化通過(guò)上述方法生 產(chǎn)的含二十碳五締酸的脂質(zhì)。
[0016] 發(fā)明效果 本發(fā)明的ω 3不飽和化酶在細(xì)胞容易增殖的2(TC W上的常溫條件下具有高的ω 3不飽 和化活性，可W在ΕΡΑ等ω 3不飽和脂肪酸的生物合成中發(fā)揮作用。因此，當(dāng)培養(yǎng)表達(dá)本發(fā)明 的ω 3不飽和化酶的細(xì)胞時(shí)，在該微生物內(nèi)可W高效率地生產(chǎn)ΕΡΑ等ω 3不飽和脂肪酸。ΕΡΑ 是在藥品、食品、化妝品、飼料等各個(gè)領(lǐng)域使用的重要的高度不飽和脂肪酸，能夠應(yīng)用于ΕΡΑ 的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的本發(fā)明在該領(lǐng)域中非常有用。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是Μ. alpina 1S-4中的脂肪酸生物合成路徑。
[001引圖2是M. alpina用轉(zhuǎn)化雙運(yùn)載體的例子。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 在本說(shuō)明書(shū)中，只要沒(méi)有另外定義，則關(guān)于氨基酸序列或核巧酸序列中的氨基酸 或核巧酸的缺失、取代、添加或插入所使用的"一個(gè)或多個(gè)"例如可W是1~20個(gè)、優(yōu)選1~10 個(gè)、更優(yōu)選1~5個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選1~4個(gè)、更加優(yōu)選1~3個(gè)、更進(jìn)一步優(yōu)選1~2個(gè)。另外，在本 說(shuō)明書(shū)中，氨基酸或核巧酸的"添加"包括在序列的一個(gè)末端和兩個(gè)末端添加 1個(gè)或多個(gè)氨 基酸或核巧酸。
[0020] 在本說(shuō)明書(shū)中，氨基酸序列或核巧酸序列的同源性可W利用Karl in和Altschul的 算法BLAST (Pro.化tl. Acad. Sci. USA, 1993，90: 5873-5877)、或FASTA (Methods Enzymol.，1990，183: 63-98)來(lái)決定。根據(jù)該算法BLAST,開(kāi)發(fā)了被稱作BLASTN或BLASTX 的程序(J. Mol. Biol., 1990，215: 403-410)。根據(jù)BLAST,通過(guò)BLASTN來(lái)分析核巧酸序 列時(shí)，參數(shù)例如是score = 100、wordlength= 12。另外，根據(jù)BLAST,通過(guò)BLASTX來(lái)分析氨基 酸序列時(shí)，參數(shù)例如是score = 50、wordlength = 3。使用BLAST和Ga卵ed BLAST程序時(shí)，使用 各程序的缺省參數(shù)。運(yùn)些分析方法的具體手法是公知的（參照WWW.ncbi .nlm.nih. gov)。
[0021] 在本說(shuō)明書(shū)中，"嚴(yán)格條件"是指同源性高的核巧酸序列彼此之間、例如具有909似 上、95%W上、98%W上或99%W上的同源性的核巧酸序列彼此之間雜交、而同源性較其低的 核巧酸序列彼此之間不雜交的條件。具體而言，本說(shuō)明書(shū)中的"嚴(yán)格條件"可W列舉:作為通 常的DNA雜交的清洗條件的在相當(dāng)于60°C、1 X SSC、0.1%SDS、優(yōu)選0.1 X SSC、0.1%SDS、進(jìn)一 步優(yōu)選68°C、0.1XSSC、0.1%SDS的鹽濃度和溫度下清洗1次、更優(yōu)選2~3次的條件等。
[0022] 在本說(shuō)明書(shū)中，目標(biāo)氨基酸序列或核巧酸序列上的、與特定的氨基酸序列或核巧 酸序列上的特定位置或區(qū)域相對(duì)的"對(duì)應(yīng)位置"或"對(duì)應(yīng)區(qū)域"可W通過(guò)將目標(biāo)氨基酸序列 或核巧酸序列與作為基準(zhǔn)的特定序列（參照序列）對(duì)齊(序列比對(duì))使對(duì)各氨基酸序列或核 巧酸序列中存在的保守氨基酸殘基或核巧酸賦予最大同源性來(lái)決定。比對(duì)可W利用公知的 算法來(lái)實(shí)行，其順序?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如，比對(duì)還可W根據(jù)上述的Lipman- Pearson法等通過(guò)手工操作來(lái)進(jìn)行，可W通過(guò)在缺省設(shè)定中使用Clus化1 W多序列比對(duì)程序 (Thompson, J. D.等人，1994, Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680)來(lái)進(jìn)行。Clustal W例如可W在歐州生物信息學(xué)研究所化uropean Bioinformatics Institute: EBI [WWW .ebi.ac.uk/index.html])或國(guó)立遺傳學(xué)研究所運(yùn)營(yíng)的日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)（DDBJ [www.cMbj .nig.ac. jp/Welcome-j .html])的網(wǎng)站上利用。
[0023] 在本說(shuō)明書(shū)中，"ω 6高度不飽和脂肪酸代謝途徑"是指由亞油酸(LA、18:化-6)生 產(chǎn)丫-亞麻酸(GLA、18:化-6)、雙高-丫-亞麻酸(DGLA、20:化-6)、花生四締酸(ARA、20: 4n-6) 等ω 6高度不飽和脂肪酸的代謝途徑，"ω 3高度不飽和脂肪酸代謝途徑"是指由α-亞麻酸 (ALA、18:：3n-3)生產(chǎn)十八碳四締酸（SDA、18:4n-3)、二十碳四締酸巧ΤΑ、20:4η-3)、二十碳五 締酸化ΡΑ、20:5η-3)等ω3高度不飽和脂肪酸的代謝途徑（圖1參照）。另外，在本說(shuō)明書(shū)中， "高度不飽和脂肪酸"是指碳鏈長(zhǎng)為18W上且不飽和鍵數(shù)為2W上的長(zhǎng)鏈脂肪酸。
[0024] 在本說(shuō)明書(shū)中，"不飽和化活性"是指向脂肪酸鏈中導(dǎo)入碳-碳雙鍵的活性，"不飽 和化酶"是指具有該不飽和化活性的蛋白或多膚。不飽和化活性和不飽和化酶根據(jù)通過(guò)該 活性而導(dǎo)入了碳-碳雙鍵的脂肪酸上的位置來(lái)進(jìn)一步分類。例如，"ω 3不飽和化活性"是指 向從脂肪酸