on. Microbiol., 2009，75: 5529-5535)等，優(yōu) 選ATMT法及其改變法，但只要可W獲得穩(wěn)定保持目標遺傳特征（形質(zhì)）的轉(zhuǎn)化體即可，基因 導(dǎo)入法并不限于運些方法。
[0057] 而且，對于本發(fā)明的含EPA的脂質(zhì)的生產(chǎn)方法中使用的、表達本發(fā)明的ω 3不飽和 化酶的細胞，可W施行激活其ω6高度不飽和脂肪酸代謝途徑運樣的改變。例如，通過向該 細胞中導(dǎo)入編碼A 12不飽和化酶的基因使該酶高度表達，可促進該細胞內(nèi)的油酸向亞油酸 轉(zhuǎn)變，可W激活ω6高度不飽和脂肪酸代謝途徑。該途徑的激活會使作為本發(fā)明的酶底物的 ω 6高度不飽和脂肪酸量增加，其結(jié)果，ΕΡΑ的產(chǎn)生得到促進。
[0058] 在本發(fā)明的含ΕΡΑ的脂質(zhì)的生產(chǎn)方法中，通過上述順序獲得的表達本發(fā)明的ω3不 飽和化酶的細胞被接種在液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。關(guān)于培養(yǎng)的條件，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可W根據(jù)細胞的種類進行最優(yōu)化。例如，當(dāng)該細胞為真菌時，可W將菌株的抱子、 菌絲、或預(yù)先培養(yǎng)而獲得的前培養(yǎng)液接種在上述培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。作為培養(yǎng)基的碳源，可 W列舉:葡萄糖、果糖、木糖、薦糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、甘油、甘露醇、脂質(zhì)、燒屬 控、締控等，但并不限于運些。作為氮源，除了蛋白腺、酵母提取物、麥芽提取物、肉提取物、 酪蛋白氨基酸、玉米漿、大豆蛋白、脫脂大豆、棉巧、麥教等天然氮源W外，還可W列舉:尿素 等有機氮源、W及硝酸鋼、硝酸錠、硫酸錠等無機氮源，但并不限于運些。而且，還可W添加 大豆油、挪子油、玉米油等脂質(zhì)。添加的脂質(zhì)優(yōu)選大豆油、玉米油等包含大量的亞油酸的油 月旨，更優(yōu)選大豆油。另外，還可W適當(dāng)添加憐酸鹽、硫酸儀、硫酸鐵、硫酸銅等無機鹽、或維生 素等作為微量營養(yǎng)源。運些培養(yǎng)基成分只要達到不妨礙所培養(yǎng)的微生物生長的濃度即可， 沒有特別限定。例如，在培養(yǎng)基中碳源可達到0.1~40質(zhì)量％、優(yōu)選1~25質(zhì)量％、氮源可達到 0.01~10質(zhì)量％、優(yōu)選0.1~10質(zhì)量％的濃度。在培養(yǎng)Μ. alpina或其突變株時，可W使用后述 的Czapek培養(yǎng)基、Czapek-dox培養(yǎng)基、葡萄糖-酵母提取物（W下，還稱作"GY")培養(yǎng)基、SC培 養(yǎng)基等?；蛘撸P(guān)于被抱霉屬微生物用的培養(yǎng)基，可W參考公知文獻(例如國際公開第98/ 29558號）。培養(yǎng)基的pH值可W是4~10、優(yōu)選6~9。培養(yǎng)可W是通氣攬拌培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)或靜 置培養(yǎng)。
[0059] 為了促進上述細胞的增殖W增加 EPA的收量，該細胞的培養(yǎng)優(yōu)選在最適生長溫度 下進行。例如，該細胞能夠在約5~60°C、優(yōu)選約10~50°C、更優(yōu)選約10~40°C、進一步優(yōu)選 約20~40°C、更加優(yōu)選約20~30°C下進行培養(yǎng)。例如，當(dāng)細胞為M. alpina或其突變株時，可 W在約10~40°C、優(yōu)選約20~40°C、更優(yōu)選約20~30°C下進行培養(yǎng)。該細胞的培養(yǎng)期間例如 可W是2~20天、優(yōu)選2~14天。需要說明的是，關(guān)于被抱霉屬微生物的培養(yǎng)方法，還可W參 考公知的文獻(例如日本特開平6-153970號公報）。
[0060] 通過按照上述順序培養(yǎng)表達本發(fā)明的ω 3不飽和化酶的細胞，在該細胞內(nèi)生產(chǎn)含 有大量的ΕΡΑ的脂質(zhì)。培養(yǎng)結(jié)束后，對培養(yǎng)液應(yīng)用離屯、分離、過濾等常用的方法，分離細胞。 例如，將培養(yǎng)液離屯、分離或過濾W除去液體部分，所分離的細胞在清洗后通過冷凍干燥、風(fēng) 干等進行干燥，獲得干燥細胞?？蒞通過有機溶劑提取等公知的方法，由該干燥細胞提取目 標脂質(zhì)。作為有機溶劑，可W列舉:己燒、乙酸、乙酸乙醋、乙酸下醋、氯仿、環(huán)己燒、苯、甲苯、 二甲苯等高度不飽和脂肪酸的溶解性高、且可與水分離的溶劑?；蛘?，還可W將運些有機溶 劑組合使用。通過減壓等從提取物中饋去有機溶劑，從而可W提取目標脂質(zhì)?；蛘?，也可W 不將細胞干燥，而由濕細胞提取脂質(zhì)。所得脂質(zhì)可W適當(dāng)采用脫膠、脫酸、脫臭、脫色、柱處 理、蒸饋等普通方法進一步純化。
[0061] 在上述提取的脂質(zhì)中，除了作為本發(fā)明方法的目標物的EPAW外，還包含作為夾雜 物的各種脂肪酸。因此，可W進一步純化上述脂質(zhì)而獲得純度更高的ΕΡΑ。還可W從脂質(zhì)中 直接分離ΕΡΑ，但優(yōu)選暫且將脂質(zhì)中的脂肪酸轉(zhuǎn)變成其與低級醇的醋衍生物，之后再分離目 標ΕΡΑ的醋衍生物。醋衍生物可W根據(jù)碳原子數(shù)、雙鍵數(shù)、位置的不同等，通過采用各種分離 純化操作來進行分離，因此可W容易地獲得目標脂肪酸的醋衍生物。但是，與ΕΡΑ相比，碳原 子數(shù)相同且雙鍵數(shù)有一個不同的花生四締酸則難W與ΕΡΑ分離，因此優(yōu)選在含有ΕΡΑ的脂質(zhì) 中花生四締酸少。醋衍生物優(yōu)選乙醋衍生物。醋化中可W使用包含鹽酸、硫酸、BF3等酸催化 劑、或甲醇鋼、氨氧化鐘等堿催化劑的低級醇。可W將柱層析、低溫結(jié)晶化法、尿素添加分離 法等單獨或組合使用，由所得的醋衍生物分離目標ΕΡΑ的醋衍生物。所分離的ΕΡΑ的醋衍生 物經(jīng)堿水解后，用酸、乙酸乙醋等有機溶劑提取，從而可W純化EPAdEPA可鹽的形式進 行純化。
[0062] 在W工業(yè)規(guī)模進行本發(fā)明的含大量EPA的脂質(zhì)的生產(chǎn)時，例如，可W在罐中等大規(guī) 模培養(yǎng)表達本發(fā)明的ω 3不飽和化酶的產(chǎn)脂質(zhì)微生物，用壓濾機等過濾，回收細胞，干燥后 使用球磨機等將細胞粉碎，用有機溶劑提取脂質(zhì)。另外，W工業(yè)規(guī)模提取微生物中的成分加 W利用的方法、或由脂質(zhì)純化ΕΡΑ的方法已知有多種，也可W將運些方法適當(dāng)改變后在本發(fā) 明的方法中使用。
[0063] 通過本發(fā)明獲得的ΕΡΑ可用于制造人或非人動物用的藥品、化妝品、食品、飼料等。 作為該藥品的劑型，例如可W列舉:片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑、干糖漿劑、溶液劑、 懸浮劑等口服制劑;吸入劑、栓劑等經(jīng)腸制劑；點滴劑;注射劑;外用劑;經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻 劑;吸入劑;貼劑等。另外，作為該化妝品的形態(tài)，可W列舉:霜劑、乳液、洗液、懸浮液、凝膠、 粉末、面膜、薄片、貼片、棒狀、餅狀等化妝品通常能夠采用的任意形態(tài)。
[0064] 上述藥品或化妝品含有ΕΡΑ或其鹽作為有效成分。上述藥品或化妝品還可W含有 作為藥物可接受的載體或作為化妝品可接受的載體、例如賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、 表面活性劑、pH調(diào)節(jié)劑、分散劑、乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、著色劑、醇、水、水溶性高分子、 香料、甜味劑、矯味劑、酸味劑等，根據(jù)需要，還可W含有其他有效成分、例如藥效成分、化妝 成分等。上述藥物或化妝品可通過根據(jù)劑型向EPA或其鹽中混合上述載體或其他有效成分、 再按照常規(guī)方法進行調(diào)制而制得。上述藥物或化妝品中的EPA含量根據(jù)其劑型而不同，通常 為0.1~99質(zhì)量％、優(yōu)選1~80質(zhì)量%的范圍。
[0065] 上述飲食品或飼料含有EPA或其鹽作為有效成分。運些飲食品或飼料謀求血小板 凝集抑制作用、血中中性脂肪降低作用、抗動脈硬化作用、血液粘度降低作用、降血壓作用、 抗炎作用、抗腫瘤作用等效果，可W是顯示該宗旨的健康食品、功能性飲食品、特定保健用 飲食品、患者用飲食品、用于家畜、比賽用馬、觀賞動物等的飼料、寵物食品等。
[0066] 對上述飲食品或飼料的形態(tài)沒有特別限定，包含可W混合EPA或其鹽的所有形態(tài)。 例如，作為該飲食品的形態(tài)，可W是固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)，或者可W列舉片劑、巧嚼片、粉劑、 膠囊、顆粒、飲料、凝膠、糖漿、經(jīng)管經(jīng)腸營養(yǎng)用流食等各種形態(tài)。作為具體的飲食品形態(tài)的 例子，可W列舉:綠茶、烏龍茶或紅茶等茶飲料、咖啡飲料、清涼飲料、果凍飲料、運動飲料、 乳飲品、碳酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、發(fā)酵乳飲料、粉末飲料、可可飲料、酒精飲料、純 凈水等飲料;黃油、果醬、撒在飯上的粉狀食品、人造奶油等調(diào)味粉類;蛋黃醬、起酥油、乳蛋 糕乳脂、調(diào)味料類、面包類、米飯類、面條類、意大利面、醬湯、豆腐、牛乳、酸乳、湯或沙司類、 點屯、(例如餅干或曲奇類、巧克力、糖果、蛋糕、冰洪淋、口香糖、片劑)等。上述飼料可與 飲食品幾乎相同的組成或形態(tài)來利用，因此本說明書中的關(guān)于飲食品的記載對于飼料也同 樣可W適用。
[0067] 上述飲食品或飼料可W通過混合EPA或其鹽、W及用于制造飲食品或飼料的其他 飲食品原材料、各種營養(yǎng)素、各種維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、各種油脂、各種添加劑(例如呈味 成分、甜味劑、有機酸等酸味劑、表面活性劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、色素、香精)等， 再按照常規(guī)方法進行調(diào)制而制得。或者，可W通過在通常所食用的飲食品或飼料中混合EPA 或其鹽來制造本發(fā)明的飲食品或飼料。上述飲食品或飼料中的EPA或其鹽的含量根據(jù)食品 的形態(tài)而不同，通常為0.01~80質(zhì)量％、優(yōu)選0.1~50質(zhì)量％、更優(yōu)選1~30質(zhì)量%的范圍。 實施例
[0068] W下，利用實施例來更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不受下述實施 例的限定。
[0069] (培養(yǎng)基） GY培養(yǎng)基:2%(w/v)葡萄糖、1%酵母提取物。
[0070] Czapek-Dox 瓊脂培養(yǎng)基：3% 薦糖、0.2% NaN〇3、0.1%KH2P〇4、0.05% KCl、0.05〇/〇 MgS04·7出0、0.001%FeS04·7出0、2%瓊脂、pH6.0。
[0071] LB-Mg瓊脂培養(yǎng)基：1%膜化蛋白腺、0.5%酵母提取物、85mM化Cl、0.5mM MgS〇4 · 7出0、0.5mM化地、1.5%瓊脂、口職.0。
[0072] 基本培養(yǎng)基K2HP〇4、10mMK此P〇4、2.5mM 化Cl、2mM MgS〇4 · 7H2〇、0.7mM CaCl2、9yM FeS〇4.7H2〇、4mM (NH4)2S〇4、10mM葡萄糖、pH7.0。
[0073] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（IM):向MM中加入0.5%(w/v)甘油、200μΜ乙酷下香酬、40mM 2-(N-嗎嘟 代）乙橫酸(MES)，調(diào)節(jié)至抑5.3。
[0074] SC培養(yǎng)基：5.0g無氨基酸酵母氮源（Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids)和 硫酸錠(Difco)、1.7g (NH4)2S〇4、20g葡萄糖、20g瓊脂、20mg腺嚷嶺、30mg酪氨酸、l.Omg甲硫 氨酸、2. Omg精氨酸、2. Omg組氨酸、4. Omg賴氨酸、4. Omg色氨酸、5. Omg蘇氨酸、6. Omg異亮氨 酸、6.0mg亮氨酸、6.0mg k苯丙氨酸。
[0075] 實施例1 ω 3不飽和化酶的鑒定 將囊形腐霉在lOmL GY培養(yǎng)基中、在28°C下振蕩培養(yǎng)5天，回收菌體。將收集的菌體放入 2mL管中，使用珠粒振蕩器(Yasui Kikai)在1700巧m、10秒X2次的條件下將其破碎。使用 IS0GEN (Bi0-Rad)，按照產(chǎn)品指南由已破碎的菌體提取mRNA。所提取的mRNA用Pr ime ScriptT