細(xì)胞和/或包含魚呼腸孤病毒 源的任何其他物質(zhì)，W得到混合培養(yǎng)物;b)溫育步驟a)中得到的混合培養(yǎng)物，C)從步驟b)的 所述混合培養(yǎng)物中除去被魚呼腸孤病毒感染的紅細(xì)胞，d)可選地重復(fù)步驟a)至c)的操作， 和e)從步驟C)的紅細(xì)胞中分離魚呼腸孤病毒，隨后滅活步驟e)中得到的魚呼腸孤病毒W(wǎng)及 此后制備包含所述滅活的魚呼腸孤病毒的組合物。
[0099] 可本領(lǐng)域已知的任何合適的方式進(jìn)行正呼腸孤病毒的滅活，諸如通過使用溶 劑或去垢劑(detergent)滅活、熱滅活或通過將病毒暴露于酸性抑滅活。根據(jù)本文別處所公 開的進(jìn)行用于制備疫苗組合物的運(yùn)種方法中的步驟a)-e)。
[0100] 因此，可W根據(jù)本領(lǐng)域已知的手段制備包含滅活形式的諸如魚呼腸孤病毒的正呼 腸孤病毒的疫苗組合物，且可W將合適的賦形劑添加至所述組合物中。
[0101] 本文還提供了 W下方法，其中，包含通過本文所公開的體外方法得到的滅活的魚 呼腸孤病毒的所述疫苗組合物用于治療和/或預(yù)防屯、臟和骨骼肌炎癥化SMI)。另外，疫苗組 合物可W包含一種或多種其他正呼腸孤病毒或其他抗原試劑(antigenic agent)。還提供 了通過本文所公開的體外方法得到的滅活的魚呼腸孤病毒的疫苗組合物在制造用于治療 和/或預(yù)防屯、臟和骨骼肌炎癥的藥物中的用途。
[0102] 本文還提供了用于診斷娃科魚中的屯、臟和骨骼肌炎癥化SMI)或存在的PRV病毒的 體外方法，所述方法包括:a)從所述娃科魚的生物血樣中分離娃科紅細(xì)胞，b)檢測步驟a)得 到的所述娃科紅細(xì)胞中存在的魚呼腸孤病毒(PRV)。在運(yùn)種方法中，可W根據(jù)本文所公開的 或別處舉例說明的分離娃科紅細(xì)胞。例如可W通過RT-qPCR進(jìn)行運(yùn)種檢測。表2中所公開的 引物和/或探針可W用于運(yùn)種檢測。
[0103] 在本文提供的體外方法中，娃科可W是娃魚。檢測紅細(xì)胞中存在的魚呼腸孤病毒 是娃科魚中屯、臟和骨骼肌炎癥化SMI)的指示或其可能發(fā)展的指示。
[0104] 本文還設(shè)及有核紅細(xì)胞用于增殖正呼腸孤病毒的用途。用于運(yùn)種用途的合適的有 核紅細(xì)胞和正呼腸孤病毒如本文別處所公開的。用途的實(shí)例是被魚呼腸孤病毒感染的娃科 紅細(xì)胞對增殖魚呼腸孤病毒的用途。
[0105] 本公開通過實(shí)驗(yàn)部分進(jìn)一步示出，但不旨在限于此。
[0106] 實(shí)驗(yàn)部分
[0107] 實(shí)施例1 [010引材料和方法
[0109] 實(shí)驗(yàn)魚和飼養(yǎng)條件
[0110] 進(jìn)行兩個隨后的PRV挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)(VES0 Vikan，Norway)。使用未接種的適應(yīng)海水的大 西洋娃進(jìn)行兩個試驗(yàn)。將魚保持在供應(yīng)有25%。鹽度的過濾海水、12°C ± rC和12:1化光/暗 方案的罐中。在挑戰(zhàn)之前，使魚適應(yīng)新環(huán)境2周，在處理和通過打擊頭部殺死之前，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 操作喂養(yǎng)并通過浸?。?-5min)在Metacain(用Ig化HC03緩沖的lg/101水）（Norsk Medisinaldepot;Oslo,Norway)中將其麻醉。
[0111] 挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)#1。在第一個實(shí)驗(yàn)中，使用初始平均重量為50g的50條倒注者(脫皮者、脫 鱗者，shedders)和50條共居者。接種物由來自HSMI現(xiàn)場發(fā)作的魚的組織勻漿(屯、臟、脾臟和 前腎）組成且包含通過RT-qPC閒角定的高負(fù)荷的PRV。確認(rèn)接種物不含其它通常已知的娃魚 病原體。麻醉倒注者，通過腹膜內(nèi)（i.P.)注射給予O.lmL接種物，其由縮短外左側(cè)上額骨標(biāo) 志，并將其放入包含50條首次用于實(shí)驗(yàn)的魚(共居者）的罐中。每第二周(每隔一周）取樣共 居組中的六條魚，開始于6周挑戰(zhàn)后(wpc)終止于14wpc。此外，在4wpc取樣3條魚用于測試 PRV的傳播。在開始實(shí)驗(yàn)之前，收集來自6條魚的對照樣品。在每次取樣時(shí)，將來自尾靜脈(臀 脈，caudal vein)的周圍血液收集在肝素化真空采血管(va州tainer)中，并將來自屯、臟、骨 骼肌、脾臟和前腎的組織取樣在RNAlater(Life Technologies，Carlsbad，CA)中并用于RT- qPCR分析。將來自相同器官的平行樣品收獲在10%憐酸鹽緩沖液福爾馬林中，將其包埋在 石蠟中并用于組織分析。
[0112] 在9wpc，取樣來自共居組的15條魚的血液，合并并離屯、。在除去血漿之后，將血液 顆粒(blood pellet) Wl:4稀釋在憐酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中并在-80°C下儲存。將合并的 樣品用作挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)#2中的接種物。
[0113] 挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)#2。在第二挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)中，使用初始平均重量為80g的60條倒注者和60條共 居者。解凍實(shí)驗(yàn)#1中制備的血液顆粒，1:3稀釋在PBS中并用作挑戰(zhàn)物質(zhì)(Marie L:用于PRV 的Ct-verdi)。根據(jù)挑戰(zhàn)#1進(jìn)行倒注者的接種和標(biāo)記。從2wpc直到8wpc每周取樣共居組的六 條魚。在開始實(shí)驗(yàn)之前，取樣來自六條魚的對照樣品。如挑戰(zhàn)#1所描述的取樣血液、屯、臟和 脾臟組織。WlOOOxg離屯、5min之后，從肝素化血液W及收集的血漿部分中提取用于RT-qPCR 的樣品。剩余的血樣用于分離血紅細(xì)胞(RBC)，隨后通過RT-qPCR、流式細(xì)胞術(shù)、共聚焦顯微 術(shù)和透射電子顯微術(shù)(TEM)分析。
[0114] RNA分離。通過使用5mm鋼珠和TissueLyserII(Qiagen)在QIAzoULysis試劑 (Qiagen,化lden,Ge;rmany))中均質(zhì)化從儲存在RNAlater中的組織分離總RNA。添加氯仿并 離屯、之后，收集水相并在根據(jù)制造商所描述的用RNeasy迷你離屯、柱繼續(xù)之前將其與一體積 的70%乙醇混合。使用10μ1血液和1x107RBC輸入量，將相同方法分別用于分離肝素化血樣 和分離的RBC的總RNA。對于血漿樣品，使用Trizol LSdnvitrogen Life Technologies)和 RNeasy迷你試劑盒的組合。簡單來說，在添加氯仿之前混合50μ1血漿并用化izol LS溫育， 通過離屯、分離相，W及隨后根據(jù)制造商推薦的使用RNeasy迷你試劑盒。在50μ1不含RNase的 水中洗脫從50μ1血漿分離的RM。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)（NanoDrop Technologies)定量 RNA。
[0115] RT-qPCR。將Qiagen OneStep試劑盒（Qiagen)用于RT-qPCR。在95°C下變性來自組 織樣品的總的扣1 RNA( 20ngAU)或來自血漿樣品的總的扣1 RNA(相當(dāng)于化1血漿)5分鐘。 使用 W 下條件進(jìn)行RT-qPCR: 400nM引物，300nM探針，400nM dNTP，1.26mM MgCl2，1: lOORNase Out(Invitrogen)和IX ROX參考染料，采用W下循環(huán)參數(shù)：在Mx3005P (5化日1日邑6116)中，50。(：下30111111，94。(：下15111111，94。(：/153、54。(：/303和72。(：/153 40個循環(huán)。 一式兩份運(yùn)行樣品，并且如果兩個平行具有Ct<35,將樣品定義為陽性。用于祀向PRV基因片 段S1 的引物和探針的序列是：SlFwd TGCGTCCTGCGTATGGCACC(SEQ ID N0:1); SlRevGGCTGGCATGCCCGAATAGCA(SEQ ID N0:2) ;S1 探針（FAM)-ATCACAACGCCTACCT-MGBNFQ (良P，F(xiàn)AM-SEQ ID N0:3-MGBNFQ)。
[0116] 組織病理學(xué)。用蘇木精-曙紅化E)染色固定在甲醒中并包埋在石蠟中的收集自挑 戰(zhàn)#1和2的屯、臟材料切片，并通過光學(xué)顯微鏡評估組織病理變化。
[0117] 分離血紅細(xì)胞(RBC)。通過使用之前描述的化rcoll梯度W最小改變從挑戰(zhàn)#2中收 集的肝素化血液中分離RBC(14)。簡而言之，1:10將血液稀釋在蒸饋的PBS(dPBS)中并使用 1.07g/血(49%)和1.05g/mL(34%)制備間斷的（不連續(xù)的）Percoll梯度。將稀釋的血液分 層在梯度上并在4 °C下W 2000xg離屯、20min。從梯度底部收集RBC;然而，變化量的紅細(xì)胞存 在于34%-49%界面中。為了收集剩余的紅細(xì)胞，將界面重新分層(relayer)至新鮮的34%- 49%梯度并在4°C下W500xg離屯、lOmin。收集梯度底部的RBC，與第一梯度的紅細(xì)胞合并，并 在PBS中洗涂兩次。使用Countess(Invitrogen)計(jì)數(shù)細(xì)胞并將其重新懸浮于PBS中至5x10? 個細(xì)胞/mL的最終濃度。Diff如ick染色的血涂片確認(rèn)可W將分離的細(xì)胞識別為紅細(xì)胞。
[0118] 流式細(xì)胞術(shù)。為了檢測PRV陽性細(xì)胞，使用針對推斷的PRV外殼蛋白01 (抗01，# 1(275)(18)的多克隆抗體染色來自0、4、5、6、7和8可)(3的分離1^(：，運(yùn)行平行樣品用于表面和 細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。簡要地，將0.5x106個細(xì)胞/孔涂覆在96孔板上并用染色緩沖液(PBS+1%BSA+ 0.05%疊氮化物)洗涂。用一抗抗-01邸275(1:10000)表面染色細(xì)胞30min，并使用所有洗涂 液和稀釋液中的染色緩沖液用FITC結(jié)合的二抗抗-兔IgG(分子探針）（2mg/ml，l:800稀釋） 表面染色細(xì)胞30min。在細(xì)胞內(nèi)染色細(xì)胞之前，通過在冰上在Cytof ix/切tope;rm(Becton Dickinson)中溫育15min，W及W上所描述的相同的一次和二次溫育，但是使用稀釋液中的 化rm/洗涂(BD)和洗涂步驟固定和滲透細(xì)胞。所有溫育在冰上進(jìn)行，并將對應(yīng)的零血清(抗σ lZe;ro#K275)用作陰性對照血清。在Gallios流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)上讀取細(xì)胞，計(jì) 數(shù)為50000細(xì)胞/樣品，并使用Kaluza軟件(BD)分析數(shù)據(jù)。由于背景染色的微小變化，單獨(dú)篩 選(gated)流程圖來區(qū)別陰性峰和陽性峰。
[0119] 免疫巧光顯微術(shù)和共聚焦顯微術(shù)。制備細(xì)胞內(nèi)染色的RBC的選定樣品用于免疫巧 光和共聚焦顯微術(shù)。用艦化丙晚染色細(xì)胞核并使用FluoroshielcKSigma-Aldrich)將細(xì)胞 安放至載玻片和蓋玻片。通過激光掃描共焦顯微鏡（Zeiss Axiovert 200M巧光倒置顯微 鏡，安裝有LSM 510激光共聚焦單元和488nm氣激光器、546nm和63化m氮/氛激光器Z)中的 Plan-Apochromat 63/1.4油物鏡捕獲不飽和圖像。此外，用^上所描述的艦化丙晚染色選 定樣品并將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至Countess隔室玻片（腔室玻片，chamber slide) (Invitrogen)。使用倒置巧光顯微鏡(Olympus 1X81) W20x和40x放大倍數(shù)拍攝圖片。
[0120] 透射電子顯微術(shù)(TEM)。在4°C下將來自受感染魚的分離RBC固定在PBS與1.25%戊 二醒和2%多聚甲醒中過夜，在口85中洗涂兩次^及二甲腫酸鹽緩沖液（〇曰(3〇(171曰10 buffer) (0.1M，抑6.8)中洗涂Ξ次。在4°C下用1 %0s化后固定細(xì)胞化并用二甲腫酸鹽緩沖 液洗涂多次。然后通過乙醇系列（70、90、96和100%)將細(xì)胞脫水，并將其嵌入在LR-白樹脂 中。在超薄切片機(jī)(LEICA EM UC 6)上切割薄片。用4%乙酸雙氧軸水溶液(aqueous uranyl acetate)和染色切片lOmin，然后在新鮮蒸饋水中深入洗涂。在FEI MORGAGNI 268 中檢查切片，并使用VELETA照相機(jī)記錄照片。
[0121 ]統(tǒng)計(jì)分析。用Gra地Pad Prism 6.0(Gra地化d Software inc. ,USA)進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì) 分析。
[0122] 結(jié)果
[0123] 感染期間血液中的高PRV負(fù)荷。由挑戰(zhàn)#1得到的RT-qPCR結(jié)果顯示肝素化的全血樣 品中的高病毒負(fù)荷。首先在6wpc的血液中檢測魚呼腸孤病毒，且病毒量峰值在8wpc，平均Ct 值為18.6( ±0.7)。直到研究結(jié)束，高病毒負(fù)荷一直存在于血液中（圖1A)。使用未配對的t測 試將血液的平均Ct值與屯、臟和骨骼肌比較，屯、臟和骨骼肌是HSMK3)期間組織病理學(xué)變化 的主要器官。在屯、臟中（P<〇.〇5)早期(6和8wpc)和晚期（14wpc)階段W及在骨骼肌(p<0.05) 的所有時(shí)間點(diǎn)發(fā)現(xiàn)顯著較少量的病毒（圖1A)。當(dāng)比較血液與脾臟和前腎（已知感染期間包 含最多病毒的器官（19))時(shí)，水平大致是相同的（圖1B)。然而，在后期階段（14wpc)，脾臟中 存在顯著較高的病毒負(fù)荷(P<〇.01)。與HSMI診斷一致的屯、臟和骨骼肌中的組織病理變化首 先在lOwpc中，六條魚中的Ξ條在lOwpc下觀察到。
[0124]為了進(jìn)一步評估血液和組織PRV水平之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，使用配對的t-測試分析 每個時(shí)間點(diǎn)每條個體魚中的相對Ct值。結(jié)果示出所有時(shí)間點(diǎn)處屯、臟和骨骼肌樣品兩者中病 毒的相對量顯著低于相同個體中的血液中的相對量(P<0.05)(圖1C)。感染期間與血液相 比，脾臟和前腎中的相對PRV負(fù)荷增加。在6wpc，與血液相比，脾臟和前腎中存在顯著較低的 PRV負(fù)荷(P<0,01)，而在后期階段（lO-Hwpc)，脾臟中的病毒負(fù)荷顯著較高(p<0.05)，并且 對于前腎看到相同趨勢(僅在lOwpc顯著較高，p<0.05)。來自挑戰(zhàn)#1的所有Ct值列于補(bǔ)充數(shù) 據(jù)表S1中。
[01巧]血細(xì)胞顆粒（血細(xì)胞團(tuán)、血細(xì)胞沉淀，blood cell pellet)是高度有效的挑戰(zhàn)物 質(zhì)。將來自挑戰(zhàn)#1制得的血細(xì)胞顆粒用作挑戰(zhàn)#2的接種物，并且再次檢測到血液中的高病 毒負(fù)荷（圖2A)。首先在4wpc在六條魚的二條中檢測PRV;即，挑戰(zhàn)#1之前兩周，W及在5wpc， 通過RT-qPCR的所有樣品魚是PRV陽性的。與挑戰(zhàn)# 1相比，血液中的最大病毒負(fù)荷早出現(xiàn)兩 周，并在6wpc平穩(wěn)(plateaued)，其中，平均Ct值為16.5(±0.7);其顯著高于挑戰(zhàn)1中相同時(shí) 間點(diǎn)的病毒負(fù)荷(未配對t-測試，p<0.001)。
[0126] 將血液中的病毒量與脾臟比較，且在挑戰(zhàn)#1中觀察到，在感染的早期階段（5- 7wpc)血液中的PRV負(fù)荷顯著高于脾臟的PRV負(fù)荷(P值<0.01)(圖2B)。與HSMI診斷一致的屯、 臟和骨骼肌中的組織病理變化首先在7wpc的六條魚中的四條中（圖3)和在8wpc的所有樣品 魚中觀察到。
[0127] RBC中的高PRV負(fù)荷。通過RT-qPCR在4wpc首先在挑戰(zhàn)#2的RBC中檢測到PRV，并且其 在約6至7wpc (分別是18.5 ± 2.9和17.5 ± 2.9)平穩(wěn)，因此遵循與血液中觀察到的相同模式 (圖2A)。運(yùn)些結(jié)果指示RBC是PRV感染期間的重要病毒儲存庫。血漿也包含了顯著量的病毒， 部分解釋了與RBC相比全血中病毒的稍高水平。來自挑戰(zhàn)#2的所有Ct值列于補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S2 中。
[0128] 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測大群體的PRV陽性RBC。使用針對推斷的PRV衣殼蛋白〇1的多 克隆抗體染色挑戰(zhàn)#2的分離RBC，并進(jìn)行表面和細(xì)胞內(nèi)染色兩者。根據(jù)它們的大小和粒度篩 選細(xì)胞W僅包括完整細(xì)胞（圖4A)。將Owpc的樣品用作陰性對照，指示在PRV陰性樣品中檢測 的背景巧光信號（圖4B)。通過細(xì)胞內(nèi)和表面染色兩者的巧光信號中的峰看出，在六條個體 中的兩條(F55，F(xiàn)56)中在5wpc首先觀察至化RV陽性紅細(xì)胞群。細(xì)胞內(nèi)檢測大部分的病毒蛋白 并可W觀察到大的、明顯的PRV陽性RBC群（達(dá)到F56中43 %陽性細(xì)胞）（圖4C)。如RBC的RT- qPCR所示，陽性個體還包含與組其余(個體)相比明顯更高的病毒負(fù)荷(表1)。在相同個體的 較低數(shù)量的RBC表面上也檢測到PRV。在補(bǔ)充圖S1中示出了來自挑戰(zhàn)#1的表面染色。
[0129] 在7wpc，在五條個體魚的四條中觀察到PRV陽性紅細(xì)胞并且大群體的RBC(25%直 至51%)是陽性的（圖4C)。大部分的病毒存在于細(xì)胞內(nèi)。與5wpc樣品相反，在7wpc的陽性細(xì) 胞可W劃分為兩個單獨(dú)的群體，示出對PRVol的低陽性和高陽性染色。低陽性群體在強(qiáng)度上 與在5wpc下檢測的單個PRV群相當(dāng)，指示包含高PRV水平的細(xì)胞隨時(shí)間的發(fā)展（圖4C)。在 8wpc，通過在所有六條個體中細(xì)胞內(nèi)染色檢測到大群體的PRV陽性RBC，與在7wpc觀察到的 結(jié)果類似。
[0130] 來自流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果相關(guān)，因?yàn)樵?、7和8wpc的流式分析 中，ct值低于20的個體魚一致檢測為陽性（圖4C，表1)。通過在7wpc的F74舉例說明，Ct值高 于20的樣品看起來低于流式細(xì)胞術(shù)分析的靈敏闊值（圖4C)。在4wpc，所有RBC樣品具有僅在 流式細(xì)胞術(shù)中產(chǎn)生背景信號的高于20的Ct值，而在8wpc所有樣品具有低于20的Ct值且通過 流式細(xì)胞術(shù)是陽性的（圖4C)。
[0131] 在整個研究中，存在具有高巧光強(qiáng)度的PRV陽性細(xì)胞具有在流式細(xì)胞術(shù)中增加的 偵晌散射的趨勢（圖4D)。在每條魚中單獨(dú)篩選陰性群和高PRV陽性群，并使用威氏檢驗(yàn)比較 它們的平均側(cè)向散射。在7wpc和8wpc的高PRV陽性群與陰性群相比（p<0.05)具有顯著較高 的側(cè)向散射，指示高度PRV陽性的紅細(xì)胞更呈粒狀(more granular)。
[0132] 在RBC中檢測病毒細(xì)胞質(zhì)包涵體(巧toplasmic inclusions)。為了研究PRV的亞細(xì) 胞定位，制備針對PRVol細(xì)胞內(nèi)染色的選定RBC樣品，用于免疫巧光和共聚焦顯微術(shù)。通過細(xì) 胞質(zhì)中顆粒染色(granular staining)識別免疫巧光顯微術(shù)中的PRV陽性紅細(xì)胞（圖5A)。作 為從幾個大的包涵體至多個較小的包涵體在大小和數(shù)目上改變的包涵體，或整個細(xì)胞質(zhì)中 更加擴(kuò)散的粒狀染色，觀察到陽性染色（圖5B)。陽性紅細(xì)胞的形態(tài)從具有楠圓形狀和長細(xì) 胞核的一般成熟紅細(xì)胞改變至類似于不成熟的紅細(xì)胞（多染細(xì)胞(polychromatocyte))的 更圓的細(xì)胞。通過共聚焦顯微術(shù)確認(rèn)PRV陽性染色來源于細(xì)胞質(zhì)，且主要在細(xì)胞核周圍區(qū)域 檢測到病毒包涵體，但是還發(fā)現(xiàn)病毒包涵體在細(xì)胞質(zhì)中散射（圖5C)。通過相差顯微術(shù) (phase contrast microscopy)還觀察到在一些RBC中的細(xì)胞質(zhì)包涵體，并且運(yùn)些包涵體與 PRV的免疫巧光染色共定位(圖5D)。
[0133] 在??Μ中觀察到呼腸孤病毒樣顆粒。來自受感染魚的RBC的??Μ分析顯示包涵體包 含細(xì)胞質(zhì)中的呼