0C，優(yōu)選地約37°C。CO2濃度例如是，約I至約10 %，優(yōu)選地約5 %。
[0111]可以通過例如檢測團聚體含有表達作為視網(wǎng)膜先祖細胞標(biāo)記物的Rax或PAX6的細胞來確認已經(jīng)獲得含視網(wǎng)膜先祖細胞的團聚體。
[0112]獲得的含視網(wǎng)膜先祖細胞的團聚體可以原樣地用作用于評估毒性或藥物效力的試劑。同樣可能的是，通過對含視網(wǎng)膜先祖細胞的團聚體進行分散處理(例如，胰蛋白酶/EDTA處理)并且通過FACS選擇獲得的細胞來獲得高純度的視網(wǎng)膜先祖細胞。
[0113]本發(fā)明的制備方法2是用于制備視網(wǎng)膜組織的方法，所述方法包括以下步驟(I)、
(2)和(3):
[0114](I)第一步，在無血清培養(yǎng)基中對多能干細胞進行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細胞的團聚體，
[0115](2)第二步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(I)中形成的團聚體進行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，由此獲得含視網(wǎng)膜先祖細胞的團聚體，和
[0116](3)第三步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(2)中形成的團聚體進行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種，由此獲得含有視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團聚體。
[0117]本發(fā)明的制備方法2的步驟(I)和步驟(2)可以與本發(fā)明的制備方法I的步驟(I)和步驟(2)類似地進行。
[0118]說明步驟(3)，步驟(3)包括在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(2)中形成的團聚體進行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種，由此獲得含有視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團聚體。
[0119]步驟(3)中使用的培養(yǎng)基是，例如，未補充作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基。
[0120]“不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種”的培養(yǎng)基也包括基本上不含作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種的培養(yǎng)基，例如，含有的作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種的濃度不會對向視網(wǎng)膜組織的選擇性分化產(chǎn)生不利影響的培養(yǎng)基。
[0121]“未補充作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種”的培養(yǎng)基還包括基本上沒有補充作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種的培養(yǎng)基，例如，補充的作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種的濃度不會對向視網(wǎng)膜組織的選擇性分化產(chǎn)生不利影響的培養(yǎng)基。
[0122]被用作此種培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基不受特別限制只要其如上所述即可。為避免復(fù)雜的配制過程，優(yōu)選使用例如補充有適當(dāng)量的血清代替物如市售的KSR的無血清培養(yǎng)基(例如，通過向頂DM和F-12的1:1混合物添加10%KSR，450yM 1-—硫代甘油和Ix化學(xué)上明確的脂質(zhì)濃縮物獲得的培養(yǎng)基)。在例如人ES細胞的情況中，向無血清培養(yǎng)基添加的KSR的量通常為約I %至約20 %，優(yōu)選地約2 %至約20 %。
[0123]作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)是能夠增強由Wnt介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)。作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的實例包括屬于Wnt家族的蛋白(例如，Wntl，Wnt3a，Wnt7a)，Wnt受體，Wnt受體激動劑，651(30抑制劑(例如，6-8101110丨11(1化111^11-3’-(^丨11^(810)，(:!111?99021，Kenpaullone)等。
[0124]步驟(3)中的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度、CO2濃度、O2濃度可以被適當(dāng)?shù)卮_定。培養(yǎng)溫度例如是，約30 °C至約40 °C，優(yōu)選地約37 °C。CO2濃度例如是，約I至約1 %，優(yōu)選地約5 %。O2濃度不低于約18%，例如，約20%至約70%，優(yōu)選地約20%至約60%，更優(yōu)選地約20%至約50%。
[0125]雖然步驟(3)中的培養(yǎng)時間不受特別限制，但其通常為48小時以上，優(yōu)選地7天以上。
[0126]在以此方式進行懸浮培養(yǎng)的團聚體中，視網(wǎng)膜組織覆蓋團聚體的表面而存在。在完成懸浮培養(yǎng)后，可以通過用固定劑如多聚甲醛溶液固定團聚體，制備冷凍切片，并且通過免疫染色方法等確認形成具有層結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜組織來確認視網(wǎng)膜組織。因為視網(wǎng)膜組織的各個層由不同的視網(wǎng)膜先祖細胞(光感受器，水平細胞，雙極細胞，無長突細胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞)構(gòu)成，因此層結(jié)構(gòu)的形成可以通過使用針對這些細胞中表達的標(biāo)記物的抗體的免疫染色方法來確認。
[0127]同樣可能的是用鑷子等物理上切下存在于團聚體表面上的視網(wǎng)膜組織。在此情況中，因為在各團聚體的表面上可以形成除視網(wǎng)膜組織以外的神經(jīng)組織，從團聚體切下的神經(jīng)組織的部分被分開并且通過如下所述的免疫染色法等確認，由此該組織被確認為視網(wǎng)膜組織。
[0128]在含有視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團聚體中，例如，在團聚體冷凍切片的免疫染色圖像中觀察到RAX陽性組織，并且在其外部沒有觀察到RAX陰性組織。
[0129]可以通過本發(fā)明的制備方法2由人多能干細胞高效地獲得視網(wǎng)膜組織。因為通過本發(fā)明的制備方法2獲得的視網(wǎng)膜組織含有各視網(wǎng)膜層特有的神經(jīng)元，同樣可能的是獲得構(gòu)成視網(wǎng)膜組織的細胞如光感受器，水平細胞，雙極細胞，無長突細胞，神經(jīng)節(jié)細胞，或這些細胞的先祖細胞等。由獲得的視網(wǎng)膜組織可以獲得什么細胞可以通過本身已知的方法(例如，細胞標(biāo)記物的表達)來確認。
[0130]含有獲得的視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團聚體可以原樣地用作用于評估毒性或藥物效力的試劑。同樣可能的是通過對含有視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團聚體進行分散處理(例如，胰蛋白酶/EDTA處理)，并且通過使用FACS選擇獲得的細胞來獲得高純度的構(gòu)成視網(wǎng)膜組織的細胞。
[0131]本發(fā)明的制備方法3是用于制備視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞的方法，所述方法包括一下步驟(1)、(2)和(3):
[0132](I)第一步，在無血清培養(yǎng)基中對多能干細胞進行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細胞的團聚體，
[0133](2)第二步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(I)中形成的團聚體進行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，由此獲得含視網(wǎng)膜先祖細胞的團聚體，和
[0134](3)第三步，在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(2)中形成的團聚體進行懸浮培養(yǎng)直至目標(biāo)視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞出現(xiàn)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種，由此獲得含有含目標(biāo)視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞的視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團聚體。
[0135]本發(fā)明的制備方法3的步驟(I)和步驟(2)可以與本發(fā)明的制備方法I的步驟(I)和步驟(2)類似地進行。
[0136]說明步驟(3)，步驟(3)包括在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(2)中形成的團聚體進行懸浮培養(yǎng)直至目標(biāo)視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞出現(xiàn)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種，由此獲得含有含目標(biāo)視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞的視網(wǎng)膜組織并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的團聚體。
[0137]步驟(3)中使用的培養(yǎng)基是，例如，沒有補充作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基。
[0138]“不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種”的培養(yǎng)基也包括基本上不含作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種的培養(yǎng)基，例如，含有的作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種的濃度不會對向視網(wǎng)膜組織和視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞的選擇分化產(chǎn)生不利影響的培養(yǎng)基。
[0139]“沒有補充作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種”的培養(yǎng)基也包括基本上沒有補充作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種的培養(yǎng)基，例如，補充的作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)、作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)中的任一種的濃度不會對向視網(wǎng)膜組織和視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞的選擇分化產(chǎn)生不利影響的培養(yǎng)基。
[0140]被用作此種培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基不受特別限制只要其如上所述即可。例如，可以提及的是通過向DMEM-F12培養(yǎng)基添加10%胎牛血清，N2補充劑，ΙΟΟμΜ?；撬岷?00ηΜ視黃酸獲得的含血清培養(yǎng)基，補充有適量的血清代替物如市售的KSR的無血清培養(yǎng)基(例如，通過向頂DM和F-12的1:1混合物添加10 %KSR，450μΜ I_一硫代甘油和Ix化學(xué)上明確的脂質(zhì)濃縮物獲得的培養(yǎng)基)等。
[0141]步驟(3)中的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度，CO2濃度，O2濃度可以被適當(dāng)?shù)卮_定。培養(yǎng)溫度是，例如，約30 °C至約40 0C，優(yōu)選地約37 0C。CO2濃度是，例如，約I %至約1 %，優(yōu)選地約5 %。O2濃度不低于約18 %，例如，約20 %至約70 %，優(yōu)選地約20 %至約60 %，更優(yōu)選地約20 %至約 50 %。
[0142]步驟(3)中的培養(yǎng)時間根據(jù)目標(biāo)視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞而變化并且是，例如，約7天至約200天。
[0143]在以此方式進行懸浮培養(yǎng)的團聚體中，含視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞的視網(wǎng)膜組織覆蓋團聚體表面地存在。在完成懸浮培養(yǎng)后，視網(wǎng)膜組織可以通過用固定劑如多聚甲醛溶液固定團聚體，制備冷凍切片，并且通過免疫染色法等確認具有層結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜組織的形成來確認。因為視網(wǎng)膜組織的各個層由不同的視網(wǎng)膜先祖細胞(光感受器，水平細胞，雙極細胞，無長突細胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞)構(gòu)成，所以層結(jié)構(gòu)的形成可以通過使用針對這些細胞中表達的標(biāo)記物的抗體的免疫染色法來確認。
[0144]在包含含有視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的視網(wǎng)膜組織的團聚體中，例如，在團聚體冷凍切片的免疫染色圖像中觀察到RAX陽性組織，并且在其外部沒有觀察到RAX陰性組織。
[0145]因為通過本發(fā)明的制備方法3獲得的視網(wǎng)膜組織含有各視網(wǎng)膜層特有的神經(jīng)元，所以同樣可能的是獲得視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞如光感受器，水平細胞，雙極細胞，無長突細胞和神經(jīng)節(jié)細胞。由獲得的視網(wǎng)膜組織可以獲得什么細胞可以通過本身已知的方法(例如，細胞標(biāo)記物的表達)來確以。
[0146]包含獲得的含有視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的視網(wǎng)膜組織的團聚體可以原樣地用作用于評估毒性或藥物效力的試劑。同樣可能的是通過對包含含有視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的視網(wǎng)膜組織的團聚體進行分散處理(例如，胰蛋白酶/EDTA處理)，并且通過使用FACS選擇獲得的細胞來獲得高純度的視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞。
[0147]獲得的視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細胞可以直接地被進一步培養(yǎng)，或進行分散處理(例如，胰蛋白酶/EDTA處理)并且在粘附條件下進行進一步培養(yǎng)。在粘附培養(yǎng)的情況中，優(yōu)選地使用細胞粘附性培養(yǎng)容器，例如，用胞外基質(zhì)等(例如，聚-D-賴氨酸，層粘連蛋白，纖連蛋白(f