專利名稱：用于制備重組人生長激素的改良方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人生長激素(hGH)制備的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人生長激素(hGH)，也稱為促生長激素(somatropin) (INN)或促生長素(somatotropin),是由垂體前葉的促生長素細(xì)胞制造和分泌的蛋白質(zhì)激素。通過其對(duì)蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)的代謝的影響，人生長激素在兒童時(shí)期的身體生長和成年時(shí)期的代謝中起到關(guān)鍵作用。人生長激素是191個(gè)氨基酸的單個(gè)多肽鏈，其具有兩個(gè)二硫鍵，一個(gè)位于Cys-53和Cys-165之間，在分子中形成大的環(huán)，而另一個(gè)位于Cys_182和Cys_189之間，在C-末端附近形成小的環(huán)。重組DNA技術(shù)已經(jīng)允許在大量不同系統(tǒng)中生產(chǎn)無限的hGH供應(yīng)。一個(gè)這樣的系統(tǒng)是細(xì)菌，例如大腸桿菌(E.coli)。盡管這種方法已經(jīng)建立得很好并已被廣泛使用，但如一直以來的任何技術(shù)方法一樣，還可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)。當(dāng)重組hGH在大腸桿菌中被表達(dá)為包含體時(shí)，該包含體通常在還原劑和/或離液劑的存在下溶解，由此完全使hGH復(fù)性并促使hGH合適的折疊成為其生物活性形式且減少團(tuán)聚體的形成。發(fā)明概述現(xiàn)在，本發(fā)明提供了，在hGH生產(chǎn)期間，在無需使用還原劑和/或離液劑的情況下，顯著減少團(tuán)聚體形成。在這點(diǎn)上，本發(fā) 明提供了一種用于制備人生長激素的方法，其包括:(i)發(fā)酵生產(chǎn)人生長激素(hGH)的大腸桿菌細(xì)胞；(ii)從所述大腸桿菌細(xì)胞回收包含體，并將所述回收的包含體在堿性pH溶解以提供溶解的hGH ；(iii)任選地凍干溶解的hGH ；其特征在于，所述發(fā)酵在包含錳、鋅、鈷、鑰、鈣、銅和硼作為痕量元素的培養(yǎng)基中進(jìn)行。本發(fā)明還提供一種用于減少在制備人生長激素的過程中形成的人生長激素聚合形式的量的方法，其包括:(i)發(fā)酵生產(chǎn)人生長激素(hGH)的大腸桿菌細(xì)胞；(ii)從所述大腸桿菌細(xì)胞回收包含體，并將所述回收的包含體在堿性pH溶解以提供溶解的hGH ；(iii)任選地凍干溶解的hGH ;其特征在于，所述發(fā)酵在包含錳、鋅、鈷、鑰、鈣、銅和硼作為痕量元素的培養(yǎng)基中進(jìn)行。發(fā)明詳述本發(fā)明的制備人生長激素的方法包括以下步驟:(i)發(fā)酵生產(chǎn)人生長激素(hGH)的大腸桿菌細(xì)胞；
( )從所述大腸桿菌細(xì)胞回收包含體，并將所述回收的包含體在堿性pH溶解以提供溶解的hGH ；(iii)任選地凍干溶解的hGH ；其特征在于，所述發(fā)酵在包含錳、鋅、鈷、鑰、鈣、銅和硼作為痕量元素的培養(yǎng)基中進(jìn)行。本發(fā)明的減少在制備人生長激素的過程中形成的人生長激素聚合形式的量的方法包括以下步驟:(i)發(fā)酵生產(chǎn)人生長激素(hGH)的大腸桿菌細(xì)胞；(ii)從所述大腸桿菌細(xì)胞回收包含體，并將所述回收的包含體在堿性pH溶解以提供溶解的hGH ；(iii)任選地凍干溶解的hGH ；其特征在于，所述發(fā)酵在包含錳、鋅、鈷、鑰、鈣、銅和硼作為痕量元素的培養(yǎng)基中進(jìn)行。如本文中可交換使用的，“人生長激素”和“hGH”應(yīng)當(dāng)被理解為包括具有191個(gè)氨基酸的重組人生長激素或者具有192個(gè)氨基酸的Met-hGH ( S卩，在N末端有一個(gè)額外的甲硫氨酸的hGH)。如本文所使用的，“hGH聚合形式”應(yīng)被理解為包括不是具有191個(gè)氨基酸的hGH或具有192個(gè)氨基酸的hGH(在N末端有一個(gè)額外的甲硫氨酸的hGH)的任何形式的hGH，如，但不限于hGH的 二聚物和低聚物。如本文所使用的，“培養(yǎng)基”應(yīng)當(dāng)被理解為包括發(fā)酵罐培養(yǎng)基和/或生產(chǎn)培養(yǎng)基?？梢酝ㄟ^常規(guī)手段提供在培養(yǎng)基中的痕量元素，例如通過使用市售的痕量元素的鹽，包括它們的酸和堿，以及水合物。可以以固體鹽的形式或者含有一種以上所述鹽的水溶液的形式，將它們引入培養(yǎng)基中。在一個(gè)實(shí)施方案中，它們以痕量元素溶液的形式被添加，所述痕量元素溶液包含預(yù)定濃度的每種痕量元素。痕量元素溶液還可以含有酸或堿以調(diào)節(jié)pH,并且例如,將痕量元素保持在溶液中?？梢允褂美缫凰狭蛩徨i(MnSO4.H2O)提供作為痕量元素的錳?？梢酝ㄟ^使用例如七水合硫酸鋅(Ζη504.7H20)提供作為痕量元素的鋅?？梢酝ㄟ^使用例如六水合氯化鈷(CoCl2.6H20)提供作為痕量元素的鈷?？梢允褂美缍翔€酸鈉(NaMoO4.2H20)提供作為痕量元素的鑰?？梢允褂美缍下然}(CaCl2.2H20)提供作為痕量元素的鈣?？梢允褂美缥逅狭蛩徙~(Co504 *5H20)提供作為痕量元素的銅?？梢允褂美缗鹚?H3BO3)提供作為痕量元素的硼。也可以提供鐵作為痕量元素。痕量元素以以下濃度范圍(基于培養(yǎng)基的總體積)范圍”)存在于培養(yǎng)基中，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，以所指示的具體濃度(“實(shí)施方案”)存在:
權(quán)利要求
1.一種用于制備人生長激素(hGH)的方法，所述方法包括: (i)發(fā)酵生產(chǎn)人生長激素(hGH)的大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞； ( )從所述大腸桿菌細(xì)胞回收包含體，并將所述回收的包含體在堿性PH溶解以提供溶解的hGH ； (iii)任選地凍干溶解的hGH ； 其特征在于，所述發(fā)酵在包含錳、鋅、鈷、鑰、鈣、銅和硼作為痕量元素的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含基于所述培養(yǎng)基的總體積的以下濃度的痕量元素:錳 4.9 μΜ鋅 8.0 μΜ鈷 7.0 μΜ鍆 6.9 μΜ鈣 16.9 μΜ銅 6.1 μΜ硼 6.7 μΜ。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述痕量元素以痕量元素溶液的形式添加至所述培養(yǎng)基中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述痕量元素溶液包含lg/L—水合硫酸錳，和/或其中所述痕量元素溶液包含約2.8g/L七水合硫酸鋅,和/或其中所述痕量元素溶液包含2g/L六水合氯化鈷,和/或其中所述痕量元素溶液包含2g/L 二水合鑰酸鈉,和/或其中所述痕量元素溶液包含3g/L 二水合氯化鈣，和/或其中所述痕量元素溶液包含1.85g/L五水合硫酸銅，和/或其中所述痕量元素溶液包含0.5g/L硼酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述痕量元素溶液包含lg/L—水合硫酸錳、2.78g/L七水合硫酸鋅、2g/L六水合氯化鈷、2g/L 二水合鑰酸鈉、3g/L 二水合氯化鈣、1.85g/L五水合硫酸銅和0.5g/L硼酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述堿性PH為約10至約12.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述堿性pH為約12。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(ii)不包括使用還原劑和離液劑。
9.一種用于減少在制備人生長激素(hGH)的過程中形成的人生長激素聚合形式的量的方法，所述方法包括: (i)發(fā)酵生產(chǎn)人生長激素的大腸桿菌細(xì)胞； (ii)從所述大腸桿菌細(xì)胞回收包含體，并將所述回收的包含體在堿性PH溶解以提供溶解的hGH ； (iii)任選地凍干溶解的hGH ； 其特征在于，所述發(fā)酵在包含錳、鋅、鈷、鑰、鈣、銅和硼作為痕量元素的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含基于所述培養(yǎng)基的總體積的以下濃度的痕量元素:猛 4.9 μΜ鋝 8.0 μΜ鈷 7.0 μΜ鉬 6.9 μΜ鈣 16.9 μΜ銅 6.1 μΜ硼 6.7 μΜ。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述痕量元素以痕量元素溶液的形式添加至所述培養(yǎng)基中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述痕量元素溶液包含lg/L—水合硫酸錳，和/或其中所述痕量元素溶液包含約2.8g/L七水合硫酸鋅,和/或其中所述痕量元素溶液包含2g/L六水合氯化鈷,和/或其中所述痕量元素溶液包含2g/L 二水合鑰酸鈉,和/或其中所述痕量元素溶液包含3g/L 二水合氯化鈣，和/或其中所述痕量元素溶液包含1.85g/L五水合硫酸銅，和/或其中所述痕量元素溶液包含0.5g/L硼酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述痕量元素溶液包含lg/L—水合硫酸錳、2.78g/L七水合硫酸鋅、2g/L六水合氯化鈷、2g/L 二水合鑰酸鈉、3g/L 二水合氯化鈣、1.85g/L五水合硫酸銅和0.5g/L硼酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述堿性pH為約10至約12.5。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述堿性pH為約12。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中步驟(ii)不包括使用還原劑和離液劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于制備人生長激素的改良方法。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103119056SQ201180045528
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者多夫·坎納, 埃利·施梅爾 申請(qǐng)人:輝凌公司