技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可溶性配體結(jié)合蛋白及其結(jié)構(gòu)與模型在配體門(mén)控離子通道配體篩選中的用途。

背景技術(shù)：
乙酰膽堿受體(nicotinicacetylcholinereceptor)是位于細(xì)胞膜上的重要功能性蛋白，屬于半胱氨酸環(huán)配體門(mén)控離子通道超家族。在神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)與肌肉連接處介導(dǎo)快速膽堿能。乙酰膽堿受體是跨膜蛋白復(fù)合體，由五個(gè)亞基組成，分布在細(xì)胞表面，這五個(gè)亞基環(huán)形排列形成一個(gè)中央離子通道。它們就像一個(gè)分子開(kāi)關(guān)，當(dāng)與乙酰膽堿等配體結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變，通道就會(huì)打開(kāi)允許離子進(jìn)出細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞電勢(shì)變化和電流變化，從而完成神經(jīng)信號(hào)的傳遞。乙酰膽堿受體廣泛分布于人類、動(dòng)物和昆蟲(chóng)等生物的神經(jīng)系統(tǒng)中，同時(shí)具有神經(jīng)遞質(zhì)受體和離子通道的功能，調(diào)控生物體的神經(jīng)傳遞及相應(yīng)的生理機(jī)能，維持生物體的正常生命活動(dòng)。在人類中乙酰膽堿受體與阿爾茲海默癥(老年性癡呆)、重癥肌無(wú)力及帕金森癥等疾病密切相關(guān)。很多的藥物和相關(guān)療法的靶標(biāo)即是乙酰膽堿受體。類似的，在昆蟲(chóng)中，煙堿型乙酰膽堿受體(nachrs)作為昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)受體，是新煙堿類、多殺菌素類、沙蠶毒素類、砜亞胺類、丁烯酸內(nèi)酯類等多類殺蟲(chóng)劑和天然產(chǎn)物煙堿等的作用靶標(biāo)，在害蟲(chóng)治理及殺蟲(chóng)劑開(kāi)發(fā)中占有非常重要的地位。另外，乙酰膽堿受體蛋白也是一些獸藥的作用靶標(biāo)，用于治療哺乳動(dòng)物的寄生蟲(chóng)病等。因此，乙酰膽堿受體對(duì)于無(wú)論是醫(yī)藥、獸藥還是殺蟲(chóng)劑等配體化合物的開(kāi)發(fā)與創(chuàng)制具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

乙酰膽堿受體是由5個(gè)跨膜蛋白單體組成的蛋白復(fù)合體，對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的研究非常困難，因此利用乙酰膽堿受體進(jìn)行配體篩選，繼而開(kāi)發(fā)相應(yīng)的藥物或殺蟲(chóng)劑，也面臨著巨大的困難。與乙酰膽堿受體不同，乙酰膽堿結(jié)合蛋白(acetylcholinebindingprotein)是由多個(gè)蛋白單體組成的可溶性蛋白復(fù)合體，其功能結(jié)構(gòu)域與乙酰膽堿受體等配體門(mén)控離子通道受體的非跨膜胞外功能區(qū)極其相似。乙酰膽堿結(jié)合蛋白的可溶性及其功能結(jié)構(gòu)域與配體門(mén)控離子通道受體功能區(qū)相似的特點(diǎn)，使得乙酰膽堿結(jié)合蛋白非常適用于配體門(mén)控離子通道受體的配體篩選。雖然目前在水生軟體生物如靜水椎實(shí)螺(lymnaeastagnalis)和海蝸牛(aplysiacalifornica)等中發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿結(jié)合蛋白，但由于水生軟體動(dòng)物乙酰膽堿結(jié)合蛋白與農(nóng)藥、醫(yī)藥、獸藥等藥物親和力低，因此，水生軟體生物的乙酰膽堿結(jié)合蛋白應(yīng)用到昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物及人類非常適用于配體門(mén)控離子通道受體的配體篩選還存在很多不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種來(lái)自蛛形綱(arachnida)物種的乙酰膽堿結(jié)合蛋白用于配體門(mén)控離子通道受體的配體篩選。

本發(fā)明的另一目的是提供一種蛛形綱(arachnida)物種的乙酰膽堿結(jié)合蛋白的制備方法。

本發(fā)明的又一目的是提供一種蛛形綱(arachnida)物種的乙酰膽堿結(jié)合蛋白的應(yīng)用。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的乙酰膽堿結(jié)合蛋白來(lái)自蛛形綱(arachnida)蜘蛛目(araneida)的物種。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述的乙酰膽堿結(jié)合蛋白來(lái)自蛛形綱(arachnida)蜘蛛目(araneida)的擬環(huán)紋豹蛛(pardosapseudoannulata)、美國(guó)流浪蛛(cupienniussalei)、溫室希蛛(parasteatodatepidariorum)、社會(huì)絨蜘蛛(stegodyphusmimosarum)和捕魚(yú)蛛(dolomedessulfureus)。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述的乙酰膽堿結(jié)合蛋白來(lái)自蛛形綱(arachnida)蜘蛛目(araneida)的擬環(huán)紋豹蛛(pardosapseudoannulata)。

一種蛛形綱(arachnida)物種的乙酰膽堿結(jié)合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

(1)克隆乙酰膽堿結(jié)合蛋白并構(gòu)建重組質(zhì)粒；

(2)根據(jù)所選用的人工表達(dá)系統(tǒng)不同，直接使用所述的重組質(zhì)粒，或?qū)⑺龅闹亟M質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得目的基因的crna，或?qū)⑺龅闹亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)染用的病毒；

(3)依據(jù)所選用的人工表達(dá)系統(tǒng)不同，將所述的重組質(zhì)?；騝rna或含有目的重組質(zhì)粒的病毒通過(guò)適用于該人工表達(dá)系統(tǒng)的方法將上述質(zhì)粒或crna或病毒轉(zhuǎn)入到表達(dá)系統(tǒng)中；

(4)依據(jù)所用表達(dá)系統(tǒng)不同，培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，即可表達(dá)獲得乙酰膽堿結(jié)合蛋白。

本發(fā)明所述的乙酰膽堿結(jié)合蛋白在用于配體門(mén)控離子通道受體的配體篩選中的應(yīng)用。

一種篩選配體門(mén)控離子通道受體的配體的方法，包括以下步驟：將利用本發(fā)明所述的制備方法獲得的昆蟲(chóng)乙酰膽堿受體蛋白復(fù)合體與待篩選配體相接觸、反應(yīng)，檢測(cè)乙酰膽堿結(jié)合蛋白和配體結(jié)合的相應(yīng)參數(shù)及乙酰膽堿結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)的變化，從而完成配體的篩選。

有益效果：

本發(fā)明與現(xiàn)有的配體門(mén)控離子通道受體的配體的方法相比，其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)為：

在進(jìn)化的親緣關(guān)系上蛛形綱物種比水生物種更接近昆蟲(chóng)及哺乳動(dòng)物，因此本發(fā)明中所述的乙酰膽堿結(jié)合蛋白更能體現(xiàn)昆蟲(chóng)及哺乳動(dòng)物配體門(mén)控離子通道受體的結(jié)構(gòu)與功能特性，用本發(fā)明中所述的乙酰膽堿結(jié)合蛋白篩選獲得的配體，可以更加高效的用于昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物和人的配體門(mén)控離子通道受體的配體的開(kāi)發(fā)與創(chuàng)制。

附圖說(shuō)明

附圖1乙酰膽堿結(jié)合蛋白表達(dá)后的檢測(cè)結(jié)果，泳道1為蛋白標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為乙酰膽堿結(jié)合蛋白，泳道3為陰性對(duì)照。(a)變性條件下乙酰膽堿結(jié)合蛋白(pp-achbp)的westernblot檢測(cè)；(b)天然(native)條件下乙酰膽堿結(jié)合蛋白的westernblot檢測(cè)。

附圖2擬環(huán)紋豹蛛(pp-achbp)和靜水椎實(shí)螺(ls-achbp)的乙酰膽堿結(jié)合蛋白對(duì)配體的結(jié)合。(a)對(duì)地棘蛙素的結(jié)合情況；(b)對(duì)銀環(huán)蛇素的結(jié)合情況；(c)對(duì)吡蟲(chóng)啉的結(jié)合情況。

附圖3乙酰膽堿結(jié)合蛋白與吡蟲(chóng)啉的分子對(duì)接。(a)擬環(huán)紋豹蛛乙酰膽堿結(jié)合蛋白(pp-achbp)與吡蟲(chóng)啉的分子對(duì)接；(b)靜水椎實(shí)螺的乙酰膽堿結(jié)合蛋白(ls-achbp)與吡蟲(chóng)啉的分子對(duì)接。

具體實(shí)施方案

實(shí)施例1

1.本實(shí)施例以來(lái)源擬環(huán)紋豹蛛的乙酰膽堿結(jié)合蛋白，以sf9細(xì)胞為人工表達(dá)系統(tǒng)，來(lái)說(shuō)明具體實(shí)施方式，但本方法并不局限于本例所述的材料和表達(dá)系統(tǒng)。同時(shí)，使用sf9細(xì)胞人工表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)1為目前發(fā)現(xiàn)的水生軟體動(dòng)物中的乙酰膽堿結(jié)合蛋白，具體為靜水椎實(shí)螺(lymnaeastagnalis)的乙酰膽堿結(jié)合蛋白。對(duì)照實(shí)驗(yàn)并非本方法必須的實(shí)驗(yàn)，此處是為了證明本方法真實(shí)有效。

目的基因的克隆和質(zhì)粒構(gòu)建

(1)取擬環(huán)紋豹蛛頭胸部約100mg，用trizol法提取總rna，以提取的總rna為模板合成cdna第一條鏈；

(2)查詢ncbi(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得擬環(huán)紋豹蛛和靜水椎實(shí)螺的乙酰膽堿結(jié)合蛋白的基因序列，擬環(huán)紋豹蛛的乙酰膽堿結(jié)合蛋白(pp-achbp1)的登陸號(hào)為ky765678，靜水椎實(shí)螺的乙酰膽堿結(jié)合蛋白(ls-achbp)的登陸號(hào)為aak64377.1。然后設(shè)計(jì)引物，以步驟(1)合成的cdna第一條鏈為模板，通過(guò)rt-pcr方法分別克隆上述基因中包含的cds序列。

(3)pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)dna片段；

(4)回收的目標(biāo)片段分別通過(guò)transpeasy-bluntcloningkit插入至peasy-blunt載體中，插入位點(diǎn)分別為pp-achbp1，bamhi和xbai；ls-achbp，bamhi和xbai。然后轉(zhuǎn)化到t1大腸桿菌，涂于含x-gal0.02g/ml、iptg0.2g/ml以及氨芐青霉素50ng/ml的lb培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，過(guò)夜；

(5)通過(guò)挑選白色單菌落，篩選陽(yáng)性重組子，并測(cè)序驗(yàn)證；

(6)使用各亞基片段對(duì)應(yīng)的dna限制性內(nèi)切酶及dnat4連接酶將驗(yàn)證過(guò)的目標(biāo)片斷分別切下并分別重新插入含有啟動(dòng)子及抗性基因(如抗氨芐青霉素基因等)的質(zhì)粒中(本實(shí)例中使用的為pfastbac1，抗氨芐青霉素，購(gòu)買(mǎi)自invitrogen公司)，插入位點(diǎn)與步驟4中敘述的插入位點(diǎn)相同。然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh10bac，涂于含有抗性(慶大霉素、四環(huán)素和卡那霉素三種抗生素)的lb固體培養(yǎng)基平板上的lb培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，過(guò)夜，挑選白色單菌落，獲取重組質(zhì)粒。

(7)用慶大霉素、四環(huán)素和卡那霉素三種抗生素的lb培養(yǎng)液將重組子擴(kuò)增，提取獲得乙酰膽堿結(jié)合蛋白的重組質(zhì)粒。

2.sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染

使用iireagent轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑盒的使用說(shuō)明，將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到sf9細(xì)胞中，獲得重組桿狀病毒。

3.目的蛋白的表達(dá)

在培養(yǎng)皿中加入細(xì)胞活力大于95％的sf9細(xì)胞，27℃培養(yǎng)箱中靜置1h，加入每孔終體積1/20的高滴度病毒，輕輕搖勻，27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)72h后吸取培養(yǎng)基，1500g離心5min，上清液即包含目的蛋白。圖1a為上清液westernblot的檢測(cè)結(jié)果，表明pp-achbp1已經(jīng)成功表達(dá)。圖1b為上清液nativewesternblot的檢測(cè)結(jié)果，表明pp-achbp1能夠形成多聚體。

4.目的蛋白純化

蛋白純化可以利用本領(lǐng)域中多種常規(guī)技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)。本實(shí)施例中使用親和層析方法獲得2μg/ml的純化蛋白，用于配體結(jié)合能力的檢測(cè)。

5.本實(shí)施例中使用放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了地棘蛙素、銀環(huán)蛇素和吡蟲(chóng)啉三種配體與擬環(huán)紋豹蛛和靜水椎實(shí)螺的乙酰膽堿結(jié)合蛋白結(jié)合能力的差異。圖2a-c分別顯示出地棘蛙素、銀環(huán)蛇素和吡蟲(chóng)啉與擬環(huán)紋豹蛛的乙酰膽堿結(jié)合蛋白(pp-achbp)和靜水椎實(shí)螺的乙酰膽堿結(jié)合蛋白(ls-achbp)的不同結(jié)合能力。結(jié)果表明，擬環(huán)紋豹蛛的乙酰膽堿結(jié)合蛋白(pp-achbp)對(duì)吡蟲(chóng)啉具有更高的結(jié)合能力。這表明擬環(huán)紋豹蛛的乙酰膽堿結(jié)合蛋白(pp-achbp)在不同配體間存在選擇性，更有利于藥物的篩選。

實(shí)施例2

本實(shí)例選取ls-achbp的2zju為模板，通過(guò)構(gòu)建乙酰膽堿結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型和分子對(duì)接來(lái)說(shuō)明具體實(shí)施方式，但本方法并不局限于本例所述的模板和軟件包。同時(shí)，使用ls-achbp的晶體結(jié)構(gòu)做為分子對(duì)接的對(duì)照，對(duì)照實(shí)驗(yàn)并非本方法必須的實(shí)驗(yàn)，此處是為了證明本方法真實(shí)有效。

選取ls-achbp的2zju為模板，利用discoverystudio3.5軟件包(accelrysinc.)，參照discoverystudio的使用說(shuō)明，對(duì)pp-achbp進(jìn)行同源模建獲得pp-achbp的三維結(jié)構(gòu)模型，然后通過(guò)分子對(duì)接，分析乙酰膽堿結(jié)合蛋白對(duì)配體吡蟲(chóng)啉的結(jié)合能力。分子對(duì)接結(jié)果(圖3)表明，pp-achbp與吡蟲(chóng)啉的作用更強(qiáng)。

本發(fā)明為詳細(xì)記載的內(nèi)容，如已知基因的克隆、蛋白純化和分子對(duì)接等均可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)。