專利名稱：乙酰膽堿增強(qiáng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及喹啉衍生物，更具體地說，本發(fā)明涉及屬于乙酰膽堿增強(qiáng)劑的喹啉衍生物，特別涉及乙酰膽堿增強(qiáng)劑N-[2-(1-芐基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氫-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮富馬酸單鹽，后面稱作化合物A(“Cm.A”)。
背景技術(shù)：
阿耳茨海默氏病(早老性癡呆，或“AD”)是一種病因?qū)W不明的疾病。AD的普遍有害作用是認(rèn)知功能的逐漸缺失。目前研究了若干治療該疾病的途徑。然而，迄今為止，只有一種途徑顯示有足夠的臨床安全性和有效性因而被美國食品和藥物管理局(“FDA”)批準(zhǔn)可以上市。這種治療途徑集中于抑制乙酰膽堿酯酶(“AChE”)。AChE是一種降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(“ACh”)的酶。降解過程被抑制后，ACh神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)裂縫中停留的時(shí)間延長，從而增加該神經(jīng)遞質(zhì)的化學(xué)和功能效果例如增強(qiáng)認(rèn)知功能。FDA批準(zhǔn)了兩種這樣的AChE抑制劑1,2,3,4-四氫-9-吖啶胺(即“他克林”，THA；“COGNEX”)和donepezil(E2020；“ARICEPT”)。歐洲允許上市的AChE抑制劑為rivastigmine(ENA713；“EXELON”)。這三種化合物明顯的副作用是惡心和/或嘔吐。這種副作用限制了醫(yī)師對(duì)病人按照沒有副作用的最大劑量用藥，顯然是因?yàn)槔邕@種副作用可能使病人不服用所有需要的劑量，或者這種副作用可能導(dǎo)致病人完全停止服用這種藥物。
當(dāng)AChE的抑制是解決AD相關(guān)性臨床缺陷的一種途徑時(shí)，另一種途徑可能增加ACh的產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道，5-羥色胺5-HT3受體拮抗劑增加了ACh的神經(jīng)釋放。參見例如Ramirez,M.J等.,712:2腦研究(BrainRes)274(1996)；Crespi,D.，等35:4藥理學(xué)研究(Pharmacol.Res)351(1997)；和Roychoudhurg,M.和Kulkani,S.K.,19:1 Methods FindExp.Clin.Pharmacol.43(1997)。另外據(jù)報(bào)道，與年齡相當(dāng)?shù)膶?duì)照組相比，患有AD的病人中5-HT3受體認(rèn)知部位的濃度沒有變化，可參見Barnes,N.M.,等.,1:3-4神經(jīng)報(bào)道(Neuroreport)253(1990)。另外還報(bào)道了5-HT3受體拮抗劑能夠抑制嘔吐，參見Parikh,P.M.等在印度癌癥雜志(Indian J.Cancer)33:1,17(1996)。
在USP 5,190,951、USP 5,540,934和USP 5,300,517中公開了喹啉衍生物具有AChE活性。
需要具有多重治療機(jī)理的化合物。例如，對(duì)于治療神經(jīng)學(xué)疾病例如AD來說，優(yōu)選既能抑制AChE活性又能增加ACh神經(jīng)產(chǎn)生的化合物，這樣在臨床上把ACh、AChE抑制和AD之間建立了有益的聯(lián)系。本發(fā)明正是涉及這種以及其它重要目的。
發(fā)明的公開本發(fā)明提供ACh增強(qiáng)劑的精選的喹啉衍生物。在優(yōu)選的方案中，提供具有下列結(jié)構(gòu)的乙酰膽堿增強(qiáng)劑
在一些優(yōu)選的方案中，乙酰膽堿增強(qiáng)劑是上述化合物的可藥用鹽。特別優(yōu)選的ACh增強(qiáng)劑為N-[2-(1-芐基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氫-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮，即 在一個(gè)非常特別優(yōu)選的實(shí)施例中，乙酰膽堿增強(qiáng)劑為N-[2-(1-芐基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氫-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮，富馬酸單鹽，即 此處稱作化合物A(“Cm.A.”)。
本發(fā)明還提供在含有乙酰膽堿酯酶和5-羥色胺5HT3受體的系統(tǒng)中既抑制乙酰膽堿酯酶又拮抗5-羥色胺5HT3受體的方法。在優(yōu)選的方案中，這些方法包括把優(yōu)先選自下式化合物或其可藥用鹽的乙酰膽堿增強(qiáng)劑引入到系統(tǒng)中
在更優(yōu)選的方案中，化合物是 或其可藥用鹽。在更特別優(yōu)選的方案中，乙酰膽堿增強(qiáng)劑具有下式結(jié)構(gòu) 本發(fā)明還提供含有乙酰膽堿增強(qiáng)劑的藥物組合物。在優(yōu)選的方案中，藥物組合物含有下式化合物 或其可藥用鹽。
在更優(yōu)選的方案中，藥物組合物含有下式化合物 或其可藥用鹽，其中可藥用鹽優(yōu)選 本發(fā)明還提供既抑制乙酰膽堿酶又拮抗5-羥色胺5HT3受體的方法，包括對(duì)需要抑制乙酰膽堿酯酶和拮抗5-羥色胺5HT3受體的人提供本發(fā)明的藥物組合物，所述組合物優(yōu)選包括 或 附圖的簡要描述

圖1A顯示N-[2-(1-芐基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氫-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮的結(jié)構(gòu)。
圖1B顯示圖1A的化合物的特別優(yōu)選的鹽N-[2-(1-芐基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氫-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮富馬酸單鹽(“Cm.A”)的結(jié)構(gòu)。
圖2A-F表示在自由活動(dòng)的清醒幼齡大鼠(2A,2C,2E)和成年大鼠(2B,2D,2E)的紋狀體微透析樣品中，Cm.A、他克林(“THA”)和E2020對(duì)Ach細(xì)胞外含量的作用結(jié)果。在第0分鐘給藥化合物(腹膜內(nèi)注射.，如箭頭符號(hào)所示)。對(duì)照組動(dòng)物注射生理鹽水(腹膜內(nèi)注射)。各個(gè)點(diǎn)表示含S.E.M.的平均值(N=4-6)。*,**相對(duì)于對(duì)照組，P＜0.05,0.01。
圖3A-C表示在自由活動(dòng)的清醒大鼠海馬微透析樣品中，Cm.A(3A)、THA(3B)和E2020(3C)對(duì)Ach細(xì)胞外含量的作用結(jié)果。在第0分鐘給藥化合物(腹膜內(nèi)注射.，如箭頭符號(hào)所示)。對(duì)照組動(dòng)物注射生理鹽水(腹膜內(nèi)注射)。各個(gè)點(diǎn)表示含S.E.M.的平均值(N=6)。*,**相對(duì)于對(duì)照組，P＜0.05,0.01。
圖4A-B表示在麻醉大鼠中，Cm.4A和THA(4B)對(duì)5-HT引起的von Bezold-Jarish效應(yīng)(“BJE”)的抑制作用效果圖，每10分鐘注射1個(gè)大丸劑劑量的5-羥色胺。各個(gè)點(diǎn)表示含S.E.M.的平均值。*,**相對(duì)于對(duì)照組，P＜0.05,0.01。
圖5表示在被動(dòng)回避任務(wù)中Cm.A對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶缺失的作用結(jié)果圖。各柱表示含S.E.M.的平均值。##相對(duì)于未處理組P＜0.01。**相對(duì)于對(duì)照組，P＜0.01。
圖6表示在被動(dòng)回避任務(wù)中Cm.A對(duì)環(huán)己酰亞胺誘導(dǎo)的記憶缺失的作用結(jié)果圖。各柱表示含S.E.M.的平均值。##相對(duì)于未處理組P＜0.01。*,**相對(duì)于對(duì)照組，P＜0.05,0.01。
圖7表示在被動(dòng)回避任務(wù)中，用Cm.A和THA進(jìn)行單次處理對(duì)BF-損害誘導(dǎo)的記憶缺失的作用結(jié)果。各柱表示含S.E.M.的平均值。#,##相對(duì)于偽處理組P＜0.05,0.01。*,**相對(duì)于對(duì)照組，P＜0.05,0.01。
圖8表示在被動(dòng)回避任務(wù)中，用Cm.A、THA和E2020進(jìn)行反復(fù)處理對(duì)BF-損害誘導(dǎo)的記憶缺失的作用結(jié)果。各柱表示含S.E.M.的平均值。#,##相對(duì)于偽處理組P＜0.05,0.01。*,**相對(duì)于對(duì)照組，P＜0.05,0.01。
圖9表示在射線迷宮任務(wù)中Cm.A對(duì)由東莨菪堿誘導(dǎo)的空間記憶缺失的作用結(jié)果示意圖。各柱表示含S.E.M.的平均值，*,**相對(duì)于對(duì)照組，P＜0.05,0.01。
圖10表示在射線迷宮任務(wù)中，用Cm.A反復(fù)處理2星期，其對(duì)由SEP損害誘導(dǎo)的空間記憶缺失的作用結(jié)果。各柱表示含S.E.M.的平均值，*相對(duì)于對(duì)照組，P＜0.05。
圖11A-B表示在水迷宮任務(wù)中Cm.A(11A)和THA(11B)對(duì)東莨膽堿誘導(dǎo)的空間記憶缺失的作用結(jié)果示意圖。各個(gè)點(diǎn)表示10-12只大鼠的平均值。*,**相對(duì)于東莨膽堿組，P＜0.05,0.01。
圖12A-C表示在水迷宮任務(wù)中，Cm.A(12A)、THA(12B)和E2020(12C)對(duì)BF-損害誘導(dǎo)的記憶缺失的作用結(jié)果。各個(gè)點(diǎn)表示7-12只大鼠的平均值。*,**相對(duì)于BF-損害對(duì)照組，P＜0.05,0.01。
圖13A-B表示Cm.A(13A)和THA(13B)對(duì)成年大鼠的空間學(xué)習(xí)改進(jìn)結(jié)果示意圖。各個(gè)點(diǎn)表示7-10只大鼠的平均值。*,**相對(duì)于未處理組，P＜0.05,0.01。
圖14A-F為一系列同Cm.A有關(guān)的化合物結(jié)構(gòu)，分別稱為Cm.B-Cm.G，它們都屬于乙酰膽堿增強(qiáng)劑。
圖15是一個(gè)柱狀圖，其總結(jié)了對(duì)動(dòng)物腹膜注射Cm.A以測(cè)定該化合物結(jié)合5HT3受體的能力。
發(fā)明詳述USP 5,190,951、USP 5,540,934和USP 5,300,517公開了用于抑制AChE的喹啉衍生物(包括其鹽及其哌啶衍生物)。這些參考文獻(xiàn)報(bào)道了這些喹啉衍生物用于治療或預(yù)防“癡呆”以及用于治療“患有癡呆或具有患癡呆危險(xiǎn)性”的人。根據(jù)這些參考文獻(xiàn)，老年性癡呆被分為腦血管型和早老性癡呆型兩大類。在上述專利文獻(xiàn)中還公開了制備這些喹啉衍生物的方法，同時(shí)還報(bào)道了在這些喹啉衍生物中精選的化合物顯示具有抗AChE活性以及具有改善東莨膽堿誘導(dǎo)的記憶缺失的作用。上述專利文獻(xiàn)全文在此引入作為參考。
據(jù)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明，在上述文獻(xiàn)中公開的所選擇的化合物(包括Cm.A)還屬于5-HT3受體的強(qiáng)拮抗劑。5-HT3受體的拮抗劑特別能夠?qū)е律窠?jīng)遞質(zhì)ACh的神經(jīng)釋放(例如.,Ramirez，文章同上)。在腸內(nèi)壁也分布著HT3受體，因此如上所述，5-HT3受體拮抗劑可防止嘔吐反應(yīng)(例如Parikh，文章同上)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，臨床上已經(jīng)評(píng)價(jià)并且被美國批準(zhǔn)上市的AChE抑制劑的一種最普遍副作用就是嘔吐。而對(duì)于例如AD等疾病來說，可以認(rèn)為這樣的副作用在臨床上是可以接受的，如果這樣化合物的效果是最低限度，則這種臨床上可接受的副作用可能導(dǎo)致病人停止用藥。而且，這樣的副作用可能因?qū)嶋H原因阻止醫(yī)師對(duì)病人提供較高劑量的這種藥品。
因此，如果一個(gè)化合物不但具有多重作用治療模式，并且還有助于降低某些同半機(jī)械學(xué)類似治療有關(guān)的副作用，那么這樣的化合物將在病人和醫(yī)師可用的治療庫上提供巨大的改進(jìn)。此處描述的這些化合物包括Cm.A就是這樣的化合物。
在一些優(yōu)選的方案中，提供具有下列結(jié)構(gòu)的乙酰膽堿增強(qiáng)劑 和上述化合物的可藥用鹽。特別優(yōu)選的ACh增強(qiáng)劑為N-[2-(1-芐基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氫-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮，即 在一個(gè)特別優(yōu)選的方案中，乙酰膽堿增強(qiáng)劑為N-[2-(1-芐基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氫-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮富馬酸單鹽，即 此處稱化合物A(“Cm.A.”)。
本發(fā)明還提供在包括乙酰膽堿酯酶和5-羥色胺5HT3受體的系統(tǒng)中既抑制乙酰膽堿酯酶又拮抗5-羥色胺5HT3受體的方法。在優(yōu)選的方案中，所述方法包括把乙酰膽堿增強(qiáng)劑引入到該系統(tǒng)中，所述乙酰膽堿增強(qiáng)劑優(yōu)先選自下式化合物 和其可藥用鹽。
在一些更優(yōu)選的方案中，所述化合物為 或其可藥用鹽。在更特別優(yōu)選的方案中，所述乙酰膽堿增強(qiáng)劑具有下式結(jié)構(gòu) 本發(fā)明還提供含有乙酰膽堿增強(qiáng)劑的藥物組合物。在優(yōu)選的方案中，所述藥物組合物包括下式化合物 或其可藥用鹽。
在更優(yōu)選的方案中，所述藥物組合物包括下式化合物 或其可藥用鹽，其中的可藥用鹽優(yōu)選 本發(fā)明還提供既抑制乙酰膽堿酶又拮抗5-羥色胺5HT3受體的方法，包括對(duì)需要抑制乙酰膽堿酯酶和拮抗5-羥色胺5HT3受體的人提供本發(fā)明的藥物組合物，所述組合物優(yōu)選包括 或
下面將詳細(xì)描述，Cm.A顯示為AChE抑制劑(參見實(shí)施例2)和5-HT3受體拮抗劑(能夠增加神經(jīng)性ACh的釋放)(參見實(shí)施例4)，并且同相同劑量的THA和E2020相比，Cm.A顯示沒有這兩個(gè)化合物所具有的副作用例如嘔吐(參見實(shí)施例1，下同)。由于具有雙重機(jī)理(抑制AChE和拮抗5-HT3受體)，本發(fā)明化合物(例如Cm.A.)在此稱為“乙酰膽堿(ACh)增強(qiáng)劑”。
已經(jīng)指出，在上面的美國專利參考文獻(xiàn)中已經(jīng)公開了制備這樣的化合物的方法。此處公開的化合物可藥用鹽包括可藥用的酸加成鹽、金屬鹽、銨鹽、有機(jī)胺加成鹽和氨基酸加成鹽。酸加成鹽的例子為無機(jī)酸加成鹽例如鹽酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽，和有機(jī)酸加成鹽例如乙酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽和乳酸鹽；金屬鹽的例子為堿金屬鹽如鋰鹽、鈉鹽和鉀鹽，堿土金屬鹽如鎂鹽和鈣鹽，鋁鹽和鋅鹽；銨鹽的例子為銨鹽和四甲基銨鹽；有機(jī)胺加成鹽的例子為同嗎啉和哌啶加成的鹽；氨基酸加成鹽的例子為甘氨酸鹽、苯丙氨酸鹽、谷氨酸鹽和賴氨酸鹽。特別優(yōu)選富馬酸單鹽。
根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選方案，把本發(fā)明的組合物或化合物引入到既需要抑制乙酰膽堿酯酶又需要拮抗5-羥色胺5-HT3受體的系統(tǒng)中。此處所用的術(shù)語“引入到…系統(tǒng)中”指把所需要的化合物或組合物以同活性組份一致的方式放入系統(tǒng)中，這樣既引起系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的抑制，同時(shí)又拮抗系統(tǒng)中存在的5-羥色胺5-HT3受體。術(shù)語“系統(tǒng)”即包括生物體特別是哺乳動(dòng)物尤其是人，又包括體外系統(tǒng)例如診斷檢測(cè)等。因此應(yīng)該認(rèn)識(shí)到可以通過多種途徑把本發(fā)明的化合物和組合物引入到系統(tǒng)中。在更優(yōu)選的方案中，所述系統(tǒng)為既需要抑制乙酰膽堿酯酶又需要拮抗5-羥色胺5HT3受體的病人例如AD病人。因此，“引入到系統(tǒng)中”包括給藥至病人。
含有公開的化合物的優(yōu)選藥物組合物為片劑；假設(shè)是例如AD疾病，優(yōu)選該治療劑經(jīng)口服給藥。然而，還可以發(fā)現(xiàn)其它給藥途徑用于本發(fā)明方法。因此，此處提供的化合物可以通過同可藥用非毒性賦形劑和載體混合制備成藥物組合物。如前所述，由于AD的特性，雖然優(yōu)選口服給藥，特別是以片劑或膠囊的形式，但有用的組合物也可以制備成用于胃腸外給藥劑型，包括液體溶液劑或栓劑；鼻內(nèi)給藥劑型特別是粉劑、滴鼻劑或氣霧劑；或者經(jīng)皮給藥劑型例如透皮貼劑。
本發(fā)明的組合物可以方便地以單位劑型給藥，可以通過藥物領(lǐng)域公知的任意方法制備，例如通過雷明頓藥物學(xué)(Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,Easton,PA,1980)。胃腸外給藥制劑可以含有下列物質(zhì)作為通常的賦形劑，例如無菌水或生理鹽水、聚二元醇類例如聚乙二醇、油和植物源以及氫化萘等。特別地，生物可兼容的、生物可降解的交酯類聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或者聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以作為有用的賦形劑用于控制活性化合物的釋放。這些活性化合物的其它非常有用的胃腸外給藥系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入性輸注系統(tǒng)和脂質(zhì)體。吸入給藥制劑含有例如乳糖作為賦形劑，或者可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨膽酸酯或者脫氧膽酸酯的水溶液，或者是滴鼻劑形式給藥的油性溶液或者鼻內(nèi)給藥的凝膠。胃腸外給藥制劑還可以含有用于頰給藥的甘氨膽酸鹽(酯)、直腸給藥的水楊酸鹽(酯)或陰道給藥的檸檬酸。透皮貼片制劑是優(yōu)選的親脂性乳劑。
根據(jù)一系列因素包括給藥劑量、所用化合物的化學(xué)特性(例如疏水性)和給藥途徑，此處所描述的化合物在治療組合物中的濃度可以變化。一般來說，可以在含有0.1-10％w/v的胃腸外給藥化合物的水性生理緩沖溶液中提供本發(fā)明的化合物。優(yōu)選的給藥劑量可能取決于下列因素例如疾病或病癥的類型和進(jìn)展程度、具體病人的總體健康狀況、所選化合物的相對(duì)生物效應(yīng)和化合物輔料制劑以及給藥途徑。
可以在藥物組合物中應(yīng)用本發(fā)明的化合物作為唯一的活性成分?；蛘?，本發(fā)明的化合物可以同其它活性成分聯(lián)合用藥。
提過下列實(shí)施例可以更進(jìn)一步說明本發(fā)明，這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明，它們不能被認(rèn)為并且不是用于限制本發(fā)明的范圍或權(quán)利要求書的范圍。實(shí)施例在下列實(shí)施例中的化合物由SSP公司(以前為日本東京SS制藥公司(SS Pharmaceuticals,Co.,Tokyo,Japan)提供。實(shí)施例1肝毒性分析A．2周研究為了研究Cm.A、THA和E2020的肝毒性，把它們分別以5mg/kg/天的劑量口服給藥至Cynomologous猴，每天給藥一次，共給藥2周。檢測(cè)下列參數(shù)體重、臨床指征、食物消耗量、血液生化參數(shù)(GOT、GPT、ALP、LDH、γ-GTP、ChE、Bil、T.Pro、Alb、A/G比、T.Cho、NEFA、TG)。給藥期間結(jié)束后，處死動(dòng)物，進(jìn)行尸體剖檢。對(duì)器官和組織稱重，然后進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。
給藥期間，THA和E2020引起偶然的嘔吐反應(yīng)和軟糞便(或腹瀉)；Cm.A也引起軟糞便，但程度比另兩個(gè)化合物輕。對(duì)于用E2020給藥的猴，食物消耗量明顯減少，體重明顯減輕。給藥THA或E2020引起血液生化參數(shù)的明顯變化在THA處理組，ALP和TG升高；在E2020處理組，LDH、T.Cho、NEFA和TG升高。在所有給藥組中，尸體剖檢、器官重量檢測(cè)和組織病理學(xué)檢測(cè)均沒有檢測(cè)到太多的變化。檢測(cè)結(jié)果總結(jié)在表1中。
表1Cm.A、THA和E2020(口服2周)的肝毒性總結(jié)
-沒有明顯變化 ↑升高；↓降低+輕微++嚴(yán)重(腹瀉)這些結(jié)果支持的觀點(diǎn)是同THA和E2020相比，Cm.,A具有較低的總毒性；Cm.A不顯示肝毒性。
B．4周研究把Cm.A、THA或E2020口服給藥至Cynomologous猴，給藥四(4)周。測(cè)試期間，用三種不同方案對(duì)動(dòng)物給藥第一種方案，以10mg/kg/天的劑量對(duì)動(dòng)物給藥7天，然后經(jīng)32天沖刷期；第二種方案，以5mg/kg/天的劑量對(duì)動(dòng)物給藥14天，然后以10mg/kg/天的劑量對(duì)動(dòng)物給藥7天。檢測(cè)下列參數(shù)體重、臨床指征、食物消耗量、血液生化參數(shù)(GOT、GPT、ALP、LDH、γ-GTP、ChE、Bil、T.Pro、Alb、A/G比、T.Cho、NEFA、TG)。
THA和E2020顯示嚴(yán)重的嘔吐反應(yīng)；同時(shí)還觀測(cè)到軟糞便或腹瀉，體重減輕，食物消耗量減少；某些血液生化參數(shù)的變化(TG和NEFA升高，ChE和T.Cho降低)也非常明顯。用Cm.A處理的動(dòng)物顯示極小的不利臨床指征，食物消耗量和體重沒有明顯變化。在Cm.A處理的動(dòng)物組中觀測(cè)到TG略微升高。結(jié)果總結(jié)在表2中。
表2Cm.A、THA和E2020(口服4周)的肝毒性總結(jié)
-沒有明顯變化↑升高；↓降低± 數(shù)次+++多次這些結(jié)果證明同等劑量下，與THA和E2020相比，Cm.A在這些檢測(cè)參數(shù)方面顯示較少的毒性特征。實(shí)施例2對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用用Cm.A、THA或E2020對(duì)Wistar大鼠口服給藥。1小時(shí)后，處死大鼠，分離出腦部，將其分成若干部分。通過Ellman’s方法測(cè)定在海馬、紋狀體、前皮層和頂骨皮層中AChE的活性。參見，Ellman,G.L.，等.，7生化藥物學(xué)(Biochem.Pharmacol.)88(1961)。結(jié)果總結(jié)于表3。
表3Cm.A、THA和E2020對(duì)在不同腦部位中AChE活性的作用
*.**相對(duì)于對(duì)照值P＜0.05,0.01表3中結(jié)果證明THA和E2020在相當(dāng)高的劑量下顯示抑制海馬中的AChE活性；Cm.A以非劑量依賴性方式抑制AChE(即所有劑量)。實(shí)施例3乙酰膽堿的釋放A．對(duì)紋狀體中ACh釋放的作用應(yīng)用自由活動(dòng)的大鼠，經(jīng)微透析系統(tǒng)，通過HPLC和ECD方法，連續(xù)檢測(cè)從大鼠腦紋狀體(前囟，A:0.2mm,L:3.0mm,H:4.0mm)中得到的灌注液中的ACh含量。參見Messamore,E.，等，32神經(jīng)藥理學(xué).291(1993)和Kawashima,K.，等，350 Naunyn-Schmiedeberg’sArch.Pharmacol.523(1994)。經(jīng)超過2小時(shí)的平衡期后，從5份中獲得基本ACh含量。腹膜內(nèi)注射化合物，然后進(jìn)行微透析分析3小時(shí)。結(jié)果總結(jié)于圖2。
在幼齡大鼠(2月齡的Wistar鼠)，Cm.A(10,30mg/kg)以劑量依賴性方式增加灌注液中的ACh含量分別至131％和369％。盡管有這些增加，幾乎沒有顯示中樞作用的膽堿能癥狀(例如震顫、咀嚼和打哈欠)(數(shù)據(jù)未顯示)。另一方面，同Cm.A相比，THA和E2020都更高程度地增加ACh的含量，并且維持時(shí)間更長，但它們同時(shí)顯示前面所述的中樞作用的膽堿能癥狀，同Cm.A相比癥狀更嚴(yán)重(數(shù)據(jù)為顯示)。
對(duì)于成年大鼠(25-27月齡的Fischer 344)，也得到在幼齡大鼠中顯示的類似增加，但作用持續(xù)時(shí)間長于幼齡大鼠。E2020在成年大鼠中的作用比在幼齡大鼠中的作用要差一些，這可能是因?yàn)锳Ch的預(yù)處理含量較高的原因(圖2F)。除E2020處理的成年大鼠外，在幼齡Wistar大鼠和幼齡以及成年Fisher344大鼠之間，紋狀體中的基本ACh含量基本相同。
B．對(duì)海馬中ACh釋放的作用應(yīng)用自由活動(dòng)的大鼠，經(jīng)微透析系統(tǒng)，通過HPLC和ECD方法，連續(xù)檢測(cè)從大鼠腦海馬(前囟A:-5.8mm,L:5.0mm,H:4.0mm)中得到的灌注液中的ACh含量。(參見Messamore,E.，和Kawashima,K.，等，350文獻(xiàn)同上)。經(jīng)平衡期后，從5份中獲得基本ACh含量。腹膜內(nèi)注射測(cè)試物質(zhì)，然后進(jìn)行微透析分析3小時(shí)。結(jié)果總結(jié)于圖3。
Cm.A(10,30mg/kg)以劑量依賴性方式增加灌注液中的ACh含量分別為164％和552％。幾乎沒有觀察到中樞作用的膽堿能癥狀(例如震顫、咀嚼和打哈欠)(數(shù)據(jù)未顯示)。THA和E2020也顯示出類似于用Cm.A所觀測(cè)到的ACh含量增加，但THA的作用較弱些；而且，在增加ACh含量的同時(shí)，實(shí)施例3A中討論的膽堿能癥狀比Cm.A更明顯。實(shí)施例4
5-HT3受體A．體內(nèi)研究-對(duì)外周5-HT3受體的拮抗作用對(duì)麻醉大鼠靜脈注射5-羥色胺大丸劑(5-HT)(20μg/kg)，通過活化大鼠的外周5-HT3受體，暫時(shí)性引起反射性心動(dòng)過緩(von Bezole-Jarish作用B.J.E)。應(yīng)用B.J.E作為模型，測(cè)試了Cm.A、THA和E2020對(duì)外周5-HT3受體的作用。結(jié)果總結(jié)于圖4。
應(yīng)用Cm.A的預(yù)處理以劑量依賴性方式抑制B.J.E(3至10mg/kg，靜脈注射)，血壓和心率沒有變化(數(shù)據(jù)為顯示)。THA顯示略微有降低反射的傾向，但THA在10mg/kg的劑量下引起嚴(yán)重的高血壓、多涎和震顫(數(shù)據(jù)未顯示)。E2020(0.1～1mg/kg，靜脈注射)不顯示對(duì)B.J.E的抑制作用，并且E2020在大于1mg/kg的劑量靜脈注射時(shí)引起高血壓、多涎和震顫(數(shù)據(jù)未顯示)。
B．體外研究-IC50測(cè)定應(yīng)用市售5-羥色胺5-HT3結(jié)合測(cè)試(NovaScreen,Hanover,MD)研究了許多化合物包括Cm.A對(duì)5-HT3受體的結(jié)合親和力。受體源為NIE-115細(xì)胞(參見Lunnis,S.C.R.和Kilparick,G.J.,189:Evr.
Jrnl.Pharmacol.223(1990)；和Hoyer,D.和Heijt,H.C.,33分子藥理學(xué)(Mol.Pharmacol.,)303(1988))。參照化合物為一種5-HT3受體拮抗劑“MDL72222”。在25℃下，讓反應(yīng)在含有150nM氯化鈉的20mMHEPES(pH7.4)中進(jìn)行60分鐘。在玻璃纖維濾器上快速真空過濾終止反應(yīng)。檢測(cè)過濾器上殘留的放射性，并將其同對(duì)照值進(jìn)行比較。
在上述條件下，測(cè)定Cm.A的IC50值為1.18×10-6(相對(duì)地，測(cè)定MDL 72222的IC50值為1.74×10-8)。在上述條件下，測(cè)定Cm.A的Ki值為5.52×10-7(相比較，測(cè)定MDL72222的Ki為8.15×10-9)。表4顯示許多的Cm.A相關(guān)化合物及類似物的IC50和Ki的比較值(按照上面用于CmA同樣的方法測(cè)定)。
表4
Cm.B和Cm.D的IC50值(分別為210nM和83nM；按照上述參考專利文獻(xiàn)中列出的方法確定)同Cm.A的值相當(dāng)。參見圖14A-14F中Cm.B-Cm.G的結(jié)構(gòu)。
C．5HT3受體的體外結(jié)合動(dòng)物把10mg/kg劑量的Cm.A(在90％乙醇、10％水、載體中)(n=3)或載體(n=3)腹膜內(nèi)注射至動(dòng)物(Sprague-Dawley大鼠)。經(jīng)30分鐘后，處死動(dòng)物，迅速解剖腦部，在維持-42℃溫度下的異戊烷中冷凍。在低溫恒溫器中制備切片(水平和冠狀)，在維持-20℃溫度下儲(chǔ)存。
放射自顯影從儲(chǔ)存器中取出腦切片，室溫解凍30分鐘。應(yīng)用在50mMHEPES/TRIS緩沖鹽中的0.5nM(3H)-zacopride(Amerhsam；zacorpide為5-HT3選擇性配體)孵育切片，在這些切片中測(cè)定總5HT3受體結(jié)合。在放射性配體和500nM 5-HT的存在下，測(cè)定所孵育的相鄰切片間的非特異性結(jié)合。室溫培養(yǎng)10分鐘后，在冰冷的緩沖液中洗滌切片(2×10分鐘)，然后用冰冷的蒸餾水洗滌10秒鐘。在冷空氣流中干燥切片過夜。干燥后，把切片同X-射線膠片(Kodak Hyperfilm)接觸，共接觸4個(gè)月。
分析應(yīng)用自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)DAGE照相機(jī)圖像軟件對(duì)放射自顯影圖像進(jìn)行分析。從每組，對(duì)照組(注射載體)和Cm.A中四個(gè)單獨(dú)的測(cè)定中得到平均光學(xué)密度；從不接觸組織的X-射線區(qū)域獲得背景測(cè)定。測(cè)定在稱為“杏仁核”的腦區(qū)域進(jìn)行。結(jié)果如圖15中的柱形格式所示。這些結(jié)果表明化合物Cm.A占據(jù)了腦內(nèi)部5HT3受體部位，因?yàn)樵趯?duì)照的腦切片中，監(jiān)測(cè)出放射標(biāo)記的5HT3選擇性配體的無能。實(shí)施例5抗健忘研究A、被動(dòng)回避應(yīng)用雄性Wistar大鼠，應(yīng)用分段通過型(step through-type)、2-隔室(光和暗)箱進(jìn)行被動(dòng)回避研究。在認(rèn)知試驗(yàn)中，在動(dòng)物進(jìn)入黑暗區(qū)域的時(shí)候，關(guān)閉截?cái)嚅T，用電刺激動(dòng)物(0.5-0.8mA，3秒)。24小時(shí)后，進(jìn)行停留試驗(yàn)把大鼠放于光亮區(qū)域，測(cè)定動(dòng)物進(jìn)入到黑暗區(qū)域之前的時(shí)間(潛伏期)。截止?jié)摲谠O(shè)為600秒。在認(rèn)知試驗(yàn)前30分鐘口服測(cè)試物質(zhì)。
1、東茛膽堿誘導(dǎo)的記憶缺失在認(rèn)知試驗(yàn)前15分鐘讓大鼠腹膜內(nèi)注射東莨膽堿(0.5mg/kg)15分鐘。同未處理組相比，東莨膽堿明顯縮短了潛伏期。在0.1、0.3和3.0mg/kg的劑量下，Cm.A明顯逆轉(zhuǎn)了東莨膽堿的效應(yīng)，結(jié)果總結(jié)于圖5。
2、環(huán)己酰亞胺誘導(dǎo)的記憶缺失在電刺激后，立即用環(huán)己酰亞胺(1.5mg/kg)，一種蛋白合成的抑制劑，s.q.處理大鼠。同未處理組相比，環(huán)己酰亞胺還明顯縮短了潛伏期。Cm.A以非劑量依賴性方式延長了環(huán)己酰亞胺誘導(dǎo)的縮短的潛伏期。結(jié)果總結(jié)于圖6。
3、基體前腦(BF)損害誘導(dǎo)的記憶缺失應(yīng)用Paxinos.G和Watston,C:The Rat Brain in StereotaxicCoosrdinates，第2版，Academic Press,San Diego,CA(1986)中的趨實(shí)體性圖片集，在兩側(cè)鑒定基體前腦(前囟，A:1.4mm,L:±2.6mm,H:-7.0mm)，從其中插入一對(duì)微量調(diào)節(jié)注射器，通過該注射器注入鵝膏蕈氨酸(各7.5μg)以去除神經(jīng)支配。2星期后，進(jìn)行認(rèn)知試驗(yàn)，經(jīng)單次或多次給藥后測(cè)定Cm.A、THA和E2020的作用。
Cm.A降低BF-損害的大鼠的潛伏期。單次給藥Cm.A(0.03-1.0mg/kg)能夠部分但非常顯著地恢復(fù)由BF損害誘導(dǎo)的記憶缺失，參見圖7。另外，圖8結(jié)果表明與THA和E2020相比，多次給藥Cm.A(0.03-0.3mg/kg/天)1星期顯示同樣有效或更有效的促進(jìn)恢復(fù)。
B．8-港灣放射狀迷宮(Eight-arm radial maze)應(yīng)用雄性Wistar大鼠，應(yīng)用8-港灣放射狀迷宮任務(wù)評(píng)價(jià)Cm.A對(duì)空間認(rèn)知的抗健忘作用。經(jīng)多次空間認(rèn)知試驗(yàn)后，應(yīng)用建立記憶的大鼠(其具有多于7個(gè)正確選擇，并且錯(cuò)誤少于1)。
1、東莨膽堿誘導(dǎo)的空間記憶缺失在建立空間記憶的大鼠中，腹膜內(nèi)注射東莨膽堿(0.5mg/kg)明顯引起正確選擇減少，錯(cuò)誤增多?？诜﨏m.A(0.03-0.3mg/kg)明顯改善了空間認(rèn)知缺陷。參見圖9。
2、內(nèi)側(cè)間隔核(Medial septal nucleus,SEP)損害引起的空間記憶缺陷按照實(shí)施例4A中BF損害方式，通過微注射鵝膏蕈氨酸(10μg)損害SEP(前囟，A:0.2mm,L:-1.0mm,H:-5.8mm)。
經(jīng)多次處理2周，Cm.A(3.0mg/kg/天)明顯改善了空間記憶缺失。參見圖10。
C．水迷宮應(yīng)用幼齡(2月齡)雄性Wistar大鼠或者幼齡(2月齡)和老齡(22月齡)雄性Fischer344大鼠，在下列參數(shù)下觀測(cè)在Morris水迷宮任務(wù)(Morris,R.J.Neurosci.Meth.27(1984))中化合物的抗健忘作用。對(duì)于每次訓(xùn)練試驗(yàn)，把大鼠置于水(22℃)中，這樣使動(dòng)物面對(duì)環(huán)形池(直徑150cm，高45cm)壁，然后在5個(gè)起始點(diǎn)之一(隨機(jī)選擇)開始。在每次試驗(yàn)中，記錄下逃避到隱藏平臺(tái)(處于四分體中間，低于水平面2cm)表面的潛伏期。在試驗(yàn)期間，每天重復(fù)這些步驟1次或2次。
1、東莨膽堿誘導(dǎo)的空間認(rèn)知缺陷為了觀測(cè)測(cè)試化合物的作用，共進(jìn)行6次試驗(yàn)(第1天2次、第2天后每天1次)。在每次試驗(yàn)前30和60分鐘分別給藥東莨膽堿(0.5mg/kg，腹膜內(nèi)注射)和測(cè)試化合物(口服)，結(jié)果總結(jié)于圖11。
隨著非處理組中的試驗(yàn)次數(shù)增加，逃避到平臺(tái)表面的潛伏期逐漸減少。東莨膽堿明顯地抑制這種認(rèn)知方法。Cm.A(1.0mg/kg/天)改善了由東莨膽堿誘導(dǎo)的空間認(rèn)知缺陷。在該試驗(yàn)中，THA顯示沒有明顯作用。
2、基底前腦(BF)損害誘導(dǎo)的空間認(rèn)知缺失即使經(jīng)過多次學(xué)習(xí)7天后，BF損害的大鼠的逃避潛伏期也不減少。用0.3、1.0和3.0mg/kg/天的Cm.A口服處理改善了空間認(rèn)知缺失。THA(1.0mg/kg/天)和E2020(0.3和1.0mg/kg/天)也改善了BF損害誘導(dǎo)的這種缺失。參見圖12。
3、對(duì)老齡大鼠的作用與幼齡大鼠相比，老齡(22月齡)大鼠不能縮短潛伏期。即使經(jīng)過11次試驗(yàn)后，在老齡大鼠中也只出現(xiàn)1次潛伏期的部分減少。然而，Cm.A逐漸把空間認(rèn)知缺失改善到幾乎等同于幼齡大鼠的水平。THA在此試驗(yàn)中顯示類似的活性。參見圖13。實(shí)施例6人Ⅰ相臨床分析按照單次給藥、雙盲法、安慰劑對(duì)照、劑量增加研究方法進(jìn)行了ⅠA相臨床試驗(yàn)。該項(xiàng)研究涉及圖1A化合物N-[2-(1-芐基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氫-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮的特別優(yōu)選鹽(如圖1B所示；N-[2-(1-芐基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氫-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮富馬酸單鹽)的安全性和藥物動(dòng)力學(xué)特性。把該化合物以2mg-180mg的劑量、在禁食狀態(tài)下對(duì)50-75歲的健康志愿者(男性和女性)口服給藥。共68例參加了該項(xiàng)研究并完成了試驗(yàn)。在此項(xiàng)研究中沒有鑒定出最大耐受劑量，也就是說即使在180mg的劑量下，此項(xiàng)研究中，建立真正的“最大耐受劑量”也僅僅是不足夠的副作用。確實(shí)，該研究中監(jiān)測(cè)的任何安全性參數(shù)(生命指征、ECG、血液化學(xué)、血液學(xué)、尿分析和體格檢查)均沒有明顯的臨床學(xué)變化。并且沒有報(bào)道嚴(yán)重的副作用；在接受化合物的個(gè)體中，該研究期間出現(xiàn)七次輕微的副作用，這些可能與化合物相關(guān)的副作用包括頭痛和惡心。
應(yīng)該注意批準(zhǔn)的AChE抑制劑E2020(ARICEPTò)推薦劑量為5或10mg/天。參見Physicians Desk Reference,53版，1999，第960-963頁。盡管屬于臨床建立的AChE抑制劑，沒有記載E2020對(duì)5HT3受體有任何作用。
本申請(qǐng)文件中提到的各個(gè)專利、申請(qǐng)和印刷出版物均在此引入作為參考。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)明白，在不偏離本發(fā)明的精神狀態(tài)下可以對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案作出許多改變和修改。所有這些變化均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．選自下式結(jié)構(gòu)化合物和其可藥用鹽的乙酰膽堿增強(qiáng)劑
2．下式化合物
3．在包括乙酰膽堿酯酶和5-羥色胺5HT3受體的系統(tǒng)中既抑制乙酰膽堿酯酶又拮抗5-羥色胺5HT3受體的方法，該方法包括在所述系統(tǒng)中引入選自下式化合物和其可藥用鹽的乙酰膽堿增強(qiáng)劑
4．權(quán)利要求3的方法，其中所述化合物為 或其可藥用鹽。
5．權(quán)利要求4的方法，其中所述乙酰膽堿增強(qiáng)劑具有下列結(jié)構(gòu)式
6．包括下式化合物或其可藥用鹽的藥物組合物
6．包括下式化合物或其可藥用鹽的藥物組合物
7．權(quán)利要求6的藥物組合物，該組合物含有化合物
8．抑制乙酰膽堿酯酶和拮抗5-羥色胺受體5HT3的方法，該方法包括對(duì)需要的個(gè)體提供權(quán)利要求6的藥物組合物。
9．抑制乙酰膽堿酯酶和拮抗5-羥色胺受體5HT3的方法，該方法包括對(duì)需要的個(gè)體提供權(quán)利要求7的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有雙重治療機(jī)理的喹啉衍生物,更具體他說,本發(fā)明涉及屬于乙酰膽堿增強(qiáng)劑的喹啉衍生物,該化合物證明具有抑制乙酰膽堿酯酶活性和拮抗5－羥色胺5HT3受體的活性。特別優(yōu)選的化合物是乙酰膽堿增強(qiáng)劑N－[2－(1－芐基哌啶－4－基)乙基]－2,3－二氫－9－甲氧基－1H－吡咯[3,4－b]喹啉－1－酮富馬酸單鹽,后面稱作化合物A(“Cm.A”)。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1304411SQ99807110
公開日2001年7月18日 申請(qǐng)日期1999年6月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月10日
發(fā)明者德里克·T·查默斯, 佐藤進(jìn), 好田忠行 申請(qǐng)人:阿瑞那制藥公司, Ss制藥株式會(huì)社