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一種利用拉曼增強(qiáng)光譜檢測食品中致病菌的方法與流程

文檔序號(hào):12822396閱讀:1170來源:國知局
一種利用拉曼增強(qiáng)光譜檢測食品中致病菌的方法與流程

本發(fā)明涉及一種利用拉曼增強(qiáng)光譜檢測食品中致病菌的方法,屬于食品安全檢測領(lǐng)域。



背景技術(shù):

目前致病菌的快速檢測與鑒別在臨床醫(yī)學(xué)、食品衛(wèi)生學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域都具有重要的研究意義。針對(duì)致病菌的檢測方法有多種,包括常規(guī)使用的需細(xì)菌培養(yǎng)和形態(tài)特征比較的傳統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn),該檢測方法結(jié)果雖然準(zhǔn)確但費(fèi)時(shí)費(fèi)力,無法為臨床治療爭取時(shí)間,很難滿足快速檢測的需求?;诜肿由飳W(xué)的檢測技術(shù),如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)技術(shù),這些方法均能在短時(shí)間內(nèi)獲得結(jié)果。但pcr技術(shù)由于操作易污染,很難避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生;elisa反應(yīng)中抗體之間可能產(chǎn)生交叉反應(yīng),且蛋白質(zhì)樣品保留時(shí)間短,這些弊端至今仍未克服。此外,基因芯片檢測技術(shù)在本領(lǐng)域的應(yīng)用,盡管表現(xiàn)出了高靈敏度和高特異性,卻因?yàn)槭芟抻诔杀景嘿F和操作繁復(fù),因此很難應(yīng)用到實(shí)際檢測中。因此,亟需一種快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測方法。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

鑒于背景技術(shù)中存在的問題,本發(fā)明的目的在于提供一種利用拉曼增強(qiáng)光譜檢測食品中致病菌的方法,其能解決檢測過程繁瑣、耗時(shí)長且成本昂貴等問題。

為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明提供一種利用拉曼增強(qiáng)光譜檢測食品中致病菌的方法,所述致病菌為大腸桿菌和福氏志賀氏菌,所述方法包括以下步驟:(ⅰ)采用上述兩種致病菌的質(zhì)控菌株制作拉曼增強(qiáng)光譜,包括利用拉曼光譜儀掃上述兩種致病菌的質(zhì)控菌株,以得到拉曼增強(qiáng)光譜,其中描拉曼光譜儀的掃描參數(shù):激光功率為200mw,激發(fā)光波長為785nm,掃描光譜范圍為400~1800cm-1,積分時(shí)間為5-20s,分辨率為4cm-1;(ⅱ)利用拉曼光譜儀掃待檢測的食品的樣品,以得到樣品的拉曼光譜,其中拉曼光譜儀的掃描參數(shù)與步驟(ⅰ)一致;(iii)將實(shí)際樣品的拉曼光譜與質(zhì)控菌株的拉曼光譜進(jìn)行比對(duì),即根據(jù)拉曼光譜的特征峰峰位與強(qiáng)度進(jìn)行定性識(shí)別,或者對(duì)實(shí)際樣品和質(zhì)控菌株的圖譜中的600-1500cm-1波段進(jìn)行主成分分析與聚類分析得到拉曼光譜對(duì)應(yīng)的判別散點(diǎn)分布圖,然后比較這些判別散點(diǎn)分布圖來判斷食品中是否存在這兩類致病菌;

大腸桿菌的特征峰包括646cm-1、827cm-1、870cm-1、989cm-1、1059cm-1、1230cm-1、1312cm-1、1439cm-1;

福氏志賀氏菌的特征峰包括651cm-1、863cm-1、979cm-1、1010cm-1、1166cm-1、1242cm-1、1340cm-1、1446cm-1。

在根據(jù)本發(fā)明所述的一種利用拉曼增強(qiáng)光譜檢測食品中致病菌的方法中,在步驟(i)之前,還包括質(zhì)控菌株樣品的制備。

在根據(jù)本發(fā)明所述的一種利用拉曼增強(qiáng)光譜檢測食品中致病菌的方法中,所述制備包括合成拉曼增強(qiáng)試劑、制備細(xì)菌培養(yǎng)基以及菌懸液的制備。

在根據(jù)本發(fā)明所述的一種利用拉曼增強(qiáng)光譜檢測食品中致病菌的方法中,主成分分析采用的軟件為spss。

合成拉曼增強(qiáng)試劑的具體操作過程為:取10ml氯金酸溶液至圓底燒瓶中,加熱攪拌至溶液微沸,然后加入1ml濃度為2%的檸檬酸三鈉溶液,繼續(xù)保持微沸3min,最后將圓底燒瓶冷卻,得到檢測用納米金溶膠顆粒。

制備細(xì)菌培養(yǎng)基的具體步驟:稱取4.3mg的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基于三角瓶中,加入100ml純凈水后加熱溶解至溶液澄清,降溫后調(diào)節(jié)ph值至7.0-7.4,在0.103mpa,121℃中滅菌15min。

配置細(xì)菌待測液的過程:將細(xì)菌或待測樣品接種于培養(yǎng)基中,37℃,100rpm/min震蕩培養(yǎng)5hrs,取1-5ml菌液于離心管中,4℃7000rpm/min離心5min,去除上清液加入1ml無菌生理鹽水懸浮后再次離心洗滌;以上操作重復(fù)三次,得到細(xì)菌待測液。

制作拉曼光譜過程:取所述納米金溶膠與所述細(xì)菌待測液按照(1-5)∶1混勻后,取100-500μl于樣品池中,用于拉曼光譜檢測。

本發(fā)明的有益效果:

建立利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行多種致病菌快速檢測與鑒別的方法,兩種致病菌的光譜圖在數(shù)秒內(nèi)完成;

采用sers圖譜進(jìn)行細(xì)菌鑒別,將檢測時(shí)間縮短到幾秒鐘,為致病菌的快速檢測提供便利方法。

附圖說明

圖1為兩種不同致病菌的sers圖譜;

圖2為兩種致病菌的主成分分析的散點(diǎn)圖;

圖3為實(shí)際樣品的拉曼光譜圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案以及優(yōu)點(diǎn)更清楚、明確,以下將結(jié)合具體實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。

表面增強(qiáng)拉曼(surface-enhancedramanscattering,簡稱sers),用通常的拉曼光譜法測定吸附在膠質(zhì)金屬顆粒如銀、金或銅表面的樣品,或吸附在這些金屬片的粗糙表面上的樣品。

表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(sers)借助增強(qiáng)基底吸附在細(xì)菌細(xì)胞表面使原本的拉曼信號(hào)得到106~1015倍的增強(qiáng),具備更高的信噪比和靈敏度的同時(shí),采集到更多致病菌的特征信息,顯示出不同菌株間更加細(xì)微的差異。利用sers技術(shù)可檢測不同的致病菌,憑借其檢測圖譜較低的譜帶重疊和數(shù)據(jù)疊加,以及豐富的信息含量,獲得“獨(dú)一”的致病菌全生物指紋圖譜用于識(shí)別兩種致病菌;結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法(multivariatestatisticalanalysis,mva)輔助結(jié)果判定,排除肉眼觀察時(shí)主觀判斷上的誤差,使致病菌的鑒別更加準(zhǔn)確可靠。

制作兩種致病菌的拉曼圖譜的過程:

拉曼增強(qiáng)試劑的合成:吸取10ml氯金酸溶液至圓底燒瓶中,利用恒溫加熱磁力攪拌器加熱攪拌至溶液微沸,然后加入1ml濃度為2%的檸檬酸三鈉溶液,繼續(xù)保持微沸3min,最后將圓底燒瓶置于冰水浴中攪拌冷卻,呈酒紅色,得到檢測用納米金溶膠顆粒。

培養(yǎng)基的配置:稱取4.3mg的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基于三角瓶中,加入100ml純凈水后加熱溶解至溶液澄清,降溫后調(diào)節(jié)ph值至7.2±0.2,0.103mpa,121℃滅菌15-20min,備用。

細(xì)菌樣品的制備:將甘油保藏的菌種迅速融化,用接種環(huán)粘取接種于培養(yǎng)基中,37℃,100rpm/min震蕩培養(yǎng)1-6hrs,取1ml菌液于離心管中,4℃7000rpm/min離心5min,去除上清液加入1ml無菌生理鹽水懸浮后再次離心洗滌,得到待測液。

得出拉曼光譜圖:采用便攜式表面增強(qiáng)拉曼光譜儀進(jìn)行檢測,設(shè)置常數(shù)如下:激光功率為200mw,激發(fā)光波長為785nm,掃描光譜范圍為400~1800cm-1,積分時(shí)間為5-20s,分辨率為4cm-1。取納米金溶膠與樣品按照(1-5)∶1混勻后,立即檢測,收集拉曼光譜圖(如圖1所示)。圖中曲線1表示的是大腸桿菌、曲線2表示的是福氏志賀氏菌。

通過sers檢測發(fā)現(xiàn),大腸桿菌和福氏志賀氏菌的拉曼振動(dòng)峰的位置和強(qiáng)度區(qū)別明顯,比較兩種菌株的sers平均圖譜,兩種菌株在600-800cm-1,900-1100cm-1,1150-1430cm-1波段的sers圖譜存在明顯差別,截取600-1500cm-1波段進(jìn)行提取主成分分析(pca),提取出2個(gè)pc得分因子,是以累積貢獻(xiàn)率大于70%的pc1和pc2作散點(diǎn)圖和判別分析,模型具有較好的預(yù)測能力。用該模型辨別實(shí)驗(yàn)菌株,各組具有100%的靈敏度和大于94%的特異性,說明在實(shí)際檢測中,該模型的低漏判率和錯(cuò)判率能夠得到十分可靠的判別結(jié)果,可以用于大腸桿菌和福氏志賀氏菌的鑒別及區(qū)分。

在用統(tǒng)計(jì)分析方法研究多變量的課題時(shí),變量個(gè)數(shù)太多就會(huì)增加課題的復(fù)雜性。人們自然希望變量個(gè)數(shù)較少而得到的信息較多。在很多情形,變量之間是有一定的相關(guān)關(guān)系的,當(dāng)兩個(gè)變量之間有一定相關(guān)關(guān)系時(shí),可以解釋為這兩個(gè)變量反映此課題的信息有一定的重疊。主成分分析是對(duì)于原先提出的所有變量,將重復(fù)的變量(關(guān)系緊密的變量)刪去多余,建立盡可能少的新變量,使得這些新變量是兩兩不相關(guān)的,而且這些新變量在反映課題的信息方面盡可能保持原有的信息;即設(shè)法將原來變量重新組合成一組新的互相無關(guān)的幾個(gè)綜合變量,同時(shí)根據(jù)實(shí)際需要從中可以取出幾個(gè)較少的綜合變量盡可能多地反映原來變量的信息的統(tǒng)計(jì)方法叫做主成分分析或稱主分量分析,也是數(shù)學(xué)上用來降維的一種方法,即將相關(guān)比較密切的幾個(gè)變量歸在同一類中,每一類變量就成為一個(gè)因子,以較少的幾個(gè)因子反映原資料的大部分信息。

累計(jì)貢獻(xiàn)率是因子分析中抽取出的因子特征值之和和所有因子特征值之和(該值等于因子分析中的變量數(shù))的比值??梢詫⑵湟饬x理解為抽取出的因子變異對(duì)所有變量變異的解釋力,也可以理解為抽取出的因子對(duì)所有變量的代表性,很顯然代表性高一些好,因?yàn)橐蜃臃治龅哪康木褪腔喿兞浚帽M量少的因子代表盡量多的變量,使變量的意義更加明確。

通過主成分分析與聚類分析,得到兩種致病菌兩個(gè)pc得分因子的散點(diǎn)圖(如圖2所示),pca結(jié)果圖中兩個(gè)圓形(或橢圓形)內(nèi)的點(diǎn)對(duì)應(yīng)的致病菌分別為大腸桿菌和福氏志賀氏菌。

采用拉曼圖譜進(jìn)行實(shí)際樣品的測定:

制備樣品:針對(duì)固體和半固體樣品:稱取25g樣品置于盛有225ml生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min;或放入盛有225ml稀釋液的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1~2min,制成1∶10的樣品勻液。針對(duì)液體樣品:以無菌吸管吸取25ml樣品置于盛有225ml生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中,充分混勻,制成1∶10的樣品勻液。每遞增稀釋一次,換用1次1ml無菌吸管或吸頭。根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),選擇原液或適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),吸取0.1-1ml樣品接種于5-10ml液體培養(yǎng)基中,37℃100rpm/min震蕩培養(yǎng),待菌液變混濁后,取1-5ml菌液于離心管中,4℃7000rpm/min離心5min,去除上清液加入1ml無菌生理鹽水懸浮后再次離心洗滌,得到待測液。

樣品檢測:采用便攜式表面增強(qiáng)拉曼光譜儀進(jìn)行檢測,設(shè)置常數(shù)如下:激光功率為200mw激發(fā)光波長為785nm,掃描光譜范圍為400~1800cm-1,積分時(shí)間為5-20s,分辨率為4cm-1,取納米金溶膠與待測樣品按照(1-5)∶1混勻后,立即檢測,收集拉曼光譜圖。

將未知樣品進(jìn)行前處理,未知樣品培養(yǎng)物未出現(xiàn)明顯的細(xì)菌混濁,經(jīng)過拉曼光譜檢測,得到該樣品的拉曼光譜圖(見圖3),根據(jù)圖3檢測結(jié)果分析,該樣品的特征譜峰為1370cm-1,圖譜形狀與兩種致病菌的指紋圖譜存在明顯不同,因此可以判定不屬于這兩類致病菌的污染。

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