本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)化學(xué)和構(gòu)象變化的檢測(cè)，尤其涉及一種利用生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)特異性標(biāo)記、檢測(cè)蛋白質(zhì)，利用生物正交拉曼技術(shù)體外檢測(cè)蛋白構(gòu)象變化，以及利用生物正交拉曼技術(shù)在活細(xì)胞原位檢測(cè)蛋白構(gòu)象變化的方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象是其功能、活性的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)對(duì)環(huán)境和刺激的響應(yīng)是通過(guò)蛋白質(zhì)或者蛋白復(fù)合體其構(gòu)象的變化進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其功能和活性的調(diào)節(jié)。其中某些重要氨基酸的位置、取向、運(yùn)動(dòng)在蛋白質(zhì)的變構(gòu)過(guò)程中發(fā)生顯著的變化。因而實(shí)現(xiàn)快速、靈敏和高效的檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化(特別是在生理?xiàng)l件下原位檢測(cè)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化)對(duì)于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系至關(guān)重要。

目前，研究蛋白結(jié)構(gòu)的方法有很多種，包括x-射線(xiàn)晶體衍射法、核磁共振法、紅外光譜法、熒光光譜法、拉曼光譜法、圓二色譜法、質(zhì)譜法等。這些方法各有利弊和適用的范圍。比如，x射線(xiàn)晶體衍射已經(jīng)發(fā)展了幾十年，樣品不需要標(biāo)記，分子量沒(méi)有限制，數(shù)據(jù)采集和分析相對(duì)成熟，它能夠提供原子分辨率的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；但是x射線(xiàn)晶體衍射法要求對(duì)分析蛋白質(zhì)的晶體(制備蛋白質(zhì)單晶是很復(fù)雜和困難的)，且要求樣品量大、費(fèi)時(shí)、靈敏度差，適合穩(wěn)態(tài)、易于獲得晶體的蛋白，對(duì)于溶液中的、瞬時(shí)的構(gòu)象變化難以適用。紅外光譜法靈敏度低(在組分分析中要求含量一般應(yīng)大于0.1％)，受水的信號(hào)干擾嚴(yán)重，后來(lái)發(fā)展的近紅外技術(shù)也未能解決該問(wèn)題，使得紅外光譜法無(wú)法用于接近生理環(huán)境的體系。核磁共振法、質(zhì)譜法、熒 光光譜法和拉曼光譜法目前能夠檢測(cè)溶液中的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。但核磁共振法僅適合于分子量小于40kda的樣品，靈敏度低，分析濃度通常需要達(dá)到mm級(jí)，且數(shù)據(jù)處理復(fù)雜，分析成本高。質(zhì)譜法可根據(jù)電荷價(jià)態(tài)分布來(lái)研究蛋白質(zhì)構(gòu)象，靈敏度高、能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)和定量分析，但常用的esi-ms以及改進(jìn)了的冷噴霧電離csi-ms等，均是進(jìn)行氣態(tài)化離子的分析檢測(cè)，所給出的信息不能十分準(zhǔn)確地表征蛋白質(zhì)在溶液中的真實(shí)構(gòu)象。熒光法中應(yīng)用較多的是熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(fret)，需要引入較大體積的供體和受體，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能會(huì)產(chǎn)生一定影響，并且熒光法也有較強(qiáng)的運(yùn)用現(xiàn)在(比如fret的效果在10nm范圍內(nèi)是比較靈敏的，超出該限制條件就很難適用了)。相反，拉曼光譜法簡(jiǎn)單易行，不受水的干擾，無(wú)需對(duì)被測(cè)樣品作標(biāo)記及特殊制備，能夠提供物質(zhì)的分子組成和結(jié)構(gòu)等樣品內(nèi)在的信息，獲得豐富的指紋譜峰，已經(jīng)在細(xì)胞、組織甚至活體中得到了應(yīng)用。但是傳統(tǒng)基于拉曼光譜的檢測(cè)方法，其靈敏度較低，且天然生物分子的譜峰重疊、干擾嚴(yán)重，嚴(yán)重限制了拉曼法的進(jìn)一步應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的難題，提供一種利用生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)特異性標(biāo)記、檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法。

為了提高拉曼光譜法的靈敏度，近年來(lái)研究者發(fā)展了各種增強(qiáng)技術(shù)，如表面增強(qiáng)拉曼(sers)。sers是au、ag等金屬表面對(duì)于拉曼信號(hào)的一種增強(qiáng)現(xiàn)象，一般可以實(shí)現(xiàn)10⁶-10¹²的增強(qiáng)效果，可達(dá)到與熒光光譜相近的靈敏度。另一方面，為了解決生物分子的拉曼譜峰重疊的問(wèn)題，申請(qǐng)人的發(fā)明人研究了正交拉曼標(biāo)簽標(biāo)記的策略，即在生物分子上引入拉曼信號(hào)正交基團(tuán)(如炔基、疊氮、c-d等)，它們的拉曼信號(hào)在細(xì)胞拉曼信號(hào)的沉默區(qū)(1800-2800cm^-1)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的使用生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)特異性標(biāo)記、檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：

a)制備攜帶生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)的非天然氨基酸；

b)利用基因擴(kuò)展技術(shù)，將步驟a)制備的非天然氨基酸插入目標(biāo)蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記；

c)利用生物正交拉曼技術(shù)對(duì)步驟b)得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

優(yōu)選地，上述生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)為炔基、疊氮、氰基或碳氘鍵。

優(yōu)選地，上述方法還包括利用金納米離子的表面增強(qiáng)效應(yīng)。

優(yōu)選地，利用金納米離子的表面增強(qiáng)效應(yīng)中的金納米顆粒aunps通過(guò)采用檸檬酸鈉還原法制備。

優(yōu)選地，檸檬酸鈉還原法中所用的haucl4的終濃度為0.25mm，檸檬酸鈉的終濃度為0.01％(w/w)。

優(yōu)選地，上述使用生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)特異性標(biāo)記、檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法還可包括增加蛋白與aunps的親和力。

進(jìn)一步優(yōu)選地，上述增加蛋白與aunps的親和力包括使用含半胱氨酸的標(biāo)簽、含甲硫氨酸的標(biāo)簽或蛋白化學(xué)修飾上含巰基的小分子。

本發(fā)明的另一目的是提供一種使用生物正交拉曼技術(shù)體外檢測(cè)蛋白構(gòu)象變化的方法，包括如下步驟：

a)在不同溶液條件下，利用上述使用生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)特異性標(biāo)記、檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化；

b)在基于步驟a)檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的基礎(chǔ)上，研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和環(huán)境改變關(guān)系。

本發(fā)明的又一目的是提供一種使用生物正交拉曼技術(shù)在活細(xì)胞原位檢測(cè)蛋白構(gòu)象變化的方法，包括如下步驟：

a)利用上述使用生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)特異性標(biāo)記、檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法檢測(cè)活細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化；

b)在基于步驟a)檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的基礎(chǔ)上，在活細(xì)胞層面上，原位研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和其蛋白質(zhì)活性受刺激調(diào)節(jié)的關(guān)系。

優(yōu)選地，上述刺激包括生長(zhǎng)因子刺激、配體刺激或環(huán)境改變刺激。

本發(fā)明中使用生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)特異性標(biāo)記、檢測(cè)蛋白質(zhì)的方 法，利用基因擴(kuò)展技術(shù)和攜帶生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)(包含但不僅限于炔基、疊氮、氰基、碳氘鍵等)的非天然氨基酸技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的方法。

利用金納米離子的表面增強(qiáng)效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)在溶液中檢測(cè)特定蛋白質(zhì)上生物正交拉曼報(bào)基團(tuán)的方法。該方法具備高效、靈敏和目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性。

利用生物正交拉曼標(biāo)記結(jié)合金納米離子表面增強(qiáng)效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)在活細(xì)胞層面上檢測(cè)特定蛋白質(zhì)的方法。該方法生物相容性好，操作簡(jiǎn)單，且兼具高效、靈敏和目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性。

本發(fā)明還提供了使用生物正交拉曼策略體外檢測(cè)蛋白構(gòu)象變化的方法；使用炔基等生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)，結(jié)合金納米離子表面增強(qiáng)效應(yīng)，在不同溶液條件下，檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的方法；在基于生物正交拉曼檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的基礎(chǔ)上，研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和環(huán)境改變關(guān)系的新方法。

使用含半胱氨酸的標(biāo)簽增加蛋白與aunps的親和力，當(dāng)然包括其他增加親和力的方法用于sers增強(qiáng)的生物正交raman策略檢測(cè)蛋白局部構(gòu)象變化，包含但不僅限于含甲硫氨酸的標(biāo)簽或蛋白化學(xué)修飾上含巰基的小分子。

本發(fā)明還提供了使用生物正交拉曼策略在活細(xì)胞原位檢測(cè)蛋白構(gòu)象變化的方法；使用炔基等生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)，結(jié)合金納米離子表面增強(qiáng)效應(yīng)，檢測(cè)活細(xì)胞表面蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的方法；在基于生物正交拉曼檢測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的基礎(chǔ)上，在活細(xì)胞層面上，原位研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和其蛋白質(zhì)活性受刺激(生長(zhǎng)因子、配體和環(huán)境改變等)調(diào)節(jié)的新方法。

本發(fā)明提供的利用生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)特異性標(biāo)記、檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，利用生物正交拉曼技術(shù)體外檢測(cè)蛋白構(gòu)象變化的方法，以及利用生物正交拉曼技術(shù)在活細(xì)胞原位檢測(cè)蛋白構(gòu)象變化的方法，通過(guò)基因密碼子擴(kuò)增技術(shù)和sers增強(qiáng)的方法，實(shí)現(xiàn)快速、靈敏和高效地檢測(cè)帶有生物正交基團(tuán)的蛋白質(zhì)在不同的微環(huán)境或活性條件下其構(gòu)象的變化，特別是實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞上蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的原位檢測(cè)，進(jìn)而解析蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能之間的聯(lián)系。該技術(shù)基于在蛋白質(zhì)某特定位點(diǎn)引入生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)的方法 和拉曼基團(tuán)的分子振動(dòng)信號(hào)對(duì)微環(huán)境改變非常敏感并隨環(huán)境的變化會(huì)發(fā)生偏移的理論基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)對(duì)溶液中蛋白構(gòu)象變化的檢測(cè)以及活細(xì)胞上蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的原位和靈敏的檢測(cè)。

本發(fā)明的上述方法適用于蛋白質(zhì)溶液中和活細(xì)胞生理?xiàng)l件下表面蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的生物正交拉曼檢測(cè)。本發(fā)明的上述方法具有簡(jiǎn)單易行，體系接近生理?xiàng)l件、靈敏度高、正交拉曼信號(hào)干擾小、數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)單，對(duì)蛋白分子量沒(méi)有限制，適合多種蛋白體系的特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是基于生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)(炔基)的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化檢測(cè)；

圖2是hdea蛋白35位炔基在ph7的條件下的raman位移；

圖3是hdea蛋白35位炔基在ph2的條件下的raman位移；

圖4是hdea蛋白58位炔基在ph7的條件下的raman位移；

圖5是hdea蛋白58位炔基在ph2的條件下的raman位移；

圖6(a)是細(xì)胞上未做突變的egfr(wt-egfr)的raman光譜；

圖6(b)是細(xì)胞上356位突變并插入penk但未經(jīng)egf刺激的egfr的raman光譜；

圖6(c)是細(xì)胞上356位突變并插入penk經(jīng)過(guò)egf刺激的egfr的raman光譜。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明利用基因擴(kuò)增技術(shù)在蛋白上特定位點(diǎn)插入含有正交基團(tuán)的非天然氨基酸，利用金納米離子能對(duì)拉曼信號(hào)進(jìn)行等離子增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)高效、靈敏和快速的檢測(cè)。因?yàn)榛鶊F(tuán)的拉曼信號(hào)會(huì)受基團(tuán)附近微觀環(huán)境(比如，溶液種類(lèi)、基團(tuán)種類(lèi)、電性等)的影響，并發(fā)生拉曼峰位的偏移， 實(shí)現(xiàn)對(duì)拉曼正交報(bào)告基團(tuán)其微觀環(huán)境變化的檢測(cè)。而拉曼正交報(bào)告基團(tuán)微觀環(huán)境的變化，是和蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化相關(guān)聯(lián)的，這種變化反映了蛋白質(zhì)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。將蛋白質(zhì)與金納米粒子靠近后(小于10nm)時(shí)，檢測(cè)不同條件下，生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)(此處為炔基)拉曼信號(hào)，得到該目標(biāo)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的信息。具體見(jiàn)示意圖1。

生物正交拉曼標(biāo)簽標(biāo)記的策略，即在生物分子上引入拉曼信號(hào)正交基團(tuán)(如炔基、疊氮、c-d等)，它們的拉曼信號(hào)在細(xì)胞拉曼信號(hào)的沉默區(qū)(1800-2800cm^-1)。這一策略解決了生物分子的拉曼譜峰重疊的問(wèn)題，大大簡(jiǎn)化了拉曼數(shù)據(jù)的分析過(guò)程。基因密碼子擴(kuò)增技術(shù)是利用真核生物中終止密碼子tag不編碼氨基酸且使用概率低的性質(zhì)，引入經(jīng)過(guò)篩選的與tag和非天然氨基酸正交的氨酰轉(zhuǎn)移酶-trna對(duì)，使細(xì)胞將非天然氨基酸插入蛋白的tag突變位點(diǎn)。利用基因擴(kuò)增技術(shù)將含有拉曼正交基團(tuán)的非天然氨基酸插入蛋白中，進(jìn)行生物正交拉曼檢測(cè)。

實(shí)施例1溶液中含炔基hdea蛋白在不同ph下的構(gòu)象變化的檢測(cè)

hdea是細(xì)菌膜間質(zhì)中的分子伴侶蛋白。在ph7的生理環(huán)境下，hdea以同源二聚形式存在；而在ph2的生理環(huán)境中hdea解聚暴露其活性位點(diǎn)與其底物蛋白結(jié)合。在ph2的生理環(huán)境中hdea處于disorder(混亂)的狀態(tài)，不能使用x-射線(xiàn)晶體衍射法研究其結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化。penk是含有炔基的賴(lài)氨酸衍生物(如下圖所示)，可以用正交的penk-mbpylrs/trna將penk插入蛋白的tag位點(diǎn)。

aunps的合成：采用檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒(aunps)溶膠，其中haucl4的終濃度為0.25mm，檸檬酸鈉的終濃度為0.01％(w/w)。在煮沸的超純水中，劇烈攪拌下分別加入haucl4和檸檬酸鈉，30min后停止加熱。

含炔基hdea的表達(dá)純化：在細(xì)菌hdea蛋白n-端信號(hào)肽后引入含多個(gè)半胱氨酸的標(biāo)簽(gccpgccggsgs)，在c-端引入his6標(biāo)簽。其35位或58位氨基酸對(duì)應(yīng)密碼子序列突變?yōu)閠ag，引入含炔基的非天然氨基酸penk。將改造的hdea基因序列插入pbad載體中。使用e.coli進(jìn)行蛋白表達(dá)，在非天然氨基酸的存在下，使用阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)。然后使用ni柱純化表達(dá)的蛋白。獲得含有炔基的hdea蛋白。

aunps和hdea孵育：0.1mg/ml含炔基的hdea加入aunps溶液中，使用半胱氨酸的標(biāo)簽與aunps進(jìn)行結(jié)合。室溫孵育0.5h后，加入10x緩沖溶液使緩沖溶液終濃度為1xpbs(ph7)或檸檬酸鈉緩沖溶液(10mm，含150mmnacl，ph2)。然后使用horiba拉曼顯微鏡檢測(cè)溶液的raman光譜。

拉曼檢測(cè)結(jié)果如下：

1、蛋白hdea(35位炔基)，ph2到7

如圖2所示，在ph7的條件下，hdea處于同源二聚的非活性狀態(tài)，此時(shí)35位炔基的raman峰為單一的峰2120.4cm^-1。如圖3所示，而在ph2的條件下，hdea解聚為單體，逐漸形成活化構(gòu)象，此時(shí)35位炔基的raman峰出現(xiàn)拖尾的肩峰，可以分峰為2126.1cm^-1和2146.7cm^-1。都相對(duì)于2120.4cm^-1向高波數(shù)位移，分別對(duì)應(yīng)于“開(kāi)始解聚”和“近活化”的構(gòu)象。

2、蛋白hdea(58位炔基)，ph2到7

如圖4和5所示，hdea58位炔基的構(gòu)象變化和hdea35位差不多。但是二者“開(kāi)始解聚”和“近活化”構(gòu)象的比例不同。因?yàn)閔dea在解聚逐漸形成活化構(gòu)象的過(guò)程中不同氨基酸位點(diǎn)的變化不完全同步，所以不同氨基酸位點(diǎn)反映的“開(kāi)始解聚”和“近活化”構(gòu)象的比例不同。本發(fā)明提供一種使用生物正交拉曼報(bào)告基團(tuán)特異性標(biāo)記、檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，能夠研究不同氨基酸位點(diǎn)在蛋白構(gòu)象變化過(guò)程中的構(gòu)象變化有無(wú)、快慢和比例。

實(shí)施例2細(xì)胞表面含炔基egfr蛋白在egf刺激前后構(gòu)象變化的檢測(cè)

egfr是表皮生長(zhǎng)因子受體蛋白，位于細(xì)胞膜表面。egfr信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過(guò)程發(fā)揮重要的作用，與多種癌癥密切相關(guān)。egfr與表皮生長(zhǎng)因子egf結(jié)合后會(huì)發(fā)生二聚，egf釋放后主要以單體形式存在。

aunps的合成：采用檸檬酸鈉還原法制備。

含炔基egfr在細(xì)胞上的表達(dá)：將egfr蛋白的210、250、356或440位的密碼子分別突變?yōu)閠ag。在非天然氨基酸penk的存在下，將含有改造的egfr和penk-mbpylrs/trna^pylcua基因序列的質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)入hek293t細(xì)胞中。40h后，用不含血清的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行8h的饑餓處理，之后用100ng/ml的egf溶液刺激實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，15min后用4％多聚甲醛溶液固定細(xì)胞。金溶膠中加入1/10體積的10×pbs，快速加入細(xì)胞體系中孵育1h。使用nanophton拉曼顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞的拉曼光譜。

拉曼結(jié)果如下：

如圖6(a)-6(c)所示，沒(méi)有用egf刺激(egf-)的細(xì)胞上egfr主要以單體形式存在，經(jīng)egf刺激(egf+)的細(xì)胞egfr主要以二聚體存在，在兩種構(gòu)象中同一位點(diǎn)的炔基周?chē)幕瘜W(xué)環(huán)境(如電場(chǎng)、親疏水性)不同，其拉曼信號(hào)的位置會(huì)發(fā)生偏移。以356位點(diǎn)為例，未做突變的wildtype-egfr對(duì)照組沒(méi)有炔基的拉曼信號(hào)，356位突變并插入penk的實(shí)驗(yàn)組均可測(cè)到炔基的拉曼信號(hào)，其中，egf-組細(xì)胞的炔基拉曼信號(hào)在2122cm^-1，egf+組細(xì)胞的炔基拉曼信號(hào)在2126cm^-1，即egf刺激前后egfr構(gòu)象變化導(dǎo)致炔基的拉曼信號(hào)發(fā)生了位移。4個(gè)不同位點(diǎn)突變的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下表中所示，其中250、356和440位點(diǎn)，egf刺激后拉曼信號(hào)高波數(shù)位移，而210位點(diǎn)低波數(shù)位移，反映了egfr不同位點(diǎn)的化學(xué)環(huán)境在構(gòu)象轉(zhuǎn)化中經(jīng)歷了不同的變化趨勢(shì)。

表1顯示了細(xì)胞上egfr的不同位點(diǎn)炔基在egf刺激前后的拉曼位移，具體如下：

表1

溶液和細(xì)胞的結(jié)果表明，插入蛋白的炔基在不同條件下的拉曼信號(hào)的變化能夠反映蛋白構(gòu)象變化。利用生物正交拉曼技術(shù)能夠?qū)Φ鞍讟?gòu)象變化進(jìn)行原位檢測(cè)。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許的更動(dòng)與改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。