本發(fā)明涉及血清抗原檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種用于檢測(cè)血清中α-l-巖藻糖苷酶的抗體及試劑盒。

背景技術(shù)：

癌癥在全球的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。2014年2月3日，世界衛(wèi)生組織發(fā)表的《全球癌癥報(bào)告2014》顯示，中國(guó)新增癌癥病例高居世界第一位，其中肝癌的新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)是乙肝大國(guó)，肝癌發(fā)病率占全球總數(shù)的55％。臨床上肝癌的診斷主要是通過(guò)血清檢測(cè)甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,afp)，b超發(fā)現(xiàn)肝臟結(jié)節(jié)，然后ct和mri檢查。然而afp陽(yáng)性率約60～70％，并非所有肝細(xì)胞癌都分泌大量的afp，約40％早期原發(fā)性肝癌及15％～20％晚期原發(fā)性肝癌患者的血清afp水平是正常的，故僅靠afp診斷肝癌尚有漏診的可能，導(dǎo)致臨床80％患者確診時(shí)已屬中晚期。中晚期肝癌基本無(wú)有效治療方法，對(duì)乙肝、肝硬化等高危人群進(jìn)行肝癌腫瘤標(biāo)志物的篩查和早期診斷是解決肝癌高死亡率的最有效措施。

α-l-巖藻糖苷酶(afu)是一種溶酶體水解酶，廣泛存在于各種組織細(xì)胞和體液中，參與糖蛋白及糖脂等多種生物活性物質(zhì)的分解代謝。肝臟是富含溶酶體的器官之一，當(dāng)肝細(xì)胞癌變時(shí)，afu合成增多，且腫瘤細(xì)胞膜通透性增大，釋放到血液中的酶量增多，且降解速度減慢，因而引起血清afu濃度升高。血清afu活性動(dòng)態(tài)曲線對(duì)判斷肝癌治療效果、估計(jì)預(yù)后和預(yù)報(bào)復(fù)發(fā)有著極其重要的意義，甚至優(yōu)于afp。但血清afu活力測(cè)定在某些轉(zhuǎn)移性肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢或子宮癌之間有一些重疊，甚至在某些非腫瘤性疾患如肝硬化、慢性肝炎和消化道出血等也有輕度升高，在使用afu時(shí)應(yīng)與afp同時(shí)測(cè)定，可提高原發(fā)性肝癌的診斷陽(yáng)性率達(dá)93.1％，有較好的互補(bǔ)作用。

luminex懸浮芯片技術(shù)是美國(guó)luminex公司在20世紀(jì)90年代中期開(kāi)發(fā)的一種多功能的液相芯片分析平臺(tái)，也稱為液體芯片。它有機(jī)地整合了有色微球、激光技術(shù)、最新的高速數(shù)字信號(hào)處理和計(jì)算機(jī)技術(shù)，應(yīng)用的熒光編碼微球帶有針對(duì)不同目標(biāo)分子的特異性抗體，不同的微球可以自由組合，可以在一個(gè)25-50微升的樣品內(nèi)同時(shí)檢測(cè)最多達(dá)100種不同的檢測(cè)項(xiàng)目，具有重復(fù)性與穩(wěn)定性好、高通量、檢測(cè)指標(biāo)可靈活選擇，以及高靈敏度和高信噪比等諸多優(yōu)點(diǎn)，適用于血漿中抗原類蛋白的分析以及重大疾病抗原標(biāo)志物的定量分析，是一項(xiàng)具有重大意義的醫(yī)學(xué)輔助檢測(cè)手段。與傳統(tǒng)的固相芯片相比，克服了固相芯片在大分子檢測(cè)時(shí)受表面張力、空間效應(yīng)等對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的干擾，使檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性得到很大的提高。

因此，獲得afu特異性抗體，利用luminex懸浮芯片技術(shù)對(duì)血清中afu含量進(jìn)行檢測(cè)，將有助于提高早期肝癌的檢出率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了提高早期肝癌的檢出率，本發(fā)明提供用于檢測(cè)血清中α-l-巖藻糖苷酶的抗體及試劑盒，其特異性強(qiáng)、靈敏度高，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出血清中α-l-巖藻糖苷酶的含量。

請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案如下：

用于制備抗α-l-巖藻糖苷酶的抗體的抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

編碼所述抗原蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

用于檢測(cè)待測(cè)血清中肝癌標(biāo)志物α-l-巖藻糖苷酶的單克隆抗體，其特征在于，由保藏編號(hào)為cgmccno.13584的雜交瘤細(xì)胞分泌。

分泌所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，其保藏編號(hào)為cgmccno.13584。

用于檢測(cè)待測(cè)血清中肝癌標(biāo)志物α-l-巖藻糖苷酶的抗體對(duì)，其特征在于，由第一抗體和第二抗體組成；所述第一抗體作為包被抗體，由保藏編號(hào)為cgmccno.13583的雜交瘤細(xì)胞分泌；所述第二抗體作為檢測(cè)抗體，由保藏編號(hào)為cgmccno.13584的雜交瘤細(xì)胞分泌。

用于肝癌早期診斷的試劑盒，其特征在于，包括所述單克隆抗體或所述抗體對(duì)，以及用于免疫檢測(cè)的通用試劑。

所述試劑盒，其特征在于，包括所述抗體對(duì)，所述第一抗體與磁珠偶聯(lián)，所述第二抗體用生物素標(biāo)記，所述用于免疫檢測(cè)的通用試劑為鏈霉親和素-藻紅蛋白。

所述試劑盒，其特征在于，還包括α-l-巖藻糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)品和/或以所述α-l-巖藻糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線或直線回歸方程說(shuō)明書。

所述試劑盒，其特征在于，還包括抗甲胎蛋白的抗體、抗高爾基糖蛋白73的抗體、抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的抗體和/或抗細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子cd147的抗體，及其相應(yīng)的免疫檢測(cè)試劑。

所述試劑盒，其特征在于，還包括甲胎蛋白、高爾基糖蛋白73、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子cd147的標(biāo)準(zhǔn)品，和/或以甲胎蛋白、高爾基糖蛋白73、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子cd147的標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線或直線回歸方程說(shuō)明書。

本發(fā)明使用dnastar序列分析軟件對(duì)肝癌血清標(biāo)志物α-l-巖藻糖苷酶(afu)的氨基酸序列(ncbi序列號(hào)：np_000138.2)進(jìn)行分析，綜合考慮蛋白序列的抗原性、特異性、蛋白表達(dá)和純化的難易性等因素，選取了第252-441aa的肽段作為抗原，其氨基酸序列如seqidno.1所示，基因編碼序列如seqidno.2所示。

通過(guò)蛋白原核表達(dá)的方法獲得抗原蛋白并免疫小鼠，篩選出能夠特異結(jié)合afu的單克隆抗體，并通過(guò)elisa雙抗夾心實(shí)驗(yàn)對(duì)獲得的單克隆抗體進(jìn)行配對(duì)，篩選到了能夠用于血清afu定量檢測(cè)的抗體對(duì)，由第一抗體(包被抗體)和第二抗體(檢測(cè)抗體)組成，其雜交瘤細(xì)胞保藏號(hào)分別是cgmccno.13583和cgmccno.13584。所述抗體對(duì)特異性強(qiáng)(可以同時(shí)與其他標(biāo)志物抗體聯(lián)合使用，不受干擾地檢測(cè)出血清中afu，見(jiàn)實(shí)施例4記載)、靈敏度高(可檢測(cè)到濃度低至250pg/ml的afu，見(jiàn)實(shí)施例4記載)，能夠準(zhǔn)確定量血清中的afu蛋白。

本發(fā)明的試劑盒，還可以包括除甲胎蛋白、高爾基糖蛋白73、α-l-巖藻糖苷酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子cd147之外的其它腫瘤標(biāo)志物的特異性抗體，及其相應(yīng)的免疫檢測(cè)試劑。

采用本發(fā)明的抗體對(duì)或試劑盒，結(jié)合luminex技術(shù)、雙抗夾心的免疫學(xué)技術(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)血清中afu的定量檢測(cè)。該方法的檢測(cè)原理是：將偶聯(lián)了第一抗體的磁珠與稀釋后的待測(cè)血清樣品4℃孵育過(guò)夜，形成抗原-特異性抗體復(fù)合物，用洗滌緩沖液洗去未結(jié)合的抗原；加入生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫孵育，形成特異性抗體-抗原-抗體復(fù)合物，用洗滌緩沖液洗去未結(jié)合的抗體；加入鏈霉親和素-藻紅蛋白(sape)，室溫孵育，形成抗體-抗原-抗體-生物素-sape復(fù)合物，用洗滌緩沖液洗去未結(jié)合的sape；加入測(cè)定緩沖液后置于液相懸浮芯片系統(tǒng)中讀取mfi值；最后將mfi值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式中計(jì)算出樣品中afu的濃度，乘以血清樣品的稀釋倍數(shù)得出afu的實(shí)際濃度。

與常規(guī)檢測(cè)方法elisa相比，本發(fā)明的方法具有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，并且可以在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)其它肝癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，如afp，afp-l3，gp73，vegf，cd147等。利用luminex液態(tài)芯片技術(shù)，根據(jù)診斷的實(shí)際需要，對(duì)偶聯(lián)有不同腫瘤標(biāo)志物特異性抗體的熒光編碼微球進(jìn)行自由組合，一次實(shí)驗(yàn)可以同時(shí)完成多種肝癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的定量分析，具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)一次檢測(cè)血漿用量最低10ul，可以同時(shí)檢測(cè)6種血漿蛋白，大大減少了血漿用量，省時(shí)省力，檢測(cè)成本低；(2)液相芯片技術(shù)反應(yīng)體系在液相環(huán)境下，有利于保持生物大分子的活性，使得反應(yīng)體系更加穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果更加可靠準(zhǔn)確；(3)血漿樣品中的肝癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物afp，afp-l3，gp73，afu，vegf，cd147蛋白聯(lián)合檢測(cè)使多種腫瘤標(biāo)志物之間相關(guān)性的分析更加準(zhǔn)確，可以提高肝癌早期的診斷率，以便及時(shí)制定治療方案，延長(zhǎng)患者生命。

生物保藏信息

保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)

地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所

附圖說(shuō)明

圖1.luminex液相芯片檢測(cè)原理示意圖；

圖2.gp73單因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果；

圖3.afu單因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果；

圖4.vegf單因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果；

圖5.cd147單因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果；

圖6.afp單因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果；

圖7.cd147，vegf雙因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果；

cd147和vegf雙因子在同一個(gè)體系中反應(yīng)，抗體之間沒(méi)有發(fā)生交叉反應(yīng)，各因子的反應(yīng)性能沒(méi)有明顯變化。

圖8.cd147，vegf，afp三因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果；

cd147，vegf和afp三因子在同一個(gè)體系中反應(yīng)，抗體之間沒(méi)有發(fā)生交叉反應(yīng)，各因子的反應(yīng)性能沒(méi)有明顯變化。

圖9.cd147，vegf，afp，afu四因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果；

cd147，vegf，afp和afu四因子在同一個(gè)體系中反應(yīng)，抗體之間沒(méi)有發(fā)生交叉反應(yīng)，各因子的反應(yīng)性能沒(méi)有明顯變化。

圖10.cd147，vegf，afp，afu，gp73五因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果；

cd147，vegf，afp，afu和gp73五因子在同一個(gè)體系中反應(yīng)，抗體之間沒(méi)有發(fā)生交叉反應(yīng)，各因子的反應(yīng)性能沒(méi)有明顯變化。

其中，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，需要理解的是，下述實(shí)施例作為解釋和說(shuō)明，不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。

生物材料

balb/c小鼠，購(gòu)自杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；

hela細(xì)胞，購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司；

骨髓瘤細(xì)胞，北京青元盛康生物醫(yī)藥科技有限公司培養(yǎng)和保存；

e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞，e.colibl21感受態(tài)細(xì)胞，為本實(shí)驗(yàn)室保存，可通過(guò)商購(gòu)獲得。

實(shí)驗(yàn)試劑

限制性內(nèi)切酶ecori和xhoi，購(gòu)買自takara公司，貨號(hào)d1040a，d1094a；

載體pet32a，購(gòu)買自novagen公司，貨號(hào)vyn0176；

t4dna連接酶，購(gòu)買自takara公司，貨號(hào)d2011a；

質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)買自takara公司，貨號(hào)9760；

hyclone改良型rpmi-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自hyclone公司，貨號(hào)ab10113944；

無(wú)支原體新生牛血清(超級(jí))，購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司，貨號(hào)22012-8612；

雙抗(100x)，購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)ca0075；

l-谷氨酰胺(100x)，購(gòu)自amresco公司，貨號(hào)amresco0374；

peg(50％w/v聚乙二醇1,500)，購(gòu)自hampton公司，貨號(hào)hr2-525；

hat培養(yǎng)基添加劑(50x)，購(gòu)自gibco公司，貨號(hào)21060-017；

羊抗鼠igg，購(gòu)自碧云天生物，貨號(hào)a0286；

醋酸鈉，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，貨號(hào)10018892；

辛酸，購(gòu)自北京金龍化學(xué)試劑有限公司；

streptavin-hrp(鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶)，購(gòu)自碧云天，貨號(hào)a0303；

sulfo-nhs(n-羥基硫代琥珀酰亞胺)，購(gòu)自sigma公司，貨號(hào)56485；

edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)，購(gòu)自sigma公司，貨號(hào)22980；

mes(2-(n-嗎啡啉)乙磺酸)，購(gòu)自sigma公司，貨號(hào)m2933；

pbs-tbn(封閉/儲(chǔ)存緩沖液)，pbs，含0.1％bsa(bsa購(gòu)自康源生物)，0.02％tween20(tween20購(gòu)自amresco0777)，0.05％azide(azide購(gòu)自sigmas8032)；

assaybuffer(測(cè)定緩沖液)，pbs，含1％bsa(bsa購(gòu)自康源生物)ph7.4；

washbuffer(洗滌緩沖液)，pbs，含0.02％tween20(tween20購(gòu)自amresco0777)，ph7.4；

sape(鏈霉親和素-藻紅蛋白)，購(gòu)自ebioscience公司，貨號(hào)12-4317；

生物素，購(gòu)自sigma公司，貨號(hào)h1759；

甲胎蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品編號(hào)150542-1。

儀器與耗材

磁珠，購(gòu)自luminex公司，貨號(hào)mc10030-01，mc10034-01，mc10036-01，mc10038-01，mc10044-01；

磁性分離器，購(gòu)自biorad公司；

luminex200，購(gòu)自biorad公司，型號(hào)luminex-200。

下述實(shí)施例中，未特別說(shuō)明的生物化學(xué)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可按照常規(guī)方法配制而得或商購(gòu)獲得，規(guī)格為實(shí)驗(yàn)室純級(jí)即可；未特別說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)器材均為本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)器材，可商購(gòu)獲得。

實(shí)施例1.肝癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的單克隆抗體制備

(一)抗原制備

1.高爾基糖蛋白73(gp73)的抗原制備

重組抗原設(shè)計(jì)及制備方法記載在：龐麗君，高爾基體蛋白的基因克隆及原核表達(dá)，醫(yī)藥論壇雜志，2015(9):1-2。按照文章中記載的方法制備得到高純度的抗原gp73-f3r3，其表達(dá)菌種保藏于北京青元盛康生物醫(yī)藥科技有限公司。

2.α-l-巖藻糖苷酶(afu)的抗原制備

2.1抗原設(shè)計(jì)

α-l-巖藻糖苷酶全長(zhǎng)466個(gè)氨基酸，使用dnastar序列分析軟件分析α-l-巖藻糖苷酶的氨基酸序列(ncbi序列號(hào)：np_000138.2)，獲得蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性、抗原性等信息。綜合考慮蛋白序列的抗原性、特異性、蛋白表達(dá)和純化的難易性，選取第252-441aa的肽段作為抗原afu-f2r2，其氨基酸序列如seqidno.1所示，基因編碼序列如seqidno.2所示。

2.2抗原表達(dá)

2.2.1目的片段的獲得

(1)引物設(shè)計(jì)：在正向引物的5’端引入ecori酶切位點(diǎn)，反向引物的5’端引入xhoi酶切位點(diǎn)，得到的引物序列如下：

afu-f2：5’-cggaattcgacagccctgtcaaggatgag-3’；

afu-r2：5’-ccgctcgaggaagagacctttatctggatc-3’。

(2)模板dna的獲得

從hela細(xì)胞中提取基因組dna：方法和步驟參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

反轉(zhuǎn)錄獲得cdna：方法和步驟參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

(3)按照下列pcr體系和程序擴(kuò)增目的片段：

pcr體系：20ul

pcr程序：

2.2.2載體構(gòu)建

(1)酶切反應(yīng)：使用限制性內(nèi)切酶ecori和xhoi，分別對(duì)目的片段和表達(dá)載體pet32a進(jìn)行雙酶切。

酶切體系(100ul)：

ecori：5ul

xhoi：5ul

10×緩沖液：10ul

質(zhì)粒(8ng/ul)：55ul

h2o：25ul

酶切條件：37攝氏度過(guò)夜，獲得線性化pet-32a載體和pcr酶切產(chǎn)物。

(2)連接反應(yīng)：

連接體系(12ul)：

線性化pet-32a載體(ecori/xhoi，8ng/ul)：0.5ul

t4dna連接酶：1ul

10×緩沖液：1.2ul

pcr酶切產(chǎn)物(1ng/ul)：9.3ul

連接條件：室溫連接10h，得到連接產(chǎn)物。

2.2.3蛋白表達(dá)與純化

(1)轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞

e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞放置冰上融化后，加入連接產(chǎn)物，冰上靜置30min。42℃熱處理90s，冰上靜置2min。加入lb培養(yǎng)基600μl，37℃，150rpm搖床培養(yǎng)45min。取200μl菌液涂布于氨芐青霉素抗性(amp⁺)lb平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

(2)陽(yáng)性克隆鑒定

挑取單菌落，接種于lb/amp⁺的液體培養(yǎng)基中，200rpm、37℃培養(yǎng)8小時(shí)，8000rpm離心5min收集菌體。使用質(zhì)粒提取試劑盒，按照說(shuō)明書中的操作步驟提取質(zhì)粒。按照步驟2.2.1中的pcr體系和程序進(jìn)行pcr驗(yàn)證。將pcr鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程有限公司測(cè)序，比對(duì)結(jié)果正確的重組質(zhì)粒作為表達(dá)載體。

(3)轉(zhuǎn)化e.colibl21細(xì)胞

e.colibl21感受態(tài)細(xì)胞放置冰上融化后，加入表達(dá)載體，冰上靜置30min。42℃熱處理90s，冰上靜置2min。加入lb培養(yǎng)基600μl，37℃，150rpm搖床培養(yǎng)45min。取200μl菌液涂布于amp⁺抗性lb平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

(4)蛋白表達(dá)

挑取單菌落，接種于5ml的amp⁺抗性lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，取過(guò)夜培養(yǎng)物140ul加入3ml新鮮的amp⁺抗性lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，達(dá)到od600為0.5左右，加入1/1000iptg(0.8m)，37℃，180rmp培養(yǎng)4h。跑10％的sds-page判斷誘導(dǎo)情況。

(5)蛋白純化

采用硫酸銨沉淀法純化蛋白：將樣品離心，去除沉淀，保留上清液并測(cè)量體積；一邊攪拌一邊慢慢的加入硫酸銨。接著，將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6h，或者4℃攪拌過(guò)夜，使蛋白質(zhì)充分沉淀。將蛋白質(zhì)溶液離心沉淀，棄上清保留沉淀。加入10-20ml的pbs-疊氮化鈉溶液溶解蛋白質(zhì)。蛋白沉淀溶解之后，放入透析袋中透析24-48h，每隔5h更換透析液除去硫酸銨。收集透析液，離心，測(cè)定上清中蛋白質(zhì)的含量。

3.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)的抗原制備

3.1抗原設(shè)計(jì)

使用dnastar序列分析軟件分析人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的氨基酸序列(ncbi序列號(hào)：np_001020539.2)，根據(jù)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性、抗原性等信息，以及各變體的不同作用，選擇第207-371aa的165個(gè)氨基酸的肽段作為抗原vegf-fr，其氨基酸序列如seqidno.5所示，基因編碼序列如seqidno.6所示。

3.2抗原表達(dá)

3.2.1目的片段的獲得

(1)引物設(shè)計(jì)：在正向引物的5’端引入ecori酶切位點(diǎn)，反向引物的5’端引入xhoi酶切位點(diǎn)，得到的引物序列如下：

vegf-f：5’-cggaattcgcacccatggcagaaggaggag-3’；

vegf-r：5’-ccgctcgagccgcctcggcttgtcacatctg-3’。

(2)以2.2.1獲得的cdna為模板，按照下列pcr體系和程序擴(kuò)增目的片段：

pcr體系：20ul

pcr程序：

3.2.2載體構(gòu)建

構(gòu)建方法同2.2.2。

3.2.3蛋白表達(dá)與純化

宿主菌和表達(dá)純化方法同2.2.3。

4.細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(cd147)的抗原制備

4.1抗原設(shè)計(jì)

使用dnastar序列分析軟件分析人cd147的氨基酸序列(proteinid：bac76828.1)，綜合考慮蛋白序列的抗原性、特異性、蛋白表達(dá)和純化的難易性，選取第25-177aa的肽段作為抗原cd147-f3r3，其氨基酸序列如seqidno.9所示，基因編碼序列如seqidno.10所示。

4.2抗原表達(dá)

4.2.1目的片段的獲得

(1)引物設(shè)計(jì)：在正向引物的5’端引入ecori酶切位點(diǎn)，反向引物的5’端引入xhoi酶切位點(diǎn)，得到的引物序列如下：

cd147-f3:5’-cggaattcacagtcttcactaccgtagaag-3’；

cd147-r3:5’-cgctcgagctccatgttcaggttctcaatg-3’。

(2)以2.2.1獲得的cdna為模板，按照下列pcr體系和程序擴(kuò)增目的片段：

pcr體系：20ul

pcr程序：

4.2.2載體構(gòu)建

構(gòu)建方法同2.2.2。

4.2.3蛋白表達(dá)與純化

宿主菌和表達(dá)純化方法同2.2.3。

(二)抗體制備

1.免疫小鼠

準(zhǔn)備出生后8-12周balb/c小鼠兩只(每種抗原免疫兩只小鼠)，用高純度的抗原按照下列方法對(duì)兩只小鼠進(jìn)行免疫：

首次免疫，取100ug抗原+100ul完全佐劑乳化混勻注入小鼠足掌，約80ul/只；第二次免疫，取100ul抗原+100ul不完全佐劑乳化混勻注入小鼠足掌，約80ul/只；第三、四、五次免疫，均同第二次免疫。

2.細(xì)胞融合

以下所有的操作均在超凈臺(tái)中完成。

(1)從培養(yǎng)箱中取出骨髓瘤細(xì)胞，吹開(kāi)貼壁細(xì)胞后倒入離心管中，離心5min，2000轉(zhuǎn)，離心后棄上清，加入40ml冰水浴的rpmi-1640培養(yǎng)基(含2/1雙抗)混勻待用。

(2)準(zhǔn)備三個(gè)培養(yǎng)皿，分別倒入冰水浴的rpmi-1640培養(yǎng)基(含2/1雙抗)，取小鼠大腿內(nèi)側(cè)淋巴細(xì)胞，兩顆，放入第一個(gè)培養(yǎng)皿中，開(kāi)始剪去撕掉淋巴細(xì)胞上的脂肪組織和結(jié)締組織，移入第二個(gè)培養(yǎng)皿中，清洗淋巴結(jié)細(xì)胞，再移入第三個(gè)培養(yǎng)皿中，開(kāi)始撕碎淋巴結(jié)讓細(xì)胞釋放出來(lái)，并用滴管來(lái)回吹打幾下，更有力的釋放出細(xì)胞，接著開(kāi)始過(guò)濾細(xì)胞(用帶有棉花的吸管過(guò)濾到離心管中)至40ml，并標(biāo)記為淋巴結(jié)細(xì)胞，和骨髓瘤細(xì)胞一起離心，10min，2000轉(zhuǎn)/min，離心后各棄上清30ml，開(kāi)始計(jì)數(shù)，將淋巴結(jié)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按比例(gp73為1:3，afu為2:3，vegf為2:3，cd147為1:1)混勻，加入冰水浴的rpmi-1640培養(yǎng)基至50ml，離心5min，2000轉(zhuǎn)/min，棄上清再加入冰水浴的rpmi-1640培養(yǎng)基至50ml，離心5min，2000轉(zhuǎn)/min，棄上清，加入熱的rpmi-1640培養(yǎng)基至50ml，離心5min，2000轉(zhuǎn)/min。

(3)開(kāi)始加入peg：取出混勻且離心后的淋巴結(jié)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，棄上清，吸干凈離心管中剩余的rpmi-1640培養(yǎng)基，取出約0.8mlpeg一滴一滴加入離心管中，并伴隨著輕微的摩擦，搖晃，加入完畢后，放入37度水浴箱中孵育一分鐘，使peg更容易粘合。

(4)取出水浴后的細(xì)胞，開(kāi)始緩慢的加入熱的rpmi-1640培養(yǎng)基，一滴滴加入并伴隨著搖晃，直至35ml，再加至50ml，離心10min，1000轉(zhuǎn)/min。

(5)配制200ml培養(yǎng)液(含hat培養(yǎng)基添加劑(50x)，雙抗(100x)，l-谷氨酰胺(100x)及20％無(wú)支原體新生牛血清)，含10ml飼養(yǎng)層細(xì)胞。

(6)細(xì)胞離心后去上清，加入200ml培養(yǎng)液，混勻，鋪板185ul/孔，10塊板，標(biāo)記1到10號(hào)，放入培養(yǎng)箱中。融合后第六天觀看融合板，并標(biāo)記細(xì)胞孔和單克隆孔，以便檢測(cè)后查找。

3.雜交瘤細(xì)胞的篩選與檢測(cè)

(1)包被快速檢測(cè)板：用抗原包被，2ug/ml，50ul/孔，共二十塊板。用1xpbs稀釋液混勻抗原后加至檢測(cè)板中，37度孵育2小時(shí)，洗五次，拍干后加入封閉液，180ul/孔，37度孵育1小時(shí)，拍干，放入4度待用。

(2)取出十塊快速檢測(cè)板并取出1到10號(hào)融合板，一塊檢測(cè)板對(duì)應(yīng)一塊融合板進(jìn)行elisa檢測(cè)，從融合板中取細(xì)胞培養(yǎng)上清加入檢測(cè)板中，50ul/孔，留取最后四孔分別作為兩陰性孔和陽(yáng)性孔，37度孵育1小時(shí)，取出檢測(cè)板，棄上清，洗板五次，拍干，加入1:10000倍稀釋的羊抗鼠二抗(稀釋液pbst-bsa)，50ul/孔，37度1小時(shí)，洗板5次，拍干，加入tmb顯色十分鐘，加入終止液，讀數(shù)，標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞孔。

(2)第二天取出十塊新的快速檢測(cè)板，對(duì)1到10號(hào)融合板再次進(jìn)行elisa檢測(cè)，讀數(shù)，標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞孔。選出兩次檢測(cè)都是陽(yáng)性的細(xì)胞孔且讀值在1以上的細(xì)胞孔，gp73為17株，afu為12株，vegf為10株，cd147為10株，準(zhǔn)備克隆。

(3)單克隆抗體的檢測(cè)：配400ml培養(yǎng)液(含hat培養(yǎng)基添加劑(50x)、雙抗(100x)、l-谷氨酰胺(100x)、20％無(wú)支原體新生牛血清)，含20ml飼養(yǎng)層細(xì)胞。顯微鏡下觀察每孔細(xì)胞數(shù)量，取出約80的細(xì)胞數(shù)量，平均鋪板，190ul/孔，放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)七天，觀看克隆板，記錄下單克隆孔，并進(jìn)行elisa檢測(cè)，根據(jù)od450>0.8的篩選標(biāo)準(zhǔn)，選出單克隆抗體株。

(4)選定單克隆抗體株后，加入新的培養(yǎng)液(含飼養(yǎng)層細(xì)胞)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)四天后，打開(kāi)克隆板觀看細(xì)胞數(shù)量和培養(yǎng)液顏色，細(xì)胞量長(zhǎng)滿約占孔2/3，觀看細(xì)胞孔中的細(xì)胞狀態(tài)。

gp73定株的是：2f10a4，4d3d5，7b7b3，1c10b5，1g9c8，3d10b5，4g8d7，8f10d1，10b9f11，10c11b1，4g8e12和7e11d11。

afu定株的是：1e1d1，3b6c3，3f12d8，1a4h4，3f12e4，10e11g10，10f10g10，5f2c3，7b9h5，4g1h4，5e5a5，5e5g5，5f2d7。

vegf定株的是：1d2e5，3b1d8，4c3d12，4d3e5，5c7f10，5e1c3，7a11d4，7a11e10，8e10d8。

cd147定株的是：1a2d8，3d6c6，4a4c3，5a4e9，5c9g1，6a1d4，6b7f12。

(5)包被一塊快速檢測(cè)板，檢測(cè)24孔中的細(xì)胞。

4.制備腹水

(1)準(zhǔn)備二十只已生育過(guò)的小鼠，注入石蠟油，約1ml/只。

(2)將24孔中長(zhǎng)滿的細(xì)胞傳入六孔，在六孔中長(zhǎng)滿后再傳入小瓶中，在小瓶中長(zhǎng)滿后，將細(xì)胞注入小鼠腹中。

(3)經(jīng)過(guò)十五天后觀看小鼠腹部，出現(xiàn)大肚情況即可抽取腹水，處理腹水，離心10min，2000轉(zhuǎn)/min，留取上清，保存于零下20度備用。

5.腹水純化抗體

以sorvall50ml離心管作為反應(yīng)容器，利用辛酸法從小鼠腹水中純化單克隆抗體，實(shí)驗(yàn)步驟如下：

(1)將10ml腹水在室溫20000rpm離心30min；

(2)取10ml上清液加入20ml0.06mph4.0醋酸鈉緩沖液，然后用1mnaoh調(diào)節(jié)ph至ph4.8；

(3)逐滴加入750ul辛酸，室溫快速攪拌30min；然后室溫離心混合物20000rpm，30min；小心傾出上清液，并用槍頭吸走沉淀物上面附著的上清液；

(4)用1l0.1mph6.5napo4，4mmedta透析兩次，3小時(shí)換一次液，得到抗體溶液，測(cè)定蛋白濃度。

實(shí)施例2.用于雙抗夾心法檢測(cè)的抗體對(duì)配對(duì)

(一)elisa雙抗夾心配對(duì)實(shí)驗(yàn)

按照如下步驟，分別對(duì)實(shí)施例1純化得到的每一種蛋白的單克隆抗體進(jìn)行配對(duì)實(shí)驗(yàn)：

1、包被：包被抗體(實(shí)施例1純化得到的單抗之一)用pbs(ph＝7.4)稀釋至5ug/ml。每孔100ul，37℃包被1h。

2、洗板：pbst洗5次，拍干。

3、封閉：封閉液(含3％bsa和4％蔗糖pbs)，每孔200ul，37℃封閉1h。

4、干燥：不洗板，拍干殘液，風(fēng)干30min。

5、加入抗原：抗原(實(shí)施例1中純化得到的抗原)用含1％bsa的pbs(ph＝7.4)稀釋至2ug/ml，加入酶標(biāo)板，從第1孔(2ug/ml)倍比稀釋至第11孔(0.2ng/ml)，每孔100ul，第12孔加含1％bsa的pbs(ph＝7.4)作為陰性對(duì)照，37℃孵育40min。

6、洗板：pbst洗5次，拍干。

7、加入檢測(cè)抗體：用含1％bsa的pbs(ph＝7.4)稀釋生物素標(biāo)記的單抗(實(shí)施例1純化得到的單抗之一)，然后加入酶標(biāo)板，每孔100ul，37℃孵育40min。

8、洗板：pbst洗5次，拍干。

9、加入streptavin-hrp：用含1％bsa的pbs(ph＝7.4)稀釋streptavin-hrp，每孔100ul，37℃作用30min。

10、洗板：pbst洗5次，拍干。

11、顯色：每孔加入四甲基聯(lián)苯胺(tmb)100ul顯色。

12、終止反應(yīng)：每孔加入1mh2so4100ul，酶標(biāo)儀讀值。

結(jié)果如下表所示：

表1.gp73雙抗夾心配對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2.afu雙抗夾心配對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3.vegf雙抗夾心配對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4.cd147雙抗夾心配對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以甲胎蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為抗原，按照上述elisa雙抗夾心實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室已有的抗afp的抗體對(duì)(包被抗體3b11h5和檢測(cè)抗體2g5e8)，結(jié)果表明，抗afp抗體對(duì)的抗原檢測(cè)極限為1.6ng/ml。

(二)配對(duì)抗體對(duì)血清的檢測(cè)效果驗(yàn)證

按照上述elisa雙抗夾心配對(duì)實(shí)驗(yàn)步驟，以人血清為抗原，驗(yàn)證配對(duì)較好的抗體對(duì)的檢測(cè)效果，篩選出檢測(cè)效果最好的抗體并送中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心進(jìn)行保藏，結(jié)果如下：

gp73：包被抗體8f10d1，檢測(cè)抗體10b9f11；

afu：包被抗體3f12d8(cgmccno：13583)，檢測(cè)抗體10f10g10(cgmccno：13584)；

vegf：包被抗體7a11d4(cgmccno：13585)，檢測(cè)抗體8e10d8(cgmccno：13586)；

cd147：包被抗體4a4c3(cgmccno：13587)，檢測(cè)抗體6b7f12(cgmccno：13588)；

afp：包被抗體3b11h5(cgmccno：13581)，檢測(cè)抗體2g5e8(cgmccno：13582)。實(shí)施例3.抗體的偶聯(lián)和標(biāo)記

1、磁珠與包被抗體的偶聯(lián)

(1)清洗磁珠：懸浮未偶聯(lián)的磁珠(mc10030-01，mc10034-01，mc10036-01，mc10038-01，mc10044-01)，轉(zhuǎn)移5.0×10⁶個(gè)磁珠到離心管中，將離心管放到磁性分離器上分離30-60s，吸出上清，加入100uldh2o渦旋重新懸浮磁珠，磁性分離器上分離30-60s，吸出上清。

(2)活化磁珠：加入80ul0.1mnah2po4(ph6.2)，渦旋懸浮磁珠；再加入10ul50mg/mlsulfo-nhs(n-羥基硫代琥珀酰亞胺)和10ul50mg/mledc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)，渦旋混勻，室溫孵育20分鐘以活化微球。然后用250ul50mmph5.0mes(2-(n-嗎啡啉)乙磺酸)溶液洗兩次，以除去未接合的sulfo-nhs和edc。

(3)抗體偶聯(lián)磁珠：取100ul50mmmes(ph5.0)加入活化后的磁珠中重懸磁珠，取10-20ug實(shí)施例2篩選得到的最佳包被抗體加入對(duì)應(yīng)的磁珠中(一種蛋白對(duì)應(yīng)一種磁珠)，用mes定容至500ul，室溫下避光反應(yīng)2小時(shí)。將離心管放到磁性分離器上分離30-60s，吸出上清。

(4)保存偶聯(lián)抗體的磁珠：加入500ulpbs-tbn作為封閉緩沖液，室溫下旋轉(zhuǎn)振動(dòng)孵育30分鐘。將離心管放到磁性分離器上分離30-60s，除去上清，用1mlpbs-tbn作為清洗緩沖液洗兩次，吸出上清，加入250-1000ulpbs-tbn4℃保存。

(5)抗體偶聯(lián)效率的確認(rèn)：用assaybuffer稀釋抗體偶聯(lián)后的磁珠(微球組)，使其終濃度為50磁珠/ul,加入96孔板，50ul/孔。將生物素標(biāo)記的羊抗鼠igg稀釋成4ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml，0.25ug/ml，0.125ug/ml，0.0625ug/ml，每孔加入50ul，空白對(duì)照加入50ulassaybuffer，室溫震蕩孵育30min，washbuffer洗3次，加入sape50ul/孔，室溫振蕩孵育30分鐘，washbuffer洗2次，最后加入80ulassaybuffer上機(jī)(luminex200)檢測(cè)，結(jié)果如下表所示。

表6腫瘤標(biāo)志物抗體偶聯(lián)確認(rèn)結(jié)果

2、檢測(cè)抗體的生物素標(biāo)記

將2mg生物素(sigma)溶解于200ul溶劑dmso中，將實(shí)施例2中篩選得到的最佳檢測(cè)抗體用ph＝9.6的碳酸緩沖液溶解至1mg/ml450ul。向檢測(cè)抗體溶液中加入溶解好的生物素50ul(有機(jī)溶劑占體系10％，生物素過(guò)量)，室溫反應(yīng)4h后加500ul純甘油，保存于-20℃冰箱中備用。

實(shí)施例4.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將實(shí)施例1制備得到的抗原用assaybuffer進(jìn)行4倍梯度稀釋，得到濃度分別為1000ng/ml，250ng/ml，64ng/ml，16ng/ml，4ng/ml，1ng/ml，0.25ng/ml抗原溶液，同時(shí)以assaybuffer作為空白對(duì)照。

將實(shí)施例3中偶聯(lián)好的磁珠用assaybuffer稀釋好后，避光96孔板中每孔加入50ul，96孔板放入磁板上，每孔加入120ulwashbuffer，靜置2分鐘，倒掉washbuffer，加入不同濃度梯度的抗原，4℃過(guò)夜反應(yīng)(15-18h)，washbuffer洗三次；加入稀釋好的生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，50ul/孔，室溫800轉(zhuǎn)/分孵育30分鐘；washbuffer洗三次；加入sape，50ul/孔，室溫800轉(zhuǎn)/分孵育30分鐘，washbuffer洗兩次，加入80ulassaybuffer上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果如圖2-6所示，afp，gp73，afu，vegf敏感度均可達(dá)到250pg/ml，cd147敏感度可達(dá)到64pg/ml。

此外還進(jìn)行了cd147/vegf雙因子，cd147/vegf/afp三因子，cd147/vegf/afp/afu四因子，以及cd147/vegf/afp/afu/gp73五因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)。具體檢測(cè)方法同上，不同之處在于：(1)將偶聯(lián)了不同腫瘤標(biāo)志物包被抗體的磁珠混合成一個(gè)體系；(2)抗原為不同腫瘤標(biāo)志物抗原的混合液；(3)檢測(cè)抗體為稀釋好的生物素標(biāo)記的不同腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)抗體的混合液。

結(jié)果如表7-10所示：

表7.cd147，vegf雙因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果

表8.cd147，vegf，afp三因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果

表9.cd147，vegf，afp，afu四因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果

表10.cd147，vegf，afp，afu，gp73五因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果

多因子檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的包被抗體和檢測(cè)抗體具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)特異性強(qiáng)：多對(duì)抗體在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多種蛋白時(shí)的反應(yīng)性能與單獨(dú)檢測(cè)每種蛋白時(shí)的反應(yīng)性能無(wú)明顯變化，各因子抗體與其它因子之間未發(fā)生交叉反應(yīng)。

(2)準(zhǔn)確性好：在同一反應(yīng)體系中，各因子抗體之間不發(fā)生交叉反應(yīng)。

(3)靈敏度高：在同一反應(yīng)體系中，檢測(cè)afp，gp73，afu，vegf的靈敏度均可達(dá)到250pg/ml，檢測(cè)cd147的靈敏度可達(dá)到64pg/ml。

sequencelisting

<110>馬,杰

<120>用于檢測(cè)血清中α-l-巖藻糖苷酶的抗體及試劑盒

<130>p160545／yay

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>190

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>α-l-巖藻糖苷酶抗原的氨基酸序列

<400>1

aspserprovallysaspgluvalvalvalasnaspargtrpglygln

151015

asncyssercyshishisglyglytyrtyrasncysgluasplysphe

202530

lysproglnserleuproasphislystrpglumetcysthrserile

354045

asplysphesertrpglytyrargargaspmetalaleuseraspval

505560

thrgluglusergluileilesergluleuvalglnthrvalserleu

65707580

glyglyasntyrleuleuasnileglyprothrlysaspglyleuile

859095

valproilepheglngluargleuleualavalglylystrpleuser

100105110

ileasnglyglualailetyralaserlysprotrpargvalglntrp

115120125

glulysasnthrthrservaltrptyrthrserlysglyseralaval

130135140

tyralailepheleuhistrpprogluasnglyvalleuasnleuglu

145150155160

serproilethrthrserthrthrlysilethrmetleuglyilegln

165170175

glyaspleulystrpserthraspproasplysglyleuphe

180185190

<210>2

<211>570

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>α-l-巖藻糖苷酶抗原的基因編碼序列

<400>2

gacagccctgtcaaggatgaggtggtagtaaatgaccgatggggtcagaactgttcctgt60

caccatggaggatactataactgtgaagataaattcaagccacagagcttgccagatcac120

aagtgggagatgtgcaccagcattgacaagttttcctggggctatcgtcgtgacatggca180

ttgtctgatgttacagaagaatctgaaatcatttcggaactggttcagacagtaagtttg240

ggaggcaactatcttctgaacattggaccaactaaagatggactgattgttcccatcttc300

caagaaaggcttcttgctgttgggaaatggctgagcatcaatggggaggctatctatgcc360

tccaaaccatggcgggtgcaatgggaaaagaacacaacatctgtatggtatacctcaaag420

ggatcggctgtttatgccatttttctgcactggccagaaaatggagtcttaaaccttgaa480

tcccccataactacctcaactacaaagataacaatgctgggaattcaaggagatctgaag540

tggtccacagatccagataaaggtctcttc570

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>α-l-巖藻糖苷酶抗原編碼序列的pcr正向引物afu-f2

<400>3

cggaattcgacagccctgtcaaggatgag29

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>α-l-巖藻糖苷酶抗原編碼序列的pcr反向引物afu-r2

<400>4

ccgctcgaggaagagacctttatctggatc30

<210>5

<211>165

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗原的氨基酸序列

<400>5

alaprometalagluglyglyglyglnasnhishisgluvalvallys

151015

phemetaspvaltyrglnargsertyrcyshisproilegluthrleu

202530

valaspilepheglnglutyrproaspgluileglutyrilephelys

354045

prosercysvalproleumetargcysglyglycyscysasnaspglu

505560

glyleuglucysvalprothrglugluserasnilethrmetglnile

65707580

metargilelysprohisglnglyglnhisileglyglumetserphe

859095

leuglnhisasnlyscysglucysargprolyslysaspargalaarg

100105110

glngluasnprocysglyprocyssergluargarglyshisleuphe

115120125

valglnaspproglnthrcyslyscyssercyslysasnthraspser

130135140

argcyslysalaargglnleugluleuasngluargthrcysargcys

145150155160

asplysproargarg

165

<210>6

<211>495

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗原的基因編碼序列

<400>6

gcacccatggcagaaggaggagggcagaatcatcacgaagtggtgaagttcatggatgtc60

tatcagcgcagctactgccatccaatcgagaccctggtggacatcttccaggagtaccct120

gatgagatcgagtacatcttcaagccatcctgtgtgcccctgatgcgatgcgggggctgc180

tgcaatgacgagggcctggagtgtgtgcccactgaggagtccaacatcaccatgcagatt240

atgcggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagagatgagcttcctacagcacaac300

aaatgtgaatgcagaccaaagaaagatagagcaagacaagaaaatccctgtgggccttgc360

tcagagcggagaaagcatttgtttgtacaagatccgcagacgtgtaaatgttcctgcaaa420

aacacagactcgcgttgcaaggcgaggcagcttgagttaaacgaacgtacttgcagatgt480

gacaagccgaggcgg495

<210>7

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗原編碼序列的pcr正向引物vegf-f

<400>7

cggaattcgcacccatggcagaaggaggag30

<210>8

<211>31

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗原編碼序列的pcr反向引物vegf-r

<400>8

ccgctcgagccgcctcggcttgtcacatctg31

<210>9

<211>153

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>cd147抗原的氨基酸序列

<400>9

thrvalphethrthrvalgluaspleuglyserlysileleuleuthr

151015

cysserleuasnaspseralathrgluvalthrglyhisargtrpleu

202530

lysglyglyvalvalleulysgluaspalaleuproglyglnlysthr

354045

gluphelysvalaspseraspaspglntrpglyglutyrsercysval

505560

pheleuprogluprometglythralaasnileglnleuhisglypro

65707580

proargvallysalavallyssersergluhisileasngluglyglu

859095

thralametleuvalcyslyssergluservalproprovalthrasp

100105110

trpalatrptyrlysilethraspsergluasplysalaleumetasn

115120125

glysergluserargphephevalserserserglnglyargserglu

130135140

leuhisilegluasnleuasnmetglu

145150

<210>10

<211>459

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>抗原的基因編碼序列

<400>10

acagtcttcactaccgtagaagaccttggctccaagatactcctcacctgctccttgaat60

gacagcgccacagaggtcacagggcaccgctggctgaaggggggcgtggtgctgaaggag120

gacgcgctgcccggccagaaaacggagttcaaggtggactccgacgaccagtggggagag180

tactcctgcgtcttcctccccgagcccatgggcacggccaacatccagctccacgggcct240

cccagagtgaaggctgtgaagtcgtcagaacacatcaacgagggggagacggccatgctg300

gtctgcaagtcagagtccgtgccacctgtcactgactgggcctggtacaagatcactgac360

tctgaggacaaggccctcatgaacggctccgagagcaggttcttcgtgagttcctcgcag420

ggccggtcagagctacacattgagaacctgaacatggag459

<210>11

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>cd147抗原編碼序列的pcr正向引物cd147-f3

<400>11

cggaattcacagtcttcactaccgtagaag30

<210>12

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>cd147抗原編碼序列的pcr反向引物cd147-r3

<400>12

cgctcgagctccatgttcaggttctcaatg30