本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中，檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品及相關(guān)試劑與制備方法。

背景技術(shù)：

鴨坦布蘇病毒病是黃病毒科黃病毒屬鴨坦布蘇病毒(ducktembusvirus，dtmuv)引起的以鴨死亡和蛋鴨產(chǎn)蛋下降為特征的新發(fā)傳染病。自2010年4月以來，在我國河北、江蘇、安徽、浙江、福建等地區(qū)產(chǎn)蛋鴨和種鴨群中先后出現(xiàn)了鴨坦布蘇病毒病，鴨群患病后4～5d左右產(chǎn)蛋率可從80～85迅速下降至20～30，甚至停產(chǎn)，發(fā)病率達(dá)60～100％，該病在中國大部分省份均有發(fā)生和流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。加強(qiáng)對(duì)該病檢測(cè)方法的研究，對(duì)控制鴨坦布蘇病毒病的發(fā)生，保護(hù)和促進(jìn)養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展，具有重要意義。

目前，dtmu的檢測(cè)主要依賴病毒分離和分子生物學(xué)檢測(cè)。病毒分離是dtmuv的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，主要從病鴨的卵泡膜、腦、脾臟、肝臟等病變組織分離病毒。鴨坦布蘇病毒的快速檢測(cè)主要使用pcr方法。顏丕熙等成功建立了鴨坦布蘇病毒套式rt-pcr檢測(cè)方法；yan等根據(jù)鴨坦布蘇病毒e基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和taqman探針，建立了快速檢測(cè)鴨坦布蘇病毒實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr方法；張帥等在對(duì)鴨坦布蘇病毒序列比對(duì)分析的基礎(chǔ)上，建立了該病毒一步式rt-pcr檢測(cè)方法；姬希文等以純化的毒株作為包被抗原，建立了檢測(cè)鴨坦布蘇病毒血清抗體的間接elisa法；郝明飛等對(duì)鴨坦布蘇病毒e基因進(jìn)行了克隆表達(dá)并初步建立了快速檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的間接elisa法。高緒慧等建立了探針檢測(cè)鴨黃病毒的地高辛標(biāo)記dna的方法。這些方法過程繁多，操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長，成本高，而且還需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)人員，不適合田間樣品的檢測(cè)。目前急需一種可特異、簡便、快速檢測(cè)dtmuv的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何檢測(cè)鴨坦布蘇病毒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了鴨坦布蘇病毒的免疫檢測(cè)產(chǎn)品，包括相互連接的樣品墊、吸收墊和具有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線的包被膜，所述包被膜位于所述樣品墊和所述吸收墊之間，其特征在于：所述樣品墊上負(fù)載有熒光納米晶標(biāo)記單抗，所述檢測(cè)線包被有鴨坦布蘇病毒抗體，所述質(zhì)檢線包被有與所述熒光納米晶標(biāo)記單抗特異結(jié)合的第二抗體；

所述熒光納米晶標(biāo)記單抗為將雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體(將該單克隆抗體命名為a單抗)和氨基修飾的熒光納米晶顆粒以肽鍵共價(jià)結(jié)合形成的聚合體；

所述雜交瘤細(xì)胞在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為cctccno：c201712。所述雜交瘤細(xì)胞是將小鼠脾細(xì)胞與nso細(xì)胞融合得到的細(xì)胞；所述小鼠脾細(xì)胞為以序列2所示的蛋白質(zhì)(其名稱為蛋白質(zhì)a)免疫小鼠得到的可分泌抗蛋白質(zhì)a抗體的脾細(xì)胞。

所述a單抗可特異識(shí)別序列2或序列2的第21-136位所示的蛋白質(zhì)與鴨坦布蘇病毒。

上述產(chǎn)品中，所述包被膜可為具有相互分離的所示檢測(cè)線和所述質(zhì)控線的硝酸纖維素膜。

上述產(chǎn)品中，所述樣品墊和所述包被膜間還可含有連接墊；所述連接墊負(fù)載有熒光納米晶標(biāo)記單抗。

上述產(chǎn)品中，所述熒光納米晶標(biāo)記單抗可按照包括如下步驟的方法制備：將所述氨基修飾的熒光納米晶顆粒與所述單克隆抗體按照1：3的質(zhì)量比進(jìn)行反應(yīng)得到以肽鍵共價(jià)結(jié)合形成的熒光納米晶顆粒與所述單克隆抗體的偶聯(lián)物。

所述氨基修飾的熒光納米晶顆粒為利用氨基硅烷修飾熒光納米晶顆粒得到的產(chǎn)物。

所述熒光納米晶顆粒具體可由bhhct與eucl3·6h2o制備得到。

上述產(chǎn)品中，所述鴨坦布蘇病毒抗體可為以序列2或序列2的第21-136位所示的蛋白質(zhì)為抗原免疫動(dòng)物得到的多克隆抗體或單克隆抗體。

上述產(chǎn)品中，所述動(dòng)物可為家兔。

上述產(chǎn)品中，所述與所述熒光納米晶標(biāo)記單抗特異結(jié)合的第二抗體可為羊抗鼠igg。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細(xì)胞。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述a單抗。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了檢測(cè)或輔助檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的方法，該方法包括：

將待測(cè)樣品加至所述產(chǎn)品的樣品墊上，孵育5-30分鐘后根據(jù)紫外線下所述產(chǎn)品的檢測(cè)線是否發(fā)光確定待測(cè)樣品是否含有鴨坦布蘇病毒：如所述檢測(cè)線發(fā)紅光，待測(cè)樣品含有或候選含有鴨坦布蘇病毒；如所述檢測(cè)線不發(fā)紅光，待測(cè)樣品不含或候選不含鴨坦布蘇病毒。

上述方法中，所述孵育時(shí)間可為10-20分鐘。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了檢測(cè)或輔助檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的成套試劑，該成套試劑由所述雜交瘤細(xì)胞或所述a單抗與所述鴨坦布蘇病毒抗體組成。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：

x1、所述雜交瘤細(xì)胞在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)鴨坦布蘇病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；

x2、所述a單抗在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)鴨坦布蘇病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；

x3、所述產(chǎn)品在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)鴨坦布蘇病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；

x4、所述成套試劑在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)鴨坦布蘇病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；

x5、所述雜交瘤細(xì)胞在檢測(cè)或輔助檢測(cè)鴨坦布蘇病毒中的應(yīng)用；

x6、所述a單抗在檢測(cè)或輔助檢測(cè)鴨坦布蘇病毒中的應(yīng)用；

x7、所述產(chǎn)品在檢測(cè)或輔助檢測(cè)鴨坦布蘇病毒中的應(yīng)用；

x8、所述成套試劑在檢測(cè)或輔助檢測(cè)鴨坦布蘇病毒中的應(yīng)用；

x9、所述雜交瘤細(xì)胞在制備單克隆抗體中的應(yīng)用；

x10、序列2或序列2的第21-136位所示的蛋白質(zhì)在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)鴨坦布蘇病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明研制了一種特異、簡便、快速、直觀的鴨坦布蘇病毒的免疫檢測(cè)產(chǎn)品(檢測(cè)dtmuv的熒光納米晶試紙條)，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒的免疫檢測(cè)產(chǎn)品可以特異識(shí)別dtmuv，檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的靈敏度為0.1ng/ml鴨坦布蘇病毒蛋白，重復(fù)性好，可在4℃下可以保存6個(gè)月；具有高特異性、高敏感性和高準(zhǔn)確性，特異性達(dá)99.47％，敏感性達(dá)92.86％，準(zhǔn)確性達(dá)98.60％。本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒的免疫檢測(cè)產(chǎn)品可以檢測(cè)dtmuv抗原，檢測(cè)時(shí)間需要10-20分鐘，在紫外線下可以直接確定結(jié)果，為有效監(jiān)控dtmuv的發(fā)病提供了有力的工具，并可以用于臨床診斷。

生物材料保藏說明

生物材料的分類命名：雜交瘤細(xì)胞株

生物材料的菌株編號(hào)：dtmuv-e-10a7

生物材料的保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)

生物材料的保藏單位簡稱：cctcc

生物材料的保藏單位地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)，武漢大學(xué)保藏中心郵編：430072

生物材料的保藏日期：2017年2月24日

生物材料的保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：cctccno：c201712

附圖說明

圖1為純化前后蛋白質(zhì)a的檢測(cè)結(jié)果。

圖2為a單抗的sds-page電泳檢測(cè)結(jié)果。

圖3為在不同抗體濃度下的質(zhì)檢線與檢測(cè)線發(fā)生目的反應(yīng)后在紫外下的亮度。其中質(zhì)控線為質(zhì)檢線；1為羊抗鼠igg抗體的濃度為0.8mg/ml，2為羊抗鼠igg抗體的濃度為1mg/ml；3為a單抗的濃度為0.8mg/ml，4為a單抗的濃度為1mg/ml。

圖4為熒光納米晶試紙條的結(jié)構(gòu)。

圖5為熒光納米晶試紙條a的特異性檢測(cè)結(jié)果。其中，1為陰性血清，2為pbs，3為dtmuv，4為dpv，5為dhv，6為ndv，7為aiv，8為ibv，9為arv，10為edsv。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的鴨坦布蘇病毒(ducktembusvirus，dtmuv)為dtmuvfx2010分離株(姬希文,閆麗萍,顏丕熙,李國新,張七斤,李澤君.鴨坦布蘇病毒抗體間接elisa檢測(cè)方法的建立[j].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,08:630-634.)公眾可從申請(qǐng)人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的鴨瘟病毒(dpv)(齊雪峰,程安春,汪銘書,楊曉燕,賈仁勇,陳孝躍.鴨瘟病毒抗體間接elisa檢測(cè)試劑盒的研制[j].中國獸醫(yī)科學(xué),2007,08:690-694.)、鴨病毒性肝炎病毒(dhv)(馬秀麗,宋敏訓(xùn),于可響,廖明,辛朝安.鴨病毒性肝炎病毒vp1基因表達(dá)及其抗體檢測(cè)elisa方法的建立[j].微生物學(xué)報(bào),2008,08:1110-1114.)、番鴨源禽ⅰ型副粘病毒(ndv)(傅光華,程龍飛,施少華,彭春香,黃瑜.番鴨源禽1型副粘病毒px2/03株p基因的克隆及原核表達(dá)[j].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,06:599-603.)、禽流感病毒(aiv)(譚偉,徐倩,謝芝勛.禽流感病毒研究概述[j].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2014,01:194-199.)、禽傳染性支氣管炎病毒(ibv)(周生,王紅寧,唐夢(mèng)君,黃勇,柳萍.禽傳染性支氣管炎病毒saibk株全基因組的分段克隆、測(cè)序及分析[j].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,01:72-77.)、番鴨呼腸孤病毒(arv)(祁保民,陳曉燕,吳寶成,姚金水,張紅雷.番鴨呼腸孤病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡觀察[j].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,04:495-499.)、減蛋綜合癥病毒(edsv)(陳滔.重組減蛋綜合癥病毒knob-s蛋白免疫原性及雞il-2和il-18對(duì)其實(shí)、免疫增強(qiáng)效應(yīng)研究[d].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2012)，公眾均可從申請(qǐng)人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的pet-28a(+)為novagen公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為69865-3。

下述實(shí)施例中的非變性鎳柱結(jié)合緩沖液ⅰ由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度分別為：0.1mtris–hcl、0.1mnacl、0.01m咪唑(imidazole)、0.5mmedta，ph為8.0。

下述實(shí)施例中的非變性鎳柱洗脫緩沖液ⅱ的制備方法由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度分別為：0.1mtris-hcl、0.1mnacl、0.5m咪唑(imidazole)、0.5mmedta，ph為8.0。

下述實(shí)施例中的balb/c小鼠為南方醫(yī)科大學(xué)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的家兔為濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司產(chǎn)品。

實(shí)施例1、抗體的制備

一、作為抗原的融合蛋白的制備

1、重組載體的獲得

將pet-28a(+)載體的ndei和hindiii識(shí)別序列間的dna片段替換為序列1的所示的來源于鴨坦布蘇病毒(ducktembusvirus，dtmuv)的dna分子，保持pet-28a(+)載體的其他序列不變，得到重組載體，將該重組載體命名為pet-a，pet-a能表達(dá)序列2所示的融合蛋白質(zhì)，將該融合蛋白質(zhì)命名為蛋白質(zhì)a。

其中，序列1所示的dna分子編碼序列2所示的蛋白質(zhì)，序列1的第61-408位編碼序列2的第21-136位所示的蛋白質(zhì)，序列1的第1-60位為pet-28a(+)載體上的dna序列，序列1的第13-30位編碼序列2的第5-10位所示的his-tag。

表達(dá)對(duì)照蛋白的重組載體的獲得：

將pet-28a(+)載體的ndei和hindiii識(shí)別序列間的dna片段替換為序列3的所示的來源于鴨坦布蘇病毒(ducktembusvirus，dtmuv)的dna分子，保持pet-28a(+)載體的其他序列不變，得到重組載體，將該重組載體命名為pet-b，pet-b能表達(dá)序列4所示的融合蛋白質(zhì)，將該融合蛋白質(zhì)命名為蛋白質(zhì)b。蛋白質(zhì)b及與之相關(guān)的實(shí)驗(yàn)在本申請(qǐng)中作為對(duì)照。

其中，序列3所示的dna分子編碼序列4所示的蛋白質(zhì)。

2、重組菌的獲得

將步驟1的pet-a導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)中，得到重組菌，將該重組菌命名為bl21-pet-a；將步驟1的pet-b導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)中，得到重組菌，將該重組菌命名為bl21-pet-b；將pet-28a(+)載體導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)中，得到重組菌，將該重組菌命名為bl21-pet。

3、融合蛋白的獲得

挑取步驟2的bl21-pet-a的單菌落接入含有卡那霉素培養(yǎng)基(卡那霉素培養(yǎng)基為向lb培養(yǎng)基中加入卡那霉素得到的卡那霉素濃度為50μg/ml的液體培養(yǎng)基)中，于37℃過夜培養(yǎng)，得到過夜培養(yǎng)物。將過夜培養(yǎng)物接種于1l卡那霉素培養(yǎng)基中，在37℃下劇烈振蕩(200rpm)發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，該發(fā)酵液的od600值在0.6-0.8左右；向發(fā)酵液中加入iptg，得到蛋白誘導(dǎo)前液，蛋白誘導(dǎo)前液中iptg的濃度為0.1mm；將蛋白誘導(dǎo)前液在20℃、80rpm的條件下過夜培養(yǎng)(共培養(yǎng)12小時(shí))，得到蛋白誘導(dǎo)發(fā)酵液；將蛋白誘導(dǎo)發(fā)酵液在6000rpm下離心10分鐘，棄上清液，收集菌體；用非變性鎳柱結(jié)合緩沖液ⅰ重懸菌體后，得到菌體懸液；用超聲波破碎菌體懸液中的菌體后，12000rpm離心10min，收集上清液，該上清液即為含有蛋白質(zhì)a的粗提液，超聲波破碎菌體的條件為：超聲5s，間歇5s，40w的功率，30個(gè)循環(huán)。

按照上述方法，將bl21-pet-a替換為bl21-pet-b，其他步驟均不變，得到含有蛋白質(zhì)b的粗提液；按照上述方法，將bl21-pet-a替換為bl21-pet，其他步驟均不變，得到作為對(duì)照的蛋白粗提液。

4、融合蛋白的純化

采用鎳柱親和層析對(duì)步驟3的含有蛋白質(zhì)a的粗提液進(jìn)行純化，在amersham公司的aktafplc系統(tǒng)中用1ml裝量的hitrapchelatinghpcolumn(鎳柱)純化上清。非變性鎳柱結(jié)合緩沖液ⅰ用于平衡純化柱體和上樣。蛋白上樣量為10ml，流速設(shè)為1ml/min。用非變性鎳柱洗脫緩沖液a(非變性鎳柱洗脫緩沖液a由非變性鎳柱結(jié)合緩沖液ⅰ和非變性鎳柱洗脫緩沖液ⅱ的混合溶液組成，其中，非變性鎳柱洗脫緩沖液ⅱ占非變性鎳柱洗脫緩沖液a的體積百分比為25％)進(jìn)行洗滌，去除非特異性結(jié)合的雜蛋白。用非變性鎳柱洗脫緩沖液b(非變性鎳柱洗脫緩沖液b由非變性鎳柱結(jié)合緩沖液ⅰ和非變性鎳柱洗脫緩沖液ⅱ的混合溶液組成，其中，非變性鎳柱洗脫緩沖液ⅱ占非變性鎳柱洗脫緩沖液b的體積百分比為80％)進(jìn)行洗脫，收集含洗脫峰的洗脫液，該洗脫液中為純化后的蛋白溶液，將其命名為蛋白溶液1，用sds-page檢測(cè)蛋白溶液1中蛋白質(zhì)a的純度。結(jié)果顯示(圖1)蛋白溶液a含有高純度的蛋白質(zhì)a，大小為20kda左右。圖1中，a為sds-page結(jié)果，b為western-blot結(jié)果，一抗為histag抗體，泳道m(xù)為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1和3均為含有蛋白質(zhì)a的粗提液，泳道2和4均為蛋白溶液1。

按照上述方法，將含有蛋白質(zhì)a的粗提液替換為含有蛋白質(zhì)b的粗提液，其他步驟均不變，得到含有蛋白質(zhì)b的純化后的蛋白溶液，將其命名為蛋白溶液b，用sds-page檢測(cè)蛋白溶液b中蛋白質(zhì)b的純度。結(jié)果顯示蛋白溶液b含有純的蛋白質(zhì)b，大小為22kda左右。

二、多克隆抗體的制備

按劑量1mg蛋白質(zhì)a/只，皮下分點(diǎn)注射免疫家兔，利用福氏不完全佐劑(fia)增強(qiáng)免疫效果，首免后每隔2周用同樣的方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共免疫6次，最后一次免疫后兩周，耳靜脈采血，分離血清，用蛋白質(zhì)a包被的elisa板檢測(cè)抗體效價(jià)，取具有較高的抗體滴度家兔的頸動(dòng)脈血，收集全血，分離得到兔抗血清。

用辛酸硫酸銨法粗提取兔抗血清igg，透析，再依次過sephadexg25和deae纖維素柱進(jìn)一步提純，并將收集的蛋白質(zhì)于透析袋中。置蔗糖或聚乙二醇中濃縮，得到抗蛋白質(zhì)a的igg，將其命名為a多抗，用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定蛋白質(zhì)含量，將其稀釋至10mg/ml，置于-80℃保存?zhèn)溆?。利用蛋白質(zhì)a檢測(cè)a多抗的抗體效價(jià)，檢測(cè)到a多抗的抗體效價(jià)為1:16。

按照上述方法，將蛋白質(zhì)a替換為蛋白質(zhì)b，其他步驟均不變，得到抗蛋白質(zhì)b的igg，將其命名為b多抗，用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定蛋白質(zhì)含量，將其稀釋至10mg/ml，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、單克隆抗體的制備

1、免疫：

選取8周齡balb/c小鼠10只，以步驟一的蛋白質(zhì)a與fca作為免疫原，免疫劑量為200μg/只(100μg蛋白質(zhì)a+100μlfca+0.1％tween80)，皮下分點(diǎn)注射。于首免后2-6周進(jìn)行，免疫劑量為200μg/只(100μl蛋白質(zhì)a+100μlfia+0.1％tween80)。共免疫3-4次，每次免疫間隔2周。最后1次免疫10天后，斷尾采血分離血清，用間接elisa法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。

2、雜交瘤細(xì)胞的建立與陽性克隆的篩選：

選取elisa法檢測(cè)抗體效價(jià)(1:1000)較高的免疫小鼠，眶下竇采血，分離血清。脫頸致死小鼠；無菌手術(shù)取出脾臟制備脾細(xì)胞，并與ns0細(xì)胞在50％peg作用下進(jìn)行細(xì)胞融合；將融合后的細(xì)胞懸液加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，用hat培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。融合后的細(xì)胞置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；用間接elisa法以0.5μg/孔的蛋白質(zhì)a的量包被酶標(biāo)板進(jìn)行陽性篩選。p/n大于2.1時(shí)即為陽性。對(duì)強(qiáng)陽性、細(xì)胞生長旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化，得到克隆化的陽性雜交瘤細(xì)胞株，將該雜交瘤細(xì)胞株命名為雜交瘤細(xì)胞株dtmuv-e-10a7，雜交瘤細(xì)胞株dtmuv-e-10a7已于2017年2月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：cctccno：c201712。

3、單抗的大量制備：

采用腹水法大量制備單克隆抗體。將步驟2的雜交瘤細(xì)胞株dtmuv-e-10a7擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞濃度達(dá)5×10⁵個(gè)/ml時(shí)停止換液，直至細(xì)胞全部死亡，收集培養(yǎng)液，測(cè)定其elisa效價(jià)；8周齡balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟10天后再腹腔注射雜交瘤細(xì)胞株e92，每只小鼠腹腔注射10⁷個(gè)雜交瘤細(xì)胞株dtmuv-e-10a7，7天后抽取腹水，用dtmuv病毒懸液包被酶標(biāo)板測(cè)其elisa效價(jià)。

4、單抗的純化：

采用辛酸—硫酸銨法進(jìn)行單抗的純化。(1)將20ml步驟3得到的腹水加入離心管中，于4℃12000rpm下離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一容器中；(2)向上清液中加入4倍血清體積的0.06mph4.8的醋酸緩沖液，室溫邊加邊攪拌，得到混合液體；(3)向步驟(2)得到的混合液體中加入適量的辛酸(每毫升混合液體中加入33μl辛酸)，滴加時(shí)要緩慢，室溫滴加，邊滴加邊攪拌；(4)辛酸滴加完后，室溫?cái)嚢?0min；(5)于4℃離心，12000rpm×30min，取上清，用濾紙過濾，得到濾液；(6)向?yàn)V液中加入硫酸銨至45％飽和度(sas)，室溫?cái)嚢?0min，4℃靜置2h或過夜；(7)于4℃離心12000rpm下離心30min，棄上清，沉淀用適量0.01mol/lph7.4pbs重懸，用0.01mol/lph7.4pbs于4℃透析24h，其間換液4次；(8)將透析物于4℃、12000rpm下離心30min，收集上清液分裝于ep管中，該上清液即為含有純化后的抗蛋白質(zhì)a的單克隆抗體(即a單抗)的液體，將該液體命名為a單抗溶液，用核酸蛋白測(cè)定檢測(cè)儀測(cè)定a單抗溶液中的a單抗含量，稀釋至10mg/ml，置于-20℃保存。

用elisa的方法檢測(cè)a單抗溶液中a單抗的效價(jià)，a單抗的效價(jià)為1:51200。

將步驟3得到的未純化的腹水和a單抗溶液進(jìn)行sds-page電泳分析(圖2)。未純化腹水上清泳道出現(xiàn)多條雜帶(泳道1)，而純化后的單克隆抗體(a單抗溶液)僅在53ku和22ku出現(xiàn)igg輕鏈和重鏈的條帶，無雜帶出現(xiàn)(泳道2)，表明純化效果良好。

5、單克隆抗體特異性檢測(cè)：

用a單抗分別與鴨瘟病毒(dpv)、鴨病毒性肝炎病毒(dhv)、番鴨源禽ⅰ型副粘病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)、禽傳染性支氣管炎病毒(ibv)、番鴨呼腸孤病毒(arv)、減蛋綜合癥病毒(edsv)和鴨坦布蘇病毒(dtmuv)以及陰性血清(未感染dtmuv的鴨的血清)與蛋白質(zhì)a包被的elisa板反應(yīng)，鑒定a單抗的特異性。具體方法如下：

將病毒抗原稀釋成濃度為5μg/ml的工作抗原、蛋白質(zhì)a稀釋成濃度為5μg/ml的工作抗原，取100μl工作抗原加入酶免板的各個(gè)孔中，每種抗原9個(gè)孔，加入包被液(ph9.6，15mmna2co3，35mmnahco3，0.2mnacl)，放置于4℃冷藏箱過夜；將包被好抗原酶免板棄去孔內(nèi)液體，同時(shí)用pbs緩沖液洗3次，每次每孔300μl，最后一次拍干酶免板；按100μl/孔加入封閉液，37℃放置1h；pbs緩沖液洗3次；按100μl/孔加入a單抗，同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照(dtmuv陽性血清，感染dtmuv的鴨子的血清)、陰性對(duì)照(dtmuv陰性血清，未感染dtmuv的鴨子的血清)和空白對(duì)照(不加a單抗)，每種抗原的陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照均3個(gè)孔；37℃放置1h；用pbs緩沖液洗3次，每次每孔300μl，拍干；按100μl/孔加入酶標(biāo)二抗(二抗為羊抗鼠igg抗體)，37℃放置1h，用pbs緩沖液洗3次，每次每孔300μl，拍干；按100μl/孔加入tmb，37℃閉光孵育20min；按100μl/孔加入稀硫酸，終止反應(yīng)，在10min，將酶免板放置于在酶標(biāo)儀上記錄od值；結(jié)果判定：以od陽性對(duì)照/od陰性對(duì)照≧2.1為陽性。若陰性對(duì)照孔透明或接近透明，陽性對(duì)照孔顯呈黃色或藍(lán)色，則可直接判定檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果顯示，a單抗可特異識(shí)別蛋白質(zhì)a，a單抗與相應(yīng)病毒抗原包被elisa板反應(yīng)時(shí)呈強(qiáng)陽性，與其它病毒包被elisa板反應(yīng)時(shí)均為陰性(表1)。表明a單抗可以特異識(shí)別dtmuv。

表1、單克隆抗體特異性試驗(yàn)

注：表1中，“-”表示陰性，“+”表示陽性。

實(shí)施例2、熒光納米晶試紙條的制備

一、熒光納米晶顆粒的制備及表面修飾

1、熒光納米晶顆粒制備

將1.1ml的去離子水加入100ml的潔凈圓底燒瓶中，然后再分別加入4.74g的tritonx-100、3.64g的正辛醇以及14.50g環(huán)己烷，制成w/o型微乳液，向其中加入6.15mgbhhct(abcam，貨號(hào)：ab145314)和1.37mgeucl3·6h2o(上海永葉生物科技有限公司，貨號(hào)：s42353)；攪拌0.5h后，加入200μl的teos(sigma公司，貨號(hào)：x-020)和200μl12mol/l的濃氨水；室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)后，加入約40ml丙酮結(jié)束反應(yīng)，離心棄上清液。沉淀部分分別用乙醇和超純水將沉淀洗3次后，于真空干燥箱中干燥2h，得到熒光納米晶顆粒。

2、熒光納米晶顆粒的表面修飾

(1)將氨基硅烷溶于無水乙醇中得到氨基硅烷的質(zhì)量百分比濃度為5％的氨基硅烷溶液；

(2)將步驟1的熒光納米晶顆粒于150℃加熱4h干燥；然后用1mol/l四水乙酸鎳洗滌幾次，離心去上清液，得到清洗后的熒光納米晶顆粒；

(3)在通風(fēng)櫥內(nèi)，將步驟(1)的氨基硅烷溶液和步驟(2)的清洗后的熒光納米晶顆粒加熱回流12-24h，溫度為120℃；冷卻，用1mol/l四水乙酸鎳洗滌產(chǎn)物，棄上清液，得到氨基化顆粒；

(4)將戊二酸酐溶于二甲基甲酰胺(dmf)中，直至接近飽和，加入三乙胺，得到溶液甲，溶液甲中戊二酸酐的濃度為1g/ml，三乙胺的濃度為1mg/ml；將步驟(3)所得氨基化顆粒懸浮于溶液甲中，攪拌2-4h；用dmf洗滌氨基化表面，然后用去離子水洗滌干凈，得到表面修飾后的熒光納米晶顆粒，用去離子水重懸表面修飾后的熒光納米晶顆粒，得到表面修飾后的熒光納米晶顆粒(即氨基修飾的熒光納米晶顆粒)濃度為1mg/ml的熒光納米晶顆粒液體，備用。

二、熒光納米晶顆粒標(biāo)記單克隆抗體

取步驟一的熒光納米晶顆粒液體50μl，用50mmmes緩沖液(ph6.0)洗滌2次，1ml/次；用600μl50mmmes緩沖液(ph6.0)重懸熒光納米晶顆粒，得到顆粒懸浮液，將其命名為顆粒懸浮液1；向該顆粒懸浮液1中加入sulfo-nhs和edc，得到反應(yīng)液1，反應(yīng)液1中sulfo-nhs的濃度為20mg/ml，edc的濃度為20mg/ml，將反應(yīng)液1室溫?fù)u動(dòng)反應(yīng)30min；離心，棄上清液；用1ml50mm緩沖液mes(ph6.0)洗滌顆粒一次；用1ml50mm緩沖液mes(ph6.0)重懸顆粒，得到顆粒懸浮液，將其命名為顆粒懸浮液2；向顆粒懸浮液2中加入50μg實(shí)施例1的a單抗，室溫振搖反應(yīng)1h，得到反應(yīng)液2；向反應(yīng)液2中加入與反應(yīng)液2等體積的pbs-bsa溶液(pbs-bsa溶液為向pbs中加入bsa得到的bsa質(zhì)量百分比濃度為2％的液體，ph7.4)，繼續(xù)反應(yīng)1h，得到反應(yīng)液3；將反應(yīng)液3離心，檢測(cè)上清液中抗體的濃度。

按照上述方法，將向顆粒懸浮液2中加入實(shí)施例1的a單抗的量分別設(shè)為50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg對(duì)熒光納米晶顆粒進(jìn)行標(biāo)記，用bca蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)標(biāo)記后的上清液中抗體的濃度。取上清液中的抗體的濃度剛好升高的前一個(gè)濃度為最佳抗體用量，最終確定與50μl1mg/ml熒光納米晶顆粒共價(jià)偶聯(lián)的最佳a(bǔ)單抗的量為150μg。

將150μga單抗與50μl1mg/ml熒光納米晶顆粒共價(jià)偶聯(lián)得到的反應(yīng)液3進(jìn)行離心，棄上清液；用50mmmes緩沖液(ph6.0)洗滌顆粒3次，1ml/次，棄上清液，得到熒光納米晶顆粒標(biāo)記的a單抗；用300μl重懸液(重懸液為向10mmtris-hcl(ph8.0)中加入蔗糖得到的蔗糖的質(zhì)量百分比濃度為10％的液體)重懸熒光納米晶顆粒標(biāo)記的a單抗，得到熒光納米晶顆粒標(biāo)記a單抗懸浮液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、熒光納米晶試紙條的制備

1、熒光納米晶試紙條中硝酸纖維素膜的制備

以a多抗作為硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線包被抗體，以羊抗鼠igg(abcam公司，ab6789)作為硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線包被抗體，具體方法如下：

采用0.02mpbs(ph＝7.4)緩沖液，將羊抗鼠igg抗體和a多抗的濃度均配制為濃度1mg/ml，利用bio-dotxyz3050噴膜系統(tǒng)將羊抗鼠igg抗體噴至硝酸纖維素膜(nc膜)的質(zhì)檢線(c線)位置，將a多抗噴至檢測(cè)線(testline，t線)位置，噴樣速度為1.0μl/cm，然后于相對(duì)濕度為10％以下的干燥條件下進(jìn)行抽濕4小時(shí)后，得到噴有抗體的硝酸纖維素膜，干燥密封保存待用。

在噴制質(zhì)檢線時(shí)，采用用0.02mpbs(ph＝7.4)緩沖液將羊抗鼠igg抗體配制為不同濃度的羊抗鼠igg抗體溶液(不同羊抗鼠igg抗體溶液中羊抗鼠igg抗體的濃度分別為0.5mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、1.2mg/ml、1.5mg/ml)噴至nc膜的c線處，并在相對(duì)濕度為10％以下的干燥條件下進(jìn)行抽濕4小時(shí)后，用步驟二的抗體標(biāo)記顆粒懸浮液進(jìn)行檢測(cè)，在紫外線下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著羊抗鼠igg濃度的增加，質(zhì)檢線的亮度也逐漸增加，在達(dá)到1mg/ml后亮度不再明顯增加，因此確定質(zhì)檢線的最佳包被條件為1mg/ml的羊抗鼠igg。

在噴制檢測(cè)線時(shí)，采用用0.02mpbs(ph＝7.4)緩沖液將a多抗配制為不同濃度的a多抗溶液(不同a多抗溶液中a多抗的濃度分別為0.5mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、1.2mg/ml、1.5mg/ml)噴至nc膜的c線處，并在相對(duì)濕度為10％以下的干燥條件下進(jìn)行抽濕4小時(shí)后，用步驟二的抗體標(biāo)記顆粒懸浮液與蛋白質(zhì)a反應(yīng)后得到的顆粒進(jìn)行檢測(cè)，在紫外線下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著a多抗?jié)舛鹊脑黾樱瑱z測(cè)線的亮度也逐漸增加，在達(dá)到1mg/ml后亮度不再明顯增加，因此確定檢測(cè)線的最佳包被條件為1mg/ml的a多抗。如圖3所示。

2、熒光納米晶試紙條中樣品墊的制備

用膜處理緩沖液(膜處理緩沖液為向0.02mpbs(ph＝7.4)中加入tritonx-100、bsa和蔗糖得到的tritonx-100、bsa和蔗糖的質(zhì)量百分比濃度分別為2％、1％和1％的溶液)處理玻璃纖維樣品墊，抽濕4小時(shí)待用；用上述膜處理緩沖液按1:100稀釋步驟二的熒光納米晶顆粒標(biāo)記a單抗懸浮液，得到稀釋的熒光納米晶顆粒標(biāo)記a單抗懸浮液，采用bio-dotxyz3050噴膜系統(tǒng)將稀釋的熒光納米晶顆粒標(biāo)記a單抗懸浮液噴涂至上述處理過的樣品墊上，噴有熒光納米晶顆粒標(biāo)記a單抗的樣品墊，抽濕干燥備用。

3、連接墊的制備

用膜處理緩沖液處理硝酸纖維素膜連接墊，抽濕4小時(shí)待用；采用bio-dotxyz3050噴膜系統(tǒng)將步驟2的稀釋的熒光納米晶顆粒標(biāo)記a單抗懸浮液噴涂至上述處理過的連接墊上，噴有熒光納米晶顆粒標(biāo)記a單抗的連接墊，抽濕干燥備用。

4、熒光納米晶試紙條的組裝

按照?qǐng)D4進(jìn)行組裝：

制備好的連接墊與樣品墊重疊連接。將噴有檢測(cè)線和質(zhì)檢線硝酸纖維素膜粘貼于襯板上，將吸水墊、連接墊重疊的樣品墊分別粘帖于硝酸纖維素膜的兩端，均與nc膜重合疊壓3mm，試紙條裝配模式同膠體金試紙條，進(jìn)而采用bio-dotgm4500切條機(jī)將其裁成5mm寬的條狀，4℃密封干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

熒光納米晶試紙條a的預(yù)期反應(yīng)結(jié)果：

當(dāng)待檢液體樣品沿著試紙條通過毛細(xì)作用向上泳動(dòng)時(shí)，如果被檢樣品中含有dtmuv時(shí)，dtmuv的抗原首先與熒光納米晶顆粒上的a單抗結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物繼續(xù)流動(dòng)，與被固定在檢測(cè)線上的a多抗結(jié)合捕獲，從而在檢測(cè)線上富集，在紫外線照射激發(fā)下發(fā)出紅光，沒有被捕獲的結(jié)合有a單抗的熒光納米晶顆粒繼續(xù)向前流動(dòng)，與固定在質(zhì)檢線上的羊抗鼠igg免疫球蛋白結(jié)合，并在質(zhì)檢線上富集，在紫外線照射激發(fā)下發(fā)出紅光；如果被檢樣品中不含dtmuv時(shí)，結(jié)合有a單抗的熒光納米晶顆粒與固定在質(zhì)檢線上的羊抗鼠igg免疫球蛋白結(jié)合，并在質(zhì)檢線上富集，在紫外線照射激發(fā)下發(fā)出紅光。

在紫外線照射下，在檢測(cè)線和質(zhì)檢線同時(shí)出現(xiàn)紅色條帶的判為陽性反應(yīng)，待檢液體中含有dtmuv抗原；只在質(zhì)檢線出現(xiàn)紅色條帶的判為陰性反應(yīng)，待檢液體中不含dtmuv抗原；如果質(zhì)檢線未出現(xiàn)紅色條帶，則表明操作過程不正確或試紙條失效。

按照步驟1至步驟4的方法，將a多抗替換為b多抗，b多抗的用量為a多抗的最佳用量，其他步驟均不變，得到熒光納米晶試紙條，將該熒光納米晶試紙條命名為熒光納米晶試紙條b，作為對(duì)照。

實(shí)施例3、熒光納米晶試紙條的特異性

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的具體步驟如下：

用實(shí)施例2的熒光納米晶試紙條a和熒光納米晶試紙條b分別檢測(cè)鴨瘟病毒(dpv)、鴨病毒性肝炎病毒(dhv)、番鴨源禽ⅰ型副粘病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)、禽傳染性支氣管炎病毒(ibv)、番鴨呼腸孤病毒(arv)、減蛋綜合癥病毒(edsv)和鴨坦布蘇病毒(dtmuv)以及陰性血清(未感染dtmuv的鴨的血清)，具體步驟如下：

用pbs分別重懸鴨瘟病毒(dpv)、鴨病毒性肝炎病毒(dhv)、番鴨源禽ⅰ型副粘病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)、禽傳染性支氣管炎病毒(ibv)、番鴨呼腸孤病毒(arv)、減蛋綜合癥病毒(edsv)和鴨坦布蘇病毒(dtmuv)，分別得到相應(yīng)病毒懸液，即dpv懸液、dhv懸液、ndv懸液、aiv懸液、ibv懸液、arv懸液、edsv懸液和dtmuv懸液，各病毒懸液中病毒的含量相同。

用移液器將dpv懸液、dhv懸液、ndv懸液、aiv懸液、ibv懸液、arv懸液、edsv懸液和dtmuv懸液以及pbs和陰性血清分別垂直緩慢滴至實(shí)施例2的熒光納米晶試紙條a的樣品墊上，10-20min后在紫外線下進(jìn)行觀察，結(jié)果如表2和圖5所示。

用移液器將dpv懸液、dhv懸液、ndv懸液、aiv懸液、ibv懸液、arv懸液、edsv懸液和dtmuv懸液以及pbs和陰性血清分別垂直緩慢滴至實(shí)施例2的熒光納米晶試紙條b的樣品墊上，10-20min后在紫外線下進(jìn)行觀察，結(jié)果如表2所示。

表2、熒光納米晶試紙條特異性試驗(yàn)結(jié)果

注：表2中，“-”表示陰性，即質(zhì)檢線發(fā)紅光且檢測(cè)線無紅光，“+”表示陽性，即質(zhì)檢線與檢測(cè)線均發(fā)紅光。

結(jié)果顯示，熒光納米晶試紙條a可以特異識(shí)別dtmuv，熒光納米晶試紙條b不能識(shí)別dtmuv。

實(shí)施例4、熒光納米晶試紙條的靈敏度

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的具體步驟如下：

用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定鴨坦布蘇病毒液280nm、260nm波長處od值，按以下公式計(jì)算鴨坦布蘇病毒蛋白濃度。鴨坦布蘇病毒蛋白濃度(mg/ml)＝(1.45×od280-0.74×od260)×稀釋倍數(shù)

將鴨坦布蘇病毒(dtmuv)用pbs懸浮，得到鴨坦布蘇病毒液，將鴨坦布蘇病毒液稀釋，分別得鴨坦布蘇病毒蛋白到濃度為0.05、0.1、1、5、10、20、50、100、200、500ng/ml的dtmuv懸液。檢測(cè)前先將待檢測(cè)樣品恢復(fù)室溫，用移液器將100μl各dtmuv懸液及pbs(即dtmuv的濃度為0ng/ml)垂直緩慢滴加在實(shí)施例2的熒光納米晶試紙條a的樣品墊上，10-20min后用手持式紫外燈進(jìn)行照射，觀察檢測(cè)結(jié)果，如表3所示。

根據(jù)文獻(xiàn)《鴨坦布蘇病毒e基因主要抗原域的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備》(孫濤等，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，第38卷第6期，2016年6月)公開的單克隆細(xì)胞株4g8、6b12，獲取這兩株細(xì)胞株表達(dá)出的單抗4g8、6b12。

按照實(shí)施例步驟三的方法，將a多抗分別替換為單抗4g8和6b12，單抗4g8和6b12的用量均為a多抗的最佳用量，其他步驟均不變，得到熒光納米晶試紙條4g8和熒光納米晶試紙條6b12。

按照上述方法，將熒光納米晶試紙條a替換為熒光納米晶試紙條4g8和熒光納米晶試紙條6b12，其他步驟均不變，得到熒光納米晶試紙條4g8和6b12的靈敏度檢測(cè)結(jié)果(表3)。

表3、熒光納米晶試紙條靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

注：表3中，“-”表示陰性，即質(zhì)檢線發(fā)紅光且檢測(cè)線無紅光，“+”表示陽性，即質(zhì)檢線與檢測(cè)線均發(fā)紅光。

由上述結(jié)果可知，熒光納米晶試紙條a可以檢測(cè)到鴨坦布蘇病毒蛋白濃度為0.1ng/ml的dtmuv，熒光納米晶試紙條4g8可以檢測(cè)到鴨坦布蘇病毒蛋白濃度為100ng/ml的dtmuv，熒光納米晶試紙條6b12可以檢測(cè)到鴨坦布蘇病毒蛋白濃度為100ng/ml的dtmuv，表明，熒光納米晶試紙條a的靈敏度為0.1ng/ml鴨坦布蘇病毒蛋白，遠(yuǎn)高于熒光納米晶試紙條4g8和6b12的靈敏度。

實(shí)施例5、熒光納米晶試紙條的重復(fù)性

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的具體步驟如下：

用實(shí)施例4的10ng/ml的dtmuv懸液作為陽性樣品檢測(cè)隨機(jī)抽取的實(shí)施例2的不同批次(共3個(gè)批次)及同一批次中不同的熒光納米晶試紙條a(每批次選取30個(gè))，檢測(cè)試紙條的重復(fù)性。陽性樣品共檢測(cè)隨機(jī)抽取的不同批次及同一批次中不同的熒光納米晶試紙條a90個(gè)，具體實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例4進(jìn)行，用pbs作為陰性對(duì)照樣品。結(jié)果顯示在紫外燈下這90個(gè)試紙條的結(jié)果一致，質(zhì)檢線與檢測(cè)線均發(fā)熒光，表明，熒光納米晶試紙條a的重復(fù)性好。

實(shí)施例6、熒光納米晶試紙條的質(zhì)保期限

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的具體步驟如下：

取實(shí)施例2的熒光納米晶試紙條a100條，保存于4℃冰箱中，在熒光納米晶試紙條a在4℃下保存分別滿1、2、3、4、5、6、7、8、9和10個(gè)月時(shí)取出10條，連同新制備得到的熒光納米晶試紙條a(即保存0個(gè)月)用實(shí)施例4的10ng/ml的dtmuv懸液作為陽性樣品進(jìn)行檢測(cè)，確定熒光納米晶試紙條a的質(zhì)保期限(表4)，用pbs作為陰性對(duì)照樣品。

表4、熒光納米晶試紙條質(zhì)保期限試驗(yàn)結(jié)果

注：表4中，“*”表示質(zhì)檢線與檢測(cè)線均無紅光，“+”表示陽性，即質(zhì)檢線與檢測(cè)線均發(fā)紅光。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4℃保存6個(gè)月內(nèi)，熒光納米晶試紙條a的檢測(cè)結(jié)果沒有任何變化，熒光納米晶試紙條a在4℃保存滿7個(gè)月及更長時(shí)間時(shí)，試紙條失效，不能檢測(cè)到dtmuv。結(jié)果表明，熒光納米晶試紙條a在4℃下可以保存6個(gè)月。

實(shí)施例7、熒光納米晶試紙條的準(zhǔn)確性

采用實(shí)施例2的熒光納米晶試紙條a以及rt-pcr的方法對(duì)臨床上采集的215個(gè)鴨血清樣品進(jìn)行dtmuv檢測(cè)，結(jié)果如表5所示。rt-pcr用到的引物為：f1：5’ctagtgaagaatcctaccg一3’f2：5’-aagtgaattcacccccaactgagcc-3’，采用的試劑為primescript^tmonesteprt-pcrkitver.2(寶生物工程(大連)有限公司，貨號(hào)：rr057a)。

表5、試紙條及rt-pcr檢測(cè)樣品的結(jié)果

根據(jù)表4計(jì)算利用熒光納米晶試紙條a檢測(cè)dtmuv的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性，特異性為：186/187＝99.47％；敏感性為：26/28＝92.86％；準(zhǔn)確性：(26+186)/215＝98.60％。利用熒光納米晶試紙條a檢測(cè)dtmuv具有高特異性、高敏感性和高準(zhǔn)確性。

<110>徐成蔚

<120>檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品及相關(guān)試劑與制備方法

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