本發(fā)明涉及單細胞的電學(xué)特性檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種細胞膜比電容的檢測系統(tǒng)及方法。

背景技術(shù)：

單細胞電學(xué)特性，作為一種重要的單細胞生物物理特性，已經(jīng)被證明可以用于區(qū)分不同的腫瘤細胞和血細胞，同時對于理解細胞功能和狀態(tài)有著非常重要的意義和潛在價值。

在單細胞電學(xué)特性的研究中，細胞被等效為一個電容電阻網(wǎng)絡(luò)，其中雙層磷脂結(jié)構(gòu)的細胞膜被等效為電容，主要為電解質(zhì)的細胞質(zhì)被等效為電阻?？紤]到細胞存在尺寸上的異質(zhì)性，使用獨立于細胞尺寸的單位面積細胞膜電容等參數(shù)才能進行細胞間的比較。

傳統(tǒng)研究細胞電學(xué)特性的方法主要有：介電泳法，電致旋轉(zhuǎn)法，膜片鉗等。其中介電泳(dep)只能得到細胞群體特性，無法研究單個細胞的電學(xué)特性。電致旋轉(zhuǎn)法(electrorotation)也是利用了介電泳力，且操作復(fù)雜，測量效率極低。膜片鉗是一種被廣泛應(yīng)用于電生理學(xué)研究的方法，測量精確性依賴于操作中嫻熟的封接技術(shù)以及測量位置的選擇，而且測量單個細胞耗時很長，用于單細胞膜特性測量效率太低。因此，基于傳統(tǒng)方法，雖然可以得到群體或者個別單個細胞的電學(xué)特性，但是無法得到具有統(tǒng)計學(xué)意義數(shù)量的單個細胞電學(xué)特性。

微流控技術(shù)，因為特征尺寸與細胞相比擬，可以更方便的操控細胞，天然適合用于單細胞生物物理特性方法的檢測?；谖⒘骺丶夹g(shù)的單細胞電學(xué)特性高通量表征主要是基于阻抗頻譜技術(shù)(microelectricalimpedancespectroscopy)和微阻抗流式細胞儀。這類方法由于電極間的溶液導(dǎo)電導(dǎo)致電極間存在大量繞過細胞的漏電流，影響了測量能力，從而不能得到細胞固有電學(xué)特性參數(shù)。

目前存在的微流控檢測方法中，還包括基于單入單出(“一”字形)壓縮通道(即橫截面積小于細胞橫截面積)的單細胞電學(xué)特性測量方法，方法中包含的檢測系統(tǒng)核心為包括單入單出(“一”字形)壓縮通道結(jié)構(gòu)的微流控芯片，當細胞在負壓驅(qū)動下被拉過壓縮通道時，阻抗測量模塊測量壓縮通道兩端阻抗，圖像采集模塊采集細胞在壓縮通道中運動的圖像，再結(jié)合電學(xué)模型轉(zhuǎn)換得到穿過壓縮通道的細胞膜比電容等單細胞固有電學(xué)特性參數(shù)。這種方法雖然能夠高通量(約1個/秒)得到單細胞電學(xué)特性，但是面對細胞量在10⁶個級別的病人腫瘤樣本等單細胞電學(xué)特性檢測的需求，目前方法難以滿足。而且該方法中需要使用顯微鏡通過光學(xué)方法得到細胞的長度，從而進一步得到細胞獨立于尺寸的電學(xué)特性參數(shù)，因此需要用到顯微鏡和高速攝像頭，且圖像、數(shù)據(jù)處理的過程極為復(fù)雜。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

(一)要解決的技術(shù)問題

本發(fā)明目的在于提供一種細胞膜比電容的檢測系統(tǒng)及方法，以解決上述的至少一項技術(shù)問題。

(二)技術(shù)方案

本發(fā)明提供了一種細胞膜比電容的檢測系統(tǒng)，包括：

一微流控芯片，包括一絕緣承載體，所述絕緣承載體包括一對交叉通道，所述交叉通道的第一通道位于第一方向，用于供細胞流動，第二通道位于與第一方向交叉的第二方向，用于進行電學(xué)測量；

一驅(qū)動器，與所述第一通道相連，用于驅(qū)使細胞定向流動；

兩個電極，與所述第二通道的兩端相連；

一阻抗測量模塊，其兩端分別與所述兩個電極相連，用于測量至少兩個不同的頻率下，電極間的阻抗變化。

優(yōu)選地，所述第一通道包括細胞流入通道，細胞穿行壓縮通道和細胞回收通道，所述第二通道包括導(dǎo)電通道和導(dǎo)電壓縮通道；所述導(dǎo)電壓縮通道與細胞穿行壓縮通道交叉，并在兩端通過導(dǎo)電通道與電極相連接。

優(yōu)選地，所述細胞穿行壓縮通道與導(dǎo)電壓縮通道交叉形成交叉壓縮通道，所述交叉壓縮通道沿第一方向的橫截面積小于所述交叉壓縮通道中細胞的橫截面積，沿第二方向的橫截面積小于所述被壓縮的細胞的橫截面積。

優(yōu)選地，所述細胞流入通道，細胞穿行壓縮通道，導(dǎo)電通道，導(dǎo)電壓縮通道和細胞回收通道均充滿導(dǎo)電溶液，且所述兩個電極均與所述導(dǎo)電通道的導(dǎo)電溶液接觸。

優(yōu)選地，所述驅(qū)動器包括氣壓驅(qū)動器，所述氣壓驅(qū)動器包括正壓驅(qū)動器或負壓驅(qū)動器。

優(yōu)選地，所述阻抗變化包括交叉壓縮通道的交叉部分無細胞時電極間的阻抗z總體1和交叉部分有細胞時電極間的阻抗z總體2。

優(yōu)選地，所述系統(tǒng)還可以包括一計算模塊，與所述阻抗測量模塊相連，用于根據(jù)所述阻抗變化計算得到細胞膜比電容，計算公式包括：

z總體1＝((r通道1+r通道2)+r通道3)||z寄生電容

r通道3＝r阻*((r通道1+r通道2)+r通道3)

z寄生電容＝1/(2*π*f*f*c寄生電容*j)

z總體2＝z寄生電容||((r通道1+r通道2)+(r漏||(r細胞質(zhì)+z細胞膜1+z細胞膜2)))

c細胞膜＝0.5c細胞膜1＝0.5c細胞膜2

z細胞膜電容＝1/(2*π*f*c細胞膜電容*j)

2*c細胞膜＝c細胞膜比*s導(dǎo)電壓縮

其中，(r通道1+r通道2)為導(dǎo)電通道和導(dǎo)電壓縮通道除交叉部分之外的導(dǎo)電溶液電阻總和，r通道3為交叉壓縮通道交叉部分的導(dǎo)電溶液電阻，r通道3與通道總電阻(r通道1+r通道2+r通道3)的比例為r阻，r漏為在交叉部分細胞周圍沒有完全填充部分的漏電阻，c寄生電容為電極間的寄生電容，r細胞質(zhì)為細胞質(zhì)電阻，f為所述頻率，c細胞膜比為細胞膜比電容，c細胞膜為細胞膜串聯(lián)電容，細胞穿行到交叉部分時，填充在導(dǎo)電壓縮通道中除交叉部分之外的兩側(cè)的細胞膜電容分別為c細胞膜1和c細胞膜2，s導(dǎo)電壓縮為導(dǎo)電壓縮通道橫截面積；j為復(fù)數(shù)中虛數(shù)符號，*為乘法，/為除法，||為電路并聯(lián)。

基于同一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種細胞膜比電容的檢測方法，采用上述的細胞膜比電容的檢測系統(tǒng)，包括步驟：

s1、測量在至少兩個不同頻率下，電極間的阻抗變化；

s2、將細胞在交叉壓縮通道中電極間的電路等效為細胞電學(xué)等效模型，得到計算公式；

s3、將步驟1中的阻抗變化代入所述計算公式，得到細胞膜比電容；

優(yōu)選地，所述阻抗變化包括在至少兩個不同頻率下，交叉部分無細胞時電極間的阻抗z總體1和交叉部分有細胞時電極間的阻抗z總體2。

優(yōu)選地，步驟s2中計算公式指：

z總體1＝((r通道1+r通道2)+r通道3)||z寄生電容

r通道3＝r阻*((r通道1+r通道2)+r通道3)

z寄生電容＝1/(2*π*f*c寄生電容*j)

z總體2＝z寄生電容||((r通道1+r通道2)+(r漏||(r細胞質(zhì)+z細胞膜1+z細胞膜2)))

c細胞膜＝0.5c細胞膜1＝0.5c細胞膜2

z細胞膜電容＝1/(2*π*f*c細胞膜電容*j)

2*c細胞膜＝c細胞膜比*s導(dǎo)電壓縮

其中，(r通道1+r通道2)為導(dǎo)電通道和導(dǎo)電壓縮通道除交叉部分之外的導(dǎo)電溶液電阻總和，r通道3為交叉壓縮通道交叉部分的導(dǎo)電溶液電阻，r通道3與通道總電阻(r通道1+r通道2+r通道3)的比例為r阻，r漏為在交叉部分細胞周圍沒有完全填充部分的漏電阻，c寄生電容為電極間的寄生電容，r細胞質(zhì)為細胞質(zhì)電阻，f為所述頻率，c細胞膜比為細胞膜比電容，c細胞膜為細胞膜串聯(lián)電容，細胞穿行到交叉部分時，填充在導(dǎo)電壓縮通道中除交叉部分之外的兩側(cè)的細胞膜電容分別為c細胞膜1和c細胞膜2，s導(dǎo)電壓縮為導(dǎo)電壓縮通道橫截面積；j為復(fù)數(shù)中虛數(shù)符號，*為乘法，/為除法，||為電路并聯(lián)。

(三)有益效果

本發(fā)明相較于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明采用交叉通道測量細胞的細胞膜比電容，不需要通過光學(xué)測量得到細胞長度，擺脫價格昂貴的顯微鏡和高速攝像頭，同時簡化測量步驟和操作難度。檢測結(jié)果不需要進行圖像處理等復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理過程，可以實現(xiàn)自動化和實時處理。

2、本發(fā)明采用交叉通道測量細胞膜比電容，不再限制于高速光學(xué)拍照的速度限制，測量通量提升了一到兩個數(shù)量級，實現(xiàn)了連續(xù)測量、高通量的效果。

3、本發(fā)明可以并行化結(jié)構(gòu)擴展，不再限制于顯微鏡狹窄的觀察區(qū)域，系統(tǒng)可復(fù)制，多個系統(tǒng)同時高效地測量細胞的細胞膜比電容。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明實施例的步驟示意圖；

圖3為本發(fā)明實施例的檢測細胞膜比電容的俯視示意圖；

圖4為本發(fā)明實施例的檢測細胞膜比電容的等效電路圖。

具體實施方式

基于現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種細胞膜比電容的檢測方法，通過本發(fā)明，有效提高了細胞膜比電容檢測通量，同時無需光學(xué)檢測和圖像分析，有效降低成本，簡化操作，并且可方便進行并行化擴展，在單通道基礎(chǔ)上進一步提高通量。

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，并參照附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明。

圖1為本發(fā)明實施例的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖，如圖1所示，本發(fā)明實施例的一個方面提供了一種細胞膜比電容的檢測系統(tǒng)，包括一微流控芯片、一氣壓驅(qū)動器、兩個電極、一阻抗測量模塊和一計算模塊。

所述微流控芯片，包括一絕緣襯底；與所述絕緣襯底貼合的一絕緣承載體，所述絕緣承載體包括一對交叉通道，所述交叉通道的第一通道位于第一方向，用于供細胞流動，第二通道位于與第一方向交叉的第二方向，用于進行電學(xué)測量。其中，所述絕緣襯底可以為玻璃片、聚酸甲酯(polymethylmethacrylate，簡稱pmma，英文acrylic，又稱做壓克力、亞克力或有機玻璃)或聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，簡稱pdms)片等絕緣片狀材料。本實施例中，絕緣承載體的材料為pdms。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當清楚，除了pdms之外，還可以采用有機玻璃，su-8等透明可塑性材料來注塑形成上述承載體。承載體由pdms材料注塑成型，上述通道在注塑成型的過程中形成。

所述第一通道包括細胞流入通道，細胞穿行壓縮通道和細胞回收通道，所述第二通道包括導(dǎo)電通道和導(dǎo)電壓縮通道；所述導(dǎo)電壓縮通道與細胞穿行壓縮通道交叉，并在兩端通過導(dǎo)電通道與電極相連接。所述第一通道與第二通道交叉形成交叉壓縮通道，所述交叉壓縮通道沿第一方向的橫截面積小于所述交叉壓縮通道中細胞的橫截面積，一般實施例中，沿第一方向的橫截面積直徑尺寸為15微米，截面為5至20微米對角線長度的矩形；且沿第二方向的橫截面積小于所述被壓縮的細胞的橫截面積，一般實施例中，沿第二方向的橫截面積的對角線尺寸選擇為5至100微米。

所述細胞流入通道，細胞穿行壓縮通道，導(dǎo)電通道，導(dǎo)電壓縮通道和細胞回收通道均充滿導(dǎo)電溶液，且所述兩個電極均與所述導(dǎo)電通道的導(dǎo)電溶液接觸，所述導(dǎo)電溶液包括與細胞等滲透壓的細胞培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液和生理鹽水。

所述驅(qū)動器，與所述第一通道相連，用于驅(qū)使細胞定向流動。所述驅(qū)動器可以為氣壓驅(qū)動器，所述氣壓驅(qū)動器包括正壓驅(qū)動器或負壓驅(qū)動器，所述正壓驅(qū)動器的氣壓大于所述第一通道內(nèi)的氣壓，與所述細胞流入通道相連，采用正壓驅(qū)使細胞在第一通道內(nèi)定向流動；所述負壓驅(qū)動器的氣壓小于第一通道內(nèi)的氣壓，與所述細胞回收通道相連，采用負壓驅(qū)使細胞在第一通道內(nèi)定向流動。本發(fā)明實施例中，選擇的負壓控制器包括：密閉軟管和負壓源，其中密閉軟管一端插入細胞回收通道中，一端連接至負壓源。

所述兩個電極，與所述第二通道的兩端相連，用于為所述檢測系統(tǒng)供電。

所述阻抗測量模塊，其兩端分別與所述兩個電極相連，用于測量至少兩個不同的頻率下，電極間的阻抗變化。本實施例中，所述阻抗測量模塊一端與一電極相連，另一端與另一電極相連，且接地，阻抗測量模塊選擇100khz和250khz兩個頻率下，阻抗幅值為1mω至20mω的交流阻抗，輸出頻率至少為1000點/秒。與電源連接的電極可以為ag(銀)/agcl(氯化銀)電極，甘汞電極，石墨電極等電極。

通過所述阻抗測量模塊，測得的阻抗變化包括100khz和250khz下，交叉壓縮通道的交叉部分無細胞時電極間的阻抗z總體1和交叉部分有細胞時電極間的阻抗z總體2。

本實施例中還采用一計算模塊，與所述阻抗測量模塊相連，用于根據(jù)所述阻抗變化計算得到所述細胞的細胞膜比電容，所述計算模塊的計算公式包括：

z總體1＝((r通道1+r通道2)+r通道3)||z寄生電容

r通道3＝r阻*((r通道1+r通道2)+r通道3)

z寄生電容＝1/(2*π*f*c寄生電容*j)

z總體2＝z寄生電容||((r通道1+r通道2)+(r漏||(r細胞質(zhì)+z細胞膜1+z細胞膜2)))

c細胞膜＝0.5c細胞膜1＝0.5c細胞膜2

z細胞膜電容＝1/(2*π*f*c細胞膜電容*j)

2*c細胞膜＝c細胞膜比*s導(dǎo)電壓縮

其中，(r通道1+r通道2)為導(dǎo)電通道和導(dǎo)電壓縮通道除交叉部分之外的導(dǎo)電溶液電阻總和，r通道3為交叉壓縮通道交叉部分的導(dǎo)電溶液電阻，r通道3與通道總電阻(r通道1+r通道2+r通道3)的比例為r阻，r阻是一個與通道結(jié)構(gòu)有關(guān)的已知量，r漏為在交叉部分細胞周圍沒有完全填充部分的漏電阻，c寄生電容為電極間的寄生電容，r細胞質(zhì)為細胞質(zhì)電阻，f為所述頻率，c細胞膜比為細胞膜比電容，c細胞膜為細胞膜串聯(lián)電容，細胞穿行到交叉部分時，填充在導(dǎo)電壓縮通道中除交叉部分之外的兩側(cè)的細胞膜電容分別為c細胞膜1和c細胞膜2，s導(dǎo)電壓縮為導(dǎo)電壓縮通道橫截面積；j為復(fù)數(shù)中虛數(shù)符號，*為乘法，/為除法，||為電路并聯(lián)。

本發(fā)明實施例的另一發(fā)明，還提供了一種細胞膜比電容的檢測方法，采用所述細胞膜比電容的檢測系統(tǒng)，圖2為本發(fā)明實施例的步驟示意圖，如圖2所示，包括步驟：

s1、測量在至少兩個不同頻率下，電極間的阻抗變化；

首先，先將微流控器件中的通道中氣泡排出，充入導(dǎo)電液體(一般情況下，采用與細胞等滲透壓的細胞培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsolution，簡稱pbs)或生理鹽水效果更佳)。然后，在導(dǎo)電通道中注入導(dǎo)電液體(其成分與用于排出氣泡使用的導(dǎo)電液體以及細胞懸浮使用的導(dǎo)電液體保持相同效果更佳)，在導(dǎo)電通道中插入電極，連接阻抗測量模塊。并且將負壓控制器連接到微流控器件的細胞回收通道。電穿孔實施階段的操作過程主要為：首先將細胞懸浮液注入細胞流入通道中，調(diào)節(jié)負壓，使細胞穿過細胞穿行壓縮通道，同時開始阻抗測量測量模塊的實時連續(xù)阻抗測量，得到細胞穿行過程中電極兩端的雙頻阻抗變化。至所需細胞都進行檢測完后，停止實驗。

通過所述阻抗測量模塊，測得的阻抗變化包括100khz和250khz下，交叉部分無細胞時電極間的阻抗z總體1和交叉部分有細胞時電極間的阻抗z總體2。

s2、將細胞在交叉壓縮通道中電極間的電路等效為細胞電學(xué)等效模型，得到計算公式；

圖3為本發(fā)明實施例的檢測細胞膜比電容的俯視示意圖，圖4為本發(fā)明實施例的檢測細胞膜比電容的等效電路圖，如圖3和圖4所示，在細胞穿過交叉壓縮通道的交叉部分時，微流控通道中的兩個電極之間的電阻可以等效為與圖3中上面電極連接的導(dǎo)電通道和導(dǎo)電壓縮通道除交叉部分之外的導(dǎo)電溶液電阻總和r通道1，r通道2為下面電極連接的導(dǎo)電通道和導(dǎo)電壓縮通道除交叉部分之外的導(dǎo)電溶液電阻總和，r通道3為交叉壓縮通道交叉部分的導(dǎo)電溶液電阻。其中細胞子電路等效為與上部分填充在導(dǎo)電壓縮通道中除交叉部分之外的細胞膜電容c細胞膜1，細胞質(zhì)電阻r細胞質(zhì)以及與下部分填充在導(dǎo)電壓縮通道中除交叉部分之外的細胞膜電容c細胞膜2。當交叉部分沒有細胞時，細胞部分子電路和細胞周圍沒有填充的漏電阻，被細胞填充部分(即交叉壓縮通道的交叉部分)的導(dǎo)電溶液電阻r通道3代替，得到公式：

r通道3＝r阻*((r通道1+r通道2)+r通道3)，

其中r通道3與通道總電阻(r通道1+r通道2+r通道3)的比例為r阻，r阻是一個與通道結(jié)構(gòu)有關(guān)的已知量。

為了簡化模型，認為細胞膜是均一質(zhì)，c細胞膜1與c細胞膜2相同，形成的串聯(lián)電容為：

c細胞膜＝0.5c細胞膜1＝0.5c細胞膜2

通過有限元仿真，沒有細胞時等效電路的頻域表達式為：

z總體1＝((r通道1+r通道2)+r通道3)||z寄生電容

其中，*為乘法，/為除法，||為電路并聯(lián)。

z總體1為交叉部分沒有細胞時，電極間的阻抗值。

z寄生電容為電極間的寄生電容c寄生電容的頻域形式：

z寄生電容＝1/(2*π*f*c寄生電容*j)

其中，f為所述頻率，此處為100khz和250khz，j為復(fù)數(shù)中虛數(shù)符號。

當有細胞在交叉壓縮通道交叉部分時，等效電路的頻域表達式為：

z總體2＝z寄生電容||(r通道1+r通道2+(r漏||(r細胞質(zhì)+z細胞膜1+z細胞膜2)))

其中z總體2為交叉部分有細胞時電極間的阻抗值，r漏為在交叉部分細胞周圍沒有完全填充部分的漏電阻。

其中，細胞膜電容阻抗z細胞膜與細胞膜電容c細胞膜之間關(guān)系為：

z細胞膜＝1/(2*π*f*c細胞膜*j)

結(jié)合結(jié)構(gòu)關(guān)系，可以得到，細胞膜比電容c細胞膜比與導(dǎo)電壓縮通道橫截面積s導(dǎo)電壓縮關(guān)系為：

2*c細胞膜＝c細胞膜1＝c細胞膜2＝c細胞膜比*s導(dǎo)電壓縮

s3、將步驟1中的阻抗變化代入所述計算公式，得到細胞膜比電容；

計算模塊結(jié)合以上公式，代入測得的在100khz和250khz下，交叉部分有細胞時電極間的阻抗值z總體1和交叉部分無細胞時電極間的阻抗值z總體2，求得待測細胞的細胞膜比電容c細胞膜比。

以上所述的具體實施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進行了進一步詳細說明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。