本發(fā)明涉及化學(xué)檢測領(lǐng)域，尤其是一種ase-hplc測定大葉紫珠中的毛蕊花糖苷含量的方法。
背景技術(shù)：
：紫珠(callicarpanudiflorae)為馬鞭草科小灌木植物，有止血、抗菌、收斂、解毒、鎮(zhèn)痛、以及促進(jìn)愈合的作用。其抗菌、抗病毒作用，尤其對金葡萄球菌、傷寒桿菌、肺炎雙球菌等均有不同的抑制作用，其中對金葡萄球菌，傷寒桿菌抑菌作用最強(qiáng)。紫珠還可抑制毛細(xì)血管的通透性，對早期的炎癥滲出、腫脹有明顯的抗炎性反應(yīng)作用，同時可明顯縮短出、凝血時間，止血效果顯著。紫珠的主要成分為黃酮甙、縮合鞣酸、中性樹脂、酚類、多糖、羥基化合物及鎂、鈣、鐵鹽等，其中，紫珠萜酮、芹菜素、毛蕊花糖苷、木犀草素及其配糖體等黃酮類物質(zhì)的含量約為5％。當(dāng)以毛蕊花糖苷為指標(biāo)探討裸花紫珠浸膏的抗菌、抗炎和止血的藥理效果時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著毛蕊花糖苷含量的升高，裸花紫珠浸膏的抑菌抗炎和止血作用都增強(qiáng)。目前市場上紫珠制劑主要有顆粒劑、膠囊、片劑、分散片、合劑、軟膠囊、栓劑等，上述制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅部分制劑進(jìn)行了總黃酮的含量測定，測定方法為紫外分光光度法，定量很不準(zhǔn)確，沒有關(guān)于紫珠制劑中毛蕊花糖苷的含量測定方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述不足，本發(fā)明旨在提供一種能準(zhǔn)確測定含量的ase-hplc測定大葉紫珠中的毛蕊花糖苷含量的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ase-hplc測定大葉紫珠中的毛蕊花糖苷含量的方法，依次包括下述步驟：步驟1：采用ase萃取方法萃取粉碎過的大葉紫珠并制備供試品溶液；步驟2：采用hplc法檢測大葉紫珠中的毛蕊花糖苷含量。進(jìn)一步的，所述的步驟1包括下述的子步驟：步驟s1：將大葉紫珠粉碎，過四號篩，取過篩后的粉末0.25g，與1g硅藻土混合均勻；步驟s2：將混合物加入到底部鋪設(shè)有纖維濾膜的萃取池中，再加入硅藻土至達(dá)到萃取池池口，采用ase法進(jìn)行萃?。徊襟Es3：收集萃取液，用甲醇定容至50ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。進(jìn)一步的，所述的步驟s2中，萃取參數(shù)為：萃取溶劑為甲醇；萃取溫度為120℃；靜態(tài)萃取時間為10min；循環(huán)次數(shù)為3次；沖洗體積為100％；吹掃時間為100s。進(jìn)一步的，步驟2所述的hplc法的檢測參數(shù)為：色譜柱：thermoaqc18；流動相：乙腈-0.5％磷酸；流速：0.3ml/min；檢測波長：332nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：1μl。進(jìn)一步的，所述的所述的色譜柱的規(guī)格為2.1mm×50mm，3μm。進(jìn)一步的，所述的流動相中的乙腈-0.5％磷酸的體積比為17:83。本發(fā)明的有益效果如下：能準(zhǔn)確有效的測定大葉紫珠中毛蕊花糖苷的含量，誤差小，可進(jìn)一步提高大葉紫珠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保大葉紫珠的質(zhì)量和臨床效果。附圖說明圖1為毛蕊花糖苷對照品圖譜；圖2為快速溶劑萃取樣品圖譜；圖3為藥典方法樣品圖譜；圖4為毛蕊花糖苷以濃度(μg)-峰面積進(jìn)行線性回歸圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。1、儀器設(shè)備及試劑1.1儀器：電子分析天平(xa205du)、ase350快速溶劑萃取儀(美國dionex公司)、agilent1290超高速液相色譜儀1.2試劑(除特別注明外，本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純)：水：符合gb/t6682規(guī)定的一級水；甲醇(ch3oh)：色譜純(液相色譜用)；乙腈(ch3cn))：色譜純(液相色譜用)。1.3樣品：大葉紫珠購于玉林藥材市場，經(jīng)廣西梧州食品藥品檢驗(yàn)所副主任中藥師黃蘅鑒別。對照品毛蕊花糖苷由中國生物制品檢定研究院提供，批號：111530-201512。2方法2.1對照品溶液的制備：取毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含毛蕊花糖苷50μg的溶液，即得。2.2供試品溶液的制備2.2.1《中國藥典》2015年版一部制備供試品方法：取本品粉末(過四號篩)約0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，稱定重量，放置過夜，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用50％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。2.2.2快速溶劑萃取法(ase)制備供試品方法：樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過四號篩，取0.25g，精密稱定，與約1g硅藻土混合均勻，待用，移入到預(yù)先放好纖維濾膜的ase10ml萃取池中再加入適量硅藻土，輕輕振搖使之與池口在同一水平線上，擰緊萃取池上蓋，放入快速萃取儀中進(jìn)行萃取。萃取結(jié)束后，把萃取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用少量甲醇清洗萃取瓶3次合并至容量瓶中，使用甲醇定容至刻度，即得。2.3ase萃取條件萃取溶劑為甲醇；萃取溫度為120℃；靜態(tài)萃取時間為10min；循環(huán)次數(shù)為3次；沖洗體積為100％；吹掃時間為100s。2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.5％磷酸(17:83)為流動相；檢測波長為332nm。理論板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計算應(yīng)不低于3000。2.5測定法照高效液相色譜法(通則0512)測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，測定，即得。檢測參數(shù)為：色譜柱：thermoaqc18；流動相：乙腈-0.5％磷酸；流速：0.3ml/min；檢測波長：332nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：1μl。2.6標(biāo)準(zhǔn)限值要求本品按干燥品計算，含毛蕊花糖苷(c29h36o15)不得少于0.15％。2.7計算(外標(biāo)法)式中cr——對照品溶液濃度，單位為微克每升(mg/l)；ax——供試品的峰面積；ar——對照品峰面積。注意：使用前萃取池底部應(yīng)拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；萃取池底部的濾紙應(yīng)在密封圈內(nèi)，否則引起滲漏；萃取池裝樣時松緊適中，太松容易導(dǎo)致提取液過多；開機(jī)前檢查氣瓶氣壓是否達(dá)到1mpa；使用結(jié)束后清理干凈，萃取池要及時晾干(容易生銹)。3結(jié)果3.1線性關(guān)系取毛蕊花糖苷對照品溶液(濃度0.06914mg/ml)，分別精密吸取該溶液0.2μl、0.5μl、0.8μl、1μl、1.2μl進(jìn)入lc測定，并依照上述方法測定，結(jié)果見表1。以濃度(μg)-峰面積進(jìn)行線性回歸，詳見圖4，求得回歸方程：毛蕊花糖苷y＝3003.7x+11.318，r2＝0.99966,毛蕊花糖苷在0.013828～0.082968μg圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。表13.2重復(fù)性試驗(yàn)取相同批號的樣品(廣西玉林購買)0.25g，共3份，精密稱定，按4.2.2ase提取方法提取供試品溶液，進(jìn)樣量為1μl，以上述的色譜條件平行試驗(yàn)，測得樣品中毛蕊花糖苷的含量rsd為2.5％，試驗(yàn)表明ase提取方法重復(fù)性良好，結(jié)果詳見表2。表2重復(fù)性1重復(fù)性2重復(fù)性3rsd％結(jié)果％1.101.071.052.53.3精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)取毛蕊花糖苷對照品溶液(0.06914mg/ml)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，詳見圖1，峰面積rsd為0.4％，表明儀器精密度良好。取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0，2，4，8，12h依法測定。結(jié)果毛蕊花糖苷峰面積的rsd為0.7％，詳見圖2，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。3.4樣品不同儀器提取結(jié)果及與藥典方法結(jié)果比較不同ase儀器提取的毛蕊花糖苷的含量對比見表3：表3ase方法與藥典方法提取毛蕊花糖苷的含量的對比見表4，其中使用藥典方法提取的毛蕊花糖苷的色譜圖見圖3：表44討論：ase提取條件的優(yōu)化我們采用4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)方案l9(3_4)安排實(shí)驗(yàn)，考察了提取溶劑、溫度、靜態(tài)萃取時間、循環(huán)次數(shù)4個因素對加速溶劑萃取大葉紫珠中毛蕊花糖苷的影響(見表5)。確定了從大葉紫珠中提取毛蕊花糖苷的最佳快速溶劑萃取工藝，結(jié)果見表6。表5表6由極差分析可以看出，提取溶劑對毛蕊花糖苷的含量影響最大，其次是溫度、循環(huán)次數(shù)、靜態(tài)萃取時間。最終確定最佳提取工藝組合為提取溶劑為甲醇，提取溫度120℃，提取時間10min，提取次數(shù)3次。以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12