本發(fā)明涉及近紅外光譜定量測定方法領(lǐng)域，尤其涉及一種液體發(fā)酵靈芝菌絲體三萜含量的近紅外光譜定量測定方法。

背景技術(shù)：

靈芝(Ganoderma Lucidum)是我國的傳統(tǒng)中藥，并被收錄于中國藥典和美國草藥藥典。其所具有的抗腫瘤，抗肝炎、抗高血壓、糖尿病等功能與其中的靈芝三萜及靈芝多糖成分密切相關(guān)。因此，靈芝三萜是靈芝中重要的藥效成分。靈芝三萜種類繁多，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的靈芝屬萜類化合物已經(jīng)達(dá)到一百種以上。

隨著靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，原有的粗放的靈芝子實(shí)體生產(chǎn)模式效益下降，特別是在靈芝產(chǎn)品深加工和藥用成分分離純化領(lǐng)域。用子實(shí)體進(jìn)行分離純化工作，有以下困難：一是環(huán)境條件受到限制，大部分種類靈芝子實(shí)體生長需要高溫高濕環(huán)境，自然條件下生長周期繁育受到限制，如果要人為干預(yù)，需要較大的前期成本投入；二是生產(chǎn)周期長，即便在溫度、濕度、土壤環(huán)境都非常適宜的情況下，靈芝子實(shí)體的生長通常要幾個(gè)月時(shí)間，單純通過生產(chǎn)靈芝子實(shí)體，銷售產(chǎn)出投入比很低；三是采用產(chǎn)品深加工，活性藥用成分分離純化方法，產(chǎn)品附加值很高，但對于子實(shí)體而言，在靈芝多糖和三萜等有效成分分離純化過程中，需要耗費(fèi)大量的經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本脫去表面堅(jiān)硬的皮層。

所以，人們正在不斷尋找其他途徑獲取靈芝活性藥用成分，利用液體深層發(fā)酵技術(shù)就是獲取靈芝活性藥用成分的有效途徑之一。靈芝菌絲體液體發(fā)酵具有生產(chǎn)周期短，一次發(fā)酵罐發(fā)酵通常只需要4-7天時(shí)間；發(fā)酵過程不受季節(jié)限制，且發(fā)酵生產(chǎn)過程可控，菌絲體生長質(zhì)量有保障；菌絲體中不存在大量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等成分，沒有子實(shí)體的脫皮環(huán)節(jié)，非常適合藥用成分的分離純化。但是，在靈芝子實(shí)體和菌絲體生產(chǎn)過程中，需要對其質(zhì)量進(jìn)行實(shí)時(shí)有效監(jiān)控。以往對靈芝三萜含量的定量分析主要有分光光度法、高效液相色譜法、薄層層析法等，這些方法作為傳統(tǒng)的化學(xué)檢測方法，其共同的缺點(diǎn)是檢測時(shí)間較長、成本較高、所用化學(xué)試劑會(huì)造成污染、樣品有損失等。而利用近紅外光譜技術(shù)進(jìn)行檢測，具有便捷、無損和高通量的檢測特點(diǎn)，結(jié)合計(jì)算機(jī)技術(shù)未來有望實(shí)現(xiàn)在線檢測。

雖然近紅外光譜技術(shù)具有上述優(yōu)點(diǎn)，但需要構(gòu)建穩(wěn)定高效的定量分析模型。目前只有靈芝子實(shí)體的三萜的近紅外定量模型，而靈芝子實(shí)體和菌絲體之間在結(jié)構(gòu)(有無皮層)和成分組成(纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量)上有很大差別，這些會(huì)使兩種近紅外光譜存在較大差異。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種穩(wěn)定高效的的液體發(fā)酵靈芝菌絲體三萜含量的近紅外光譜定量測定方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種液體發(fā)酵靈芝菌絲體三萜含量的近紅外光譜定量測定方法，包括如下步驟：

(1)利用液體發(fā)酵方式獲得靈芝菌絲體，并制備靈芝菌絲體干粉；

(2)將靈芝菌絲體干粉樣品分為校正集和驗(yàn)證集；

(3)對于校正集的靈芝菌絲體干粉，利用高氯酸-香草醛分光光度法進(jìn)行定量測定；

(4)對靈芝菌絲體干粉進(jìn)行近紅外光譜檢測，波數(shù)范圍為12500-4000cm^-1，并收集光譜數(shù)據(jù)；

(5)對收集的近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理；

(6)利用校正集的高氯酸-香草醛法測量結(jié)果和近紅外光譜構(gòu)建定量模型，對光譜譜段進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，選出與三萜含量相關(guān)性高的近紅外光譜峰區(qū)，獲得相應(yīng)定量分析模型；

(7)將驗(yàn)證集的測量光譜導(dǎo)入上述三萜含量定量模型，對其三萜含量進(jìn)行預(yù)測。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(1)中靈芝菌絲體及其干粉的具體制備方法為：將靈芝種子培養(yǎng)基中的菌絲體接種于滅菌后的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于26-30℃，140-160rpm轉(zhuǎn)速搖床震蕩培養(yǎng)；5-10d菌絲體長滿培養(yǎng)基，將菌絲體連同菌液取出，離心后用ddH₂O清洗菌絲體；置于烘箱中45-60℃干燥，干燥后粉碎成干粉末狀，篩后以備后續(xù)檢測。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述種子培養(yǎng)基的配方為：200g/L馬鈴薯+20g/L葡萄糖+(10-15)g/L瓊脂+1000mL ddH₂O，pH 7.0；所述馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的配方為：200g/L馬鈴薯+20g/L葡萄糖+1000mL ddH₂O，pH 7.0。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(2)中靈芝菌絲體干粉樣品的校正集和驗(yàn)證集的數(shù)量相同，校正集和驗(yàn)證集的分類形式為隨機(jī)采樣分類。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(3)中高氯酸-香草醛分光光度法測定校正集的靈芝菌絲體干粉的具體方法為：

(1)量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL對照品溶液，即0.2mg齊墩果酸/mL甲醇溶液，分別置于15mL具塞試管中，揮干，放冷，加入0.2mL香草醛冰醋酸溶液、0.8mL高氯酸，搖勻，再于68-72℃水浴中加熱14-16min，立即置冰浴中冷卻4-6min，取出，加入4mL乙酸乙酯，搖勻；以相應(yīng)試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在546nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(2)取0.2mL供試品溶液，即靈芝三萜乙醇提取液，置15mL具塞試管中，接著，采用上述對照品溶液的處理與吸光度測量方法，測定供試品溶液的相應(yīng)吸光度，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量，結(jié)果為每100mg樣本干品中含有的齊墩果酸質(zhì)量(mg)，以％表示。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述香草醛冰醋酸溶液的制備方法為：稱取香草醛0.5g，再加入冰醋酸使之溶解成10mL。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(4)中近紅外光譜檢測具體為近紅外漫反射光譜檢測，波數(shù)范圍為12500-400cm^-1，分辨率16cm^-1，掃描次數(shù)32次，利用積分球聚集光信號，InGaAs檢測器檢測，每份樣品采集2次光譜，取其平均光譜作為樣品原始光譜。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(5)中預(yù)處理方式為：將測量光譜在12500-9000cm^-1范圍內(nèi)截除，保留9000-4000cm^-1光譜范圍，再進(jìn)行矢量歸一化和一階導(dǎo)數(shù)處理。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(6)中化學(xué)計(jì)量學(xué)分析的方法為：采用OPUS光譜分析軟件及PLS程序?qū)庾V譜段進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)處理；所述與三萜含量相關(guān)性高的近紅外光譜峰區(qū)為：9000-7984.3cm^-1、5909.1-5577.4cm^-1和4898.6-4000cm^-1三個(gè)近紅外光譜峰區(qū)。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(6)中與三萜含量相關(guān)性高的近紅外光譜峰區(qū)為：9000-7984.3cm^-1、5909.1-5577.4cm^-1和4898.6-4000cm^-1三個(gè)近紅外光譜峰區(qū)。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明利用近紅外光譜技術(shù)，結(jié)合高氯酸-香草醛法測定的結(jié)果，對液體發(fā)酵的靈芝菌絲體三萜含量構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，以便建立穩(wěn)定高效的基于近紅外光譜技術(shù)的靈芝菌絲體發(fā)酵三萜含量定量方法，該方法將對靈芝品種選育和靈芝三萜含量的工業(yè)生產(chǎn)有重要意義。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中靈芝菌絲體干粉近紅外光譜檢測原始光譜圖；

圖2是實(shí)施例1中原始光譜圖經(jīng)預(yù)處理、化學(xué)計(jì)量學(xué)處理后選取的波段范圍；

圖3是實(shí)施例1中優(yōu)化得到的靈芝菌絲體三萜含量近紅外光譜定量模型；

圖4是實(shí)施例1中將驗(yàn)證集的測量光譜導(dǎo)入三萜含量定量模型后的驗(yàn)證結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的一種液體發(fā)酵靈芝菌絲體三萜含量的近紅外光譜定量測定方法，包括如下步驟：

(1)將靈芝種子培養(yǎng)基(200g/L馬鈴薯+20g/L葡萄糖+(10-15)g/L瓊脂+1000mL ddH₂O，pH 7.0)中0.5cm見方的菌絲體小塊接種于滅菌后的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(200g/L馬鈴薯+20g/L葡萄糖+1000mL ddH₂O，pH 7.0)中，于28℃，150rpm轉(zhuǎn)速搖床震蕩培養(yǎng)；5-10d菌絲體長滿培養(yǎng)基，將菌絲體連同菌液取出，離心后用ddH₂O清洗菌絲體；置于烘箱中50℃干燥，干燥后用研缽粉碎成干粉末狀，篩后以備后續(xù)檢測；

(2)將靈芝菌絲體干粉樣品隨機(jī)采樣分為校正集和驗(yàn)證集，且使二者數(shù)量相同；

(3)對于校正集的靈芝菌絲體干粉，利用高氯酸-香草醛分光光度法進(jìn)行定量測定，具體測定方法為：

①量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL對照品溶液，即0.2mg齊墩果酸/mL甲醇溶液，分別置于15mL具塞試管中，揮干，放冷，加入0.2mL香草醛冰醋酸溶液(稱取香草醛0.5g，再加入冰醋酸使之溶解成10mL)、0.8mL高氯酸，搖勻，再于70℃水浴中加熱15min，立即置冰浴中冷卻5min，取出，加入4mL乙酸乙酯，搖勻；以相應(yīng)試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在546nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

②取0.2mL供試品溶液，即靈芝三萜乙醇提取液，置15mL具塞試管中，接著，采用上述對照品溶液的處理與吸光度測量方法，測定供試品溶液的相應(yīng)吸光度，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量，結(jié)果為每100mg樣本干品中含有的齊墩果酸質(zhì)量(mg)，以％表示；

(4)使用德國布魯克公司MPA型近紅外光譜儀對靈芝菌絲體干粉進(jìn)行近紅外漫反射光譜檢測，并收集光譜數(shù)據(jù)；其中，進(jìn)行近紅外漫反射光譜檢測時(shí)，波數(shù)范圍為12500-400cm^-1，分辨率16cm^-1，掃描次數(shù)32次，利用積分球聚集光信號，InGaAs檢測器檢測，每份樣品采集2次光譜，取其平均光譜作為樣品原始光譜，如圖1所示；

(5)對收集的近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，即將測量光譜在12500-9000cm^-1范圍內(nèi)截除，保留9000-4000cm^-1光譜范圍，再進(jìn)行矢量歸一化和一階導(dǎo)數(shù)處理；

(6)利用校正集的高氯酸-香草醛法測量結(jié)果和近紅外光譜構(gòu)建定量模型，采用OPUS光譜分析軟件及PLS程序?qū)庾V譜段進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)處理，得到9000-7984.3cm^-1、5909.1-5577.4cm^-1和4898.6-4000cm^-1三個(gè)近紅外光譜峰區(qū)與三萜含量相關(guān)性高，如圖2所示；

此外，還利用對三萜紅外光譜進(jìn)行計(jì)算分析，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)光譜區(qū)(9000-7984.3cm^-1、5909.1-5577.4cm^-1和4898.6-4000cm^-1三個(gè)近紅外光譜峰區(qū))中的8427、5902、4456cm^-1確實(shí)來自三萜的近紅外光譜特征譜線，結(jié)合相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行驗(yàn)證，這三個(gè)譜區(qū)相關(guān)系數(shù)較高；可見，利用此區(qū)域建立基于三萜含量定量模型，如圖3所示，可獲得很好的定量分析效果；以一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化前處理，校正集模型LV＝5，R2＝0.9211，RMSECV＝5.97，RPD＝3.56，RMSECV/維數(shù)呈現(xiàn)出光滑完整的下降曲線，可見定量模型構(gòu)建效果較好；

(7)將驗(yàn)證集的測量光譜導(dǎo)入上述三萜含量定量模型，對其三萜含量進(jìn)行預(yù)測，驗(yàn)證集的RMSEP＝14.8，Bias＝-12.9，RPD＝2.59，回歸系數(shù)＝0.9535，如圖4所示。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的一種液體發(fā)酵靈芝菌絲體三萜含量的近紅外光譜定量測定方法，包括如下步驟：

(1)將靈芝種子培養(yǎng)基(200g/L馬鈴薯+20g/L葡萄糖+(10-15)g/L瓊脂+1000mL ddH₂O，pH 7.0)中0.5cm見方的菌絲體小塊接種于滅菌后的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(200g/L馬鈴薯+20g/L葡萄糖+1000mL ddH₂O，pH 7.0)中，于26℃，140rpm轉(zhuǎn)速搖床震蕩培養(yǎng)；5-10d菌絲體長滿培養(yǎng)基，將菌絲體連同菌液取出，離心后用ddH₂O清洗菌絲體；置于烘箱中45℃干燥，干燥后用研缽粉碎成干粉末狀，篩后以備后續(xù)檢測；

(2)將靈芝菌絲體干粉樣品隨機(jī)采樣分為校正集和驗(yàn)證集，且使二者數(shù)量相同；

(3)對于校正集的靈芝菌絲體干粉，利用高氯酸-香草醛分光光度法進(jìn)行定量測定，具體測定方法為：

①量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL對照品溶液，即0.2mg齊墩果酸/mL甲醇溶液，分別置于15mL具塞試管中，揮干，放冷，加入0.2mL香草醛冰醋酸溶液(稱取香草醛0.5g，再加入冰醋酸使之溶解成10mL)、0.8mL高氯酸，搖勻，再于68℃水浴中加熱14min，立即置冰浴中冷卻4min，取出，加入4mL乙酸乙酯，搖勻；以相應(yīng)試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在546nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

②取0.2mL供試品溶液，即靈芝三萜乙醇提取液，置15mL具塞試管中，接著，采用上述對照品溶液的處理與吸光度測量方法，測定供試品溶液的相應(yīng)吸光度，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量，結(jié)果為每100mg樣本干品中含有的齊墩果酸質(zhì)量(mg)，以％表示；

(4)使用德國布魯克公司MPA型近紅外光譜儀對靈芝菌絲體干粉進(jìn)行近紅外漫反射光譜檢測，并收集光譜數(shù)據(jù)；其中，進(jìn)行近紅外漫反射光譜檢測時(shí)，波數(shù)范圍為12500-400cm^-1，分辨率16cm^-1，掃描次數(shù)32次，利用積分球聚集光信號，InGaAs檢測器檢測，每份樣品采集2次光譜，取其平均光譜作為樣品原始光譜；

(5)對收集的近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，即將測量光譜在12500-9000cm^-1范圍內(nèi)截除，保留9000-4000cm^-1光譜范圍，再進(jìn)行矢量歸一化和一階導(dǎo)數(shù)處理；

(6)利用校正集的高氯酸-香草醛法測量結(jié)果和近紅外光譜構(gòu)建定量模型，采用OPUS光譜分析軟件及PLS程序?qū)庾V譜段進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)處理，選出與三萜含量相關(guān)性高的近紅外光譜峰區(qū)(：9000-7984.3cm^-1、5909.1-5577.4cm^-1和4898.6-4000cm^-1三個(gè)近紅外光譜峰區(qū))，獲得相應(yīng)定量分析模型；

(7)將驗(yàn)證集的測量光譜導(dǎo)入上述三萜含量定量模型，對其三萜含量進(jìn)行預(yù)測，驗(yàn)證集的RMSEP＝20.9，RPD＝2.69，回歸系數(shù)＝0.9543。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的一種液體發(fā)酵靈芝菌絲體三萜含量的近紅外光譜定量測定方法，包括如下步驟：

(1)將靈芝種子培養(yǎng)基(200g/L馬鈴薯+20g/L葡萄糖+(10-15)g/L瓊脂+1000mL ddH₂O，pH 7.0)中0.5cm見方的菌絲體小塊接種于滅菌后的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(200g/L馬鈴薯+20g/L葡萄糖+1000mL ddH₂O，pH 7.0)中，于30℃，160rpm轉(zhuǎn)速搖床震蕩培養(yǎng)；5-10d菌絲體長滿培養(yǎng)基，將菌絲體連同菌液取出，離心后用ddH₂O清洗菌絲體；置于烘箱中60℃干燥，干燥后用研缽粉碎成干粉末狀，篩后以備后續(xù)檢測；

(2)將靈芝菌絲體干粉樣品隨機(jī)采樣分為校正集和驗(yàn)證集，且使二者數(shù)量相同；

(3)對于校正集的靈芝菌絲體干粉，利用高氯酸-香草醛分光光度法進(jìn)行定量測定，具體測定方法為：

①量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL對照品溶液，即0.2mg齊墩果酸/mL甲醇溶液，分別置于15mL具塞試管中，揮干，放冷，加入0.2mL香草醛冰醋酸溶液(稱取香草醛0.5g，再加入冰醋酸使之溶解成10mL)、0.8mL高氯酸，搖勻，再于72℃水浴中加熱16min，立即置冰浴中冷卻6min，取出，加入4mL乙酸乙酯，搖勻；以相應(yīng)試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在546nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

②取0.2mL供試品溶液，即靈芝三萜乙醇提取液，置15mL具塞試管中，接著，采用上述對照品溶液的處理與吸光度測量方法，測定供試品溶液的相應(yīng)吸光度，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量，結(jié)果為每100mg樣本干品中含有的齊墩果酸質(zhì)量(mg)，以％表示；

(4)使用德國布魯克公司MPA型近紅外光譜儀對靈芝菌絲體干粉進(jìn)行近紅外漫反射光譜檢測，并收集光譜數(shù)據(jù)；其中，進(jìn)行近紅外漫反射光譜檢測時(shí)，波數(shù)范圍為12500-400cm^-1，分辨率16cm^-1，掃描次數(shù)32次，利用積分球聚集光信號，InGaAs檢測器檢測，每份樣品采集2次光譜，取其平均光譜作為樣品原始光譜；

(5)對收集的近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，即將測量光譜在12500-9000cm^-1范圍內(nèi)截除，保留9000-4000cm^-1光譜范圍，再進(jìn)行矢量歸一化和一階導(dǎo)數(shù)處理；

(6)利用校正集的高氯酸-香草醛法測量結(jié)果和近紅外光譜構(gòu)建定量模型，采用OPUS光譜分析軟件及PLS程序?qū)庾V譜段進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)處理，選出與三萜含量相關(guān)性高的近紅外光譜峰區(qū)(：9000-7984.3cm^-1、5909.1-5577.4cm^-1和4898.6-4000cm^-1三個(gè)近紅外光譜峰區(qū))，獲得相應(yīng)定量分析模型；

(7)將驗(yàn)證集的測量光譜導(dǎo)入上述三萜含量定量模型，對其三萜含量進(jìn)行預(yù)測。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。