本發(fā)明涉及一種彩色熒光顆粒標(biāo)記抗體的方法及使用其制備的試紙條，此方法制備的試紙條可用于包括但不限于犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒、犬冠狀病毒、狂犬病病毒、貓白血病病毒、馬立克氏病病毒，新城疫病毒等動(dòng)物病毒的快速檢測(cè)，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

與其他微生物相比，病毒在結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、繁殖方式及對(duì)藥物敏感性方面均有顯著區(qū)別。動(dòng)物病毒病具有傳染性強(qiáng)、流行廣泛、危害嚴(yán)重和發(fā)病率高的特點(diǎn)，因此如何快速診斷成了控制和治療這些動(dòng)物病毒病的關(guān)鍵因素。當(dāng)前，各獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)動(dòng)物病毒病主要利用血清學(xué)試驗(yàn)和分子生物學(xué)試驗(yàn)，這些方法往往耗時(shí)較長(zhǎng)，起不到快速檢測(cè)的作用。

近年來(lái)，免疫層析方法日漸成熟，其具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、成本低廉適用于現(xiàn)場(chǎng)大量樣本快速測(cè)試等特點(diǎn)，已在動(dòng)物病毒的檢測(cè)領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。其中，膠體金因易制備、生物相容性好、顏色多變等優(yōu)勢(shì)成為了免疫層析分析法中最常用的標(biāo)記原料。在動(dòng)物病毒監(jiān)檢測(cè)中，膠體金因其鮮明的顏色可輕易實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)，并且通過(guò)光電感應(yīng)器檢測(cè)膠體金顆粒對(duì)光的吸收和散射，可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。但是，體金的生產(chǎn)成本相對(duì)較高，使用物理吸附使其對(duì)抗體和包被原等原料的要求比較高；當(dāng)金顆粒過(guò)大時(shí)，標(biāo)記物又不穩(wěn)定導(dǎo)致批間差異大；且膠體金信號(hào)較弱，靈敏度低等限制了其應(yīng)用。因此需要一種價(jià)格低廉的，易制備，穩(wěn)定的，靈敏度高的標(biāo)記顆粒替代膠體金用于動(dòng)物病毒檢測(cè)的免疫層析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的在于提供了一種彩色熒光顆粒標(biāo)記抗體的方法及使用其制備的試紙條實(shí)現(xiàn)動(dòng)物病毒的快速檢測(cè)，并解決膠體金成本高，信號(hào)弱，測(cè)試線顯色不明顯，定量檢測(cè)批間差異大等問(wèn)題。彩色熒光顆粒標(biāo)記抗體的方法制備的試紙條，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)高靈敏度的動(dòng)物病毒的定性和定量檢測(cè)。

本發(fā)明提供的彩色熒光顆粒標(biāo)的抗體，以鍵合銪³⁺的彩色熒光乳膠微球?yàn)槔闹苽浞椒?，包括以下步驟：

(1)將定量的彩色熒光乳膠微球溶液加到緩沖溶液中稀釋，超聲1.5min，得到彩色熒光微球分散液。

(2)向步驟(1)中的彩色熒光乳膠微球分散液中迅速滴入活化劑，快速置于渦旋振蕩器上低速震蕩1min后，固定在渦旋振蕩器上，室溫下震蕩活化30min。

(3)活化結(jié)束后，將步驟(2)中的彩色熒光乳膠微球分散液在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，用步驟(1)中的緩沖溶液清洗，再次以相同條件離心后，棄去上清液，用步驟(4)中緩沖溶液復(fù)溶重懸。

(4)取相應(yīng)動(dòng)的物病毒的單克隆抗體，加入緩沖溶液稀釋至0.085mg/ml。

(5)將步驟(3)中復(fù)溶的納米顆粒分散液加入到步驟(4)中的抗體稀釋液中，立刻在渦旋震蕩器上震蕩1.5min，隨后超聲1.5min，然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(6)反應(yīng)結(jié)束后，將步驟(5)中溶液超聲1min，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，加入封閉液，同樣然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(7)將步驟(6)中溶液離心后再次加入封閉液清洗，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，可得到彩色熒光微球標(biāo)記的抗體。

步驟(1)的緩沖溶液是2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液，其ph為7.2。

步驟(2)中活化劑是edc&nhs活化劑。

步驟(3)中復(fù)溶的緩沖溶液以及步驟(4)的緩沖溶液均是硼酸酸緩沖溶液，其ph值為7.8。

本發(fā)明還提供了一種基于上述方法制備的彩色熒光微球標(biāo)記的抗體的試紙條，其特征在于，試劑盒的結(jié)構(gòu)如圖1所示：在塑料底板(1)一端粘貼樣品墊(2)，樣品墊的一端緊密壓接噴涂有彩色熒光微球標(biāo)記的動(dòng)物病毒抗體的結(jié)合墊(3)，結(jié)合墊(3)一端緊密壓接硝酸纖維素nc膜(4)，nc膜上包被有檢測(cè)線t1(5)和質(zhì)控線c(6)，nc膜的另一端連接吸水墊(7)形成試紙，試紙裝入塑料卡殼內(nèi)形成試紙卡。包括以下組裝步驟：

(1)抗體標(biāo)記的彩色熒光微球中加入重懸液，反復(fù)吹打，隨后超聲5min直至沉淀完全溶解。

(2)將步驟(1)中的抗體標(biāo)記的彩色熒光微球溶液用劃膜噴金機(jī)噴涂于結(jié)合墊，隨后在烘箱中37℃下烘干1h。

(3)將對(duì)照線和檢測(cè)線要包被的抗體，分別用適宜的稀釋液稀釋后，用劃膜噴金機(jī)將其分別噴涂于硝酸纖維素膜上，37℃下在烘箱中烘干1h。

(4)組裝粘貼結(jié)合墊、樣品墊，密封過(guò)夜，使之充分粘合。

步驟(2)中彩色熒光微球標(biāo)記的抗體溶液的溶度為1.5mg/ml，涂覆量為5μl/cm。

步驟(3)中硝酸纖維素膜的對(duì)照線包被的抗體為抗鼠lgg多克隆抗體，涂覆量為0.9μl/cm；檢測(cè)線包被的抗體為動(dòng)物病毒單克隆抗體，涂覆量為0.9μl/cm。

本發(fā)明提供了此動(dòng)物病毒檢測(cè)試紙條的使用方法：

(1)使用移液器，取定量體積的動(dòng)物血清、血漿、全血樣品加入到樣品稀釋液中，充分混合后，取定量體積的測(cè)試液加入到試紙條的加樣槽中，等待3～6min中，若只有質(zhì)控線出現(xiàn)彩色條帶，表明測(cè)試結(jié)果為陰性，樣品中不含相應(yīng)的動(dòng)物病毒；若對(duì)照線和測(cè)試線均顯現(xiàn)出彩色條帶，測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性，繼續(xù)等待至15min，使用配套熒光定量檢測(cè)儀器檢測(cè)，可定量給出樣品中動(dòng)物病毒的含量。

本發(fā)明提供了上述制備方法制備的試紙條在動(dòng)物病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提出彩色熒光顆粒標(biāo)記抗體的方法及使用其制備的試紙條，有以下優(yōu)勢(shì)：

(1)本發(fā)明所述的抗體標(biāo)記的方法是利用彩色熒光微球表面的功能基團(tuán)，采用化學(xué)共價(jià)鍵合的方式與抗體結(jié)合，使得抗體標(biāo)記的彩色熒光微球比起膠體金更為穩(wěn)定。

(2)本發(fā)明所述試紙用于動(dòng)物病毒檢測(cè)時(shí)，在3～6min內(nèi)即可得到定性檢測(cè)結(jié)果，隨后在15min時(shí)使用配套的熒光定量檢測(cè)儀器，即可定量得到準(zhǔn)確的結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了定性定量同時(shí)檢測(cè)。

(3)本發(fā)明所述試紙用于動(dòng)物病毒檢測(cè)時(shí)，最低檢測(cè)限可達(dá)到4ng/ml,靈敏度高于膠體金免疫層析法。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明中的示意實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限定。

圖1為本發(fā)明內(nèi)容中彩色熒光微球標(biāo)記的檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例一中的彩色熒光微球標(biāo)記的犬瘟熱病毒抗體制備的試紙條的測(cè)試結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例一

一種彩色熒光微球標(biāo)記的犬瘟熱病毒抗體制備的試紙條，包括以下步驟：

(1)將定量的彩色熒光乳膠微球溶液加到緩沖溶液中稀釋，超聲1.5min，得到彩色熒光微球分散液。

(2)向步驟(1)中的彩色熒光乳膠微球分散液中迅速滴入活化劑，快速置于渦旋振蕩器上低速震蕩1min后，固定在渦旋振蕩器上，室溫下震蕩活化30min。

(3)活化結(jié)束后，將步驟(2)中的彩色熒光乳膠微球分散液在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，用步驟(1)中的緩沖溶液清洗，再次以相同條件離心后，棄去上清液，用步驟(4)中緩沖溶液復(fù)溶重懸。

(4)分別取犬瘟熱病毒的單克隆抗體，分別加入緩沖溶液稀釋至0.085mg/ml。

(5)將步驟(3)中復(fù)溶的納米顆粒分散液加入到步驟(4)中的抗體稀釋液中，立刻在渦旋震蕩器上震蕩1.5min，隨后超聲1.5min，然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(6)反應(yīng)結(jié)束后，將步驟(5)中溶液超聲1min，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，加入封閉液，同樣然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(7)將步驟(6)中溶液離心后再次加入封閉液清洗，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，可得到彩色熒光微球標(biāo)記的抗體。

步驟(1)的緩沖溶液是2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液，其ph為7.2。

步驟(2)中活化劑是edc&nhs活化劑。

步驟(3)中復(fù)溶的緩沖溶液以及步驟(4)的緩沖溶液均是硼酸酸緩沖溶液，其ph值為7.8。

本發(fā)明還提供了一種基于上述方法制備的彩色熒光微球標(biāo)記的抗體的試紙條，包括以下組裝步驟：

(1)抗體標(biāo)記的彩色熒光微球中加入重懸液，反復(fù)吹打，隨后超聲5min直至沉淀完全溶解。

(2)將步驟(1)中的抗體標(biāo)記的彩色熒光微球溶液用劃膜噴金機(jī)噴涂于結(jié)合墊，隨后在烘箱中37℃下烘干1h。

(3)將對(duì)照線和檢測(cè)線要包被的抗體，分別用適宜的稀釋液稀釋后，用劃膜噴金機(jī)將其分別噴涂于硝酸纖維素膜上，37℃下在烘箱中烘干1h。

(4)組裝粘貼結(jié)合墊、樣品墊，密封過(guò)夜，使之充分粘合,可得到犬瘟熱和貓白血病病毒檢測(cè)試紙卡。

步驟(2)中彩色熒光微球標(biāo)記的抗體溶液的溶度為1.5mg/ml，涂覆量為5μl/cm。

步驟(3)中硝酸纖維素膜的對(duì)照線包被的抗體為抗鼠lgg多克隆抗體，涂覆量為0.9μl/cm；檢測(cè)線包被的抗體為犬瘟熱病毒單克隆抗體，涂覆量為0.9μl/cm。

本發(fā)明提供了此動(dòng)物病毒檢測(cè)試紙條的使用方法：

(1)使用移液器，取定量體積的犬血清、血漿、全血樣品加入到樣品稀釋液中，充分混合后，取定量體積的測(cè)試液加入到試紙條的加樣槽中，等待3～6min中，若只有質(zhì)控線出現(xiàn)彩色條帶，表明測(cè)試結(jié)果為陰性，樣品中犬瘟熱病毒；若對(duì)照線和測(cè)試線均顯現(xiàn)出彩色條帶，測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性，繼續(xù)等待至15min，使用配套熒光定量檢測(cè)儀器檢測(cè)，可定量給出樣品中動(dòng)物病毒的含量。

實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證結(jié)果

1.使用本案例彩色熒光微球標(biāo)記的犬瘟熱病毒抗體制備的試紙條進(jìn)行犬瘟熱病毒測(cè)試。如圖2所示，陰性和陽(yáng)性都進(jìn)行量?jī)山M平行測(cè)試，兩組測(cè)試均成功。加樣后5min時(shí)，陰性樣品檢測(cè)結(jié)果只有對(duì)照線出現(xiàn)彩色線條，而陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)兩條彩色線條，15min時(shí)使用配套熒光定量檢測(cè)儀器檢測(cè)，兩組陽(yáng)性定量結(jié)果分別為18.6ng/ml,19.1ng/ml。

實(shí)施例二

一種彩色熒光微球標(biāo)記的貓白血病病毒抗體制備的試紙條，包括以下步驟：

(8)將定量的彩色熒光乳膠微球溶液加到緩沖溶液中稀釋，超聲1.5min，得到彩色熒光微球分散液。

(9)向步驟(1)中的彩色熒光乳膠微球分散液中迅速滴入活化劑，快速置于渦旋振蕩器上低速震蕩1min后，固定在渦旋振蕩器上，室溫下震蕩活化30min。

(10)活化結(jié)束后，將步驟(2)中的彩色熒光乳膠微球分散液在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，用步驟(1)中的緩沖溶液清洗，再次以相同條件離心后，棄去上清液，用步驟(4)中緩沖溶液復(fù)溶重懸。

(11)分別取貓白血病病毒的單克隆抗體，分別加入緩沖溶液稀釋至0.085mg/ml。

(12)將步驟(3)中復(fù)溶的納米顆粒分散液加入到步驟(4)中的抗體稀釋液中，立刻在渦旋震蕩器上震蕩1.5min，隨后超聲1.5min，然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(13)反應(yīng)結(jié)束后，將步驟(5)中溶液超聲1min，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，加入封閉液，同樣然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(14)將步驟(6)中溶液離心后再次加入封閉液清洗，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，可得到彩色熒光微球標(biāo)記的抗體。

步驟(1)的緩沖溶液是2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液，其ph為7.2。

步驟(2)中活化劑是edc&nhs活化劑。

步驟(3)中復(fù)溶的緩沖溶液以及步驟(4)的緩沖溶液均是硼酸酸緩沖溶液，其ph值為7.8。

本發(fā)明還提供了一種基于上述方法制備的彩色熒光微球標(biāo)記的抗體的試紙條，包括以下組裝步驟：

(5)抗體標(biāo)記的彩色熒光微球中加入重懸液，反復(fù)吹打，隨后超聲5min直至沉淀完全溶解。

(6)將步驟(1)中的抗體標(biāo)記的彩色熒光微球溶液用劃膜噴金機(jī)噴涂于結(jié)合墊，隨后在烘箱中37℃下烘干1h。

(7)將對(duì)照線和檢測(cè)線要包被的抗體，分別用適宜的稀釋液稀釋后，用劃膜噴金機(jī)將其分別噴涂于硝酸纖維素膜上，37℃下在烘箱中烘干1h。

(8)組裝粘貼結(jié)合墊、樣品墊，密封過(guò)夜，使之充分粘合,可得到犬瘟熱和貓白血病病毒檢測(cè)試紙卡。

步驟(2)中彩色熒光微球標(biāo)記的抗體溶液的溶度為1.5mg/ml，涂覆量為5μl/cm。

步驟(3)中硝酸纖維素膜的對(duì)照線包被的抗體為抗鼠lgg多克隆抗體，涂覆量為0.9μl/cm；檢測(cè)線包被的抗體為貓白血病病毒單克隆抗體，涂覆量為0.9μl/cm。

本發(fā)明提供了此貓白血病病毒檢測(cè)試紙條的使用方法：

(1)使用移液器，取定量體積的貓血清、血漿、全血樣品加入到樣品稀釋液中，充分混合后，取定量體積的測(cè)試液加入到試紙條的加樣槽中，等待3～6min中，若只有質(zhì)控線出現(xiàn)彩色條帶，表明測(cè)試結(jié)果為陰性，樣品中貓白血病病毒；若對(duì)照線和測(cè)試線均顯現(xiàn)出彩色條帶，測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性，繼續(xù)等待至15min，使用配套熒光定量檢測(cè)儀器檢測(cè)，可定量給出樣品中

動(dòng)物病毒的含量。

實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證結(jié)果

1.使用本案例彩色熒光微球標(biāo)記的貓白血病病毒抗體制備的試紙條還以貓白血病病毒為例測(cè)定50份臨床樣本，區(qū)間判定結(jié)果和樣本值的符合率為94.2％。本發(fā)明、所述的彩色熒光微球標(biāo)記的貓白血病病毒抗體制備的試紙條可以靈敏地定量檢測(cè)樣品中的貓白血病病毒。

2.使用本案例彩色熒光微球標(biāo)記動(dòng)物病毒抗體制備的試紙條的穩(wěn)定性驗(yàn)證：組裝后的試紙條，分別在兩周、四周、八周后取出，取同樣的測(cè)試樣品檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果cv％較低，表明此試紙條具有良好的穩(wěn)定性。