專(zhuān)利名稱(chēng)：一類(lèi)抗粘附活性的乳糖簇及其熒光標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類(lèi)新的乳糖簇和其熒光標(biāo)記物，及其制備方法和在制備抗粘附、抗休克藥物及作為分子探針在生物學(xué)研究中的用途。該類(lèi)化合物能夠有效地抑制內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞的粘附，減輕休克的程度，延長(zhǎng)存活時(shí)間，可作為抗炎、抗休克藥物用于重癥休克病人的搶救和治療。其熒光標(biāo)記物，可作為分子探針用于粘附位點(diǎn)的研究。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用在許多生理和病理過(guò)程中起重要作用，例如，炎癥反應(yīng)、血栓、動(dòng)脈粥樣斑塊形成等。而白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的粘附在失血性休克中同樣起著重要作用[1-9]。創(chuàng)傷、燒傷引起的重癥休克是平時(shí)和戰(zhàn)常見(jiàn)的病理過(guò)程，是造成病人死亡和部隊(duì)?wèi)?zhàn)時(shí)減員的主要原因之一。目前對(duì)休克發(fā)生機(jī)理的研究已由細(xì)胞、亞細(xì)胞水平進(jìn)入分子水平；研究證實(shí)，白細(xì)胞粘附于微血管不僅會(huì)減少組織的器官和血流量而且會(huì)游出造成進(jìn)一步的損傷，是造成休克不可逆的主要原因之一。因此，減少休克時(shí)粘附于微血管的白細(xì)胞數(shù)量，就有可能使休克減輕，為綜合救治創(chuàng)造機(jī)會(huì)[10-12]。已經(jīng)有報(bào)道表明，乳糖具有抗粘附活性，一些乳糖的衍生物也已被證實(shí)有抑制白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附的功能。為了進(jìn)一步研究糖簇效應(yīng)和連接臂的長(zhǎng)短對(duì)抗粘附效應(yīng)的影響，一些多價(jià)的乳糖已經(jīng)合成，另外，熒光標(biāo)記的多價(jià)乳糖衍生物，也已經(jīng)合成出來(lái)并作為熒光性探針用于粘附機(jī)理的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明制備了以不同連接臂綴合的乳糖簇用于抗粘附、抗休克活性研究，這些連接臂包括聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸。在相應(yīng)的糖簇化合物預(yù)留出氨基，綴以熒光素，將其作為小分子探針用于白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附位點(diǎn)等作用機(jī)制的研究。
合成的化合物可以用下列通式表示 R1選自聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸中的一種或幾種。
其中m為2、4、6。
R1選自聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸中的一種或幾種。
其中m為2、4、6。
溴代-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-2，3，6-三-O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖與聚乙二醇(PEG，n＝4，5，6)在無(wú)水CH2Cl2中，Ag2CO3為催化劑，室溫下反應(yīng)即得到相應(yīng)的二價(jià)乳糖1，2，3，收率60-70％。
由2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖與2-疊氮甘油在無(wú)水CH2Cl2中，BF3·OEt2為催化劑，室溫下反應(yīng)制得二價(jià)乳糖4，收率86％。然后在EtOAc-EtOH(1∶1)中用Pd(OH)2/C催化氫化得到化合物5，5作為糖單元用于糖簇的合成。
5與連接臂反應(yīng)，例如丁二酸，辛二酸，均苯三酸在無(wú)水四氫呋喃中，在HOBt和DCC存在下偶聯(lián)得到四，六價(jià)乳糖6，7，8。收率70-88％。

四價(jià)乳糖9由5與Cbz保護(hù)的谷氨酸反應(yīng)制得，化合物9在CH3OH中用Pd/C催化氫化以94％的收率得到10。5或10與FITC(熒光素-5-異硫氰酸)在無(wú)水CH2Cl2和DMF中，40℃反應(yīng)6～8小時(shí)，便成功地在糖簇中引入了熒光功能基團(tuán)，收率95～96％。

將糖簇1，2，3，5，6，7，8，9，10，11和12用CH3ONa/CH3OH處理得到目標(biāo)化合物13，14，15，16，17，18，19，20，21和22，收率94-98％.


圖1化合物16和20對(duì)燒傷休克大鼠白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響圖2化合物16和20對(duì)燒傷休克大鼠存活時(shí)間的影響圖3化合物21的粘附結(jié)果圖4化合物22的粘附結(jié)果具體實(shí)施方式
實(shí)施例1.3，6，9-三氧雜-1，11-二O-二-[2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖-(1→4)-2，3，6-三-O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖基]十二烷-11-溴代-2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖(0.2g，0.29mmol)和PEG(n＝4，0.02g，0.10mmol)溶于無(wú)水CH2Cl2(10mL)中，加入Ag2CO3(0.08g)和4分子篩(0.1g)，室溫?cái)嚢?0小時(shí)。過(guò)濾混合物，用CH2Cl2稀釋?zhuān)?，無(wú)水Na2SO4干燥，蒸除溶劑。粗產(chǎn)品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶乙酸乙酯＝1∶3。得無(wú)色糖漿。收率70％。[α]D＝+30.3°(c＝0.66，CH3Cl)；1HNMR(CD3Cl)δ5.35(d，1H，H-4′)，5.16(t，1H，H-3)，5.09(dd，1H，H-2′)，4.97(dd，1H，H-3′)，4.86(t，1H，H-2)，4.56(d，1H，J1，2＝7.80Hz，H-1)，4.49(d，1H，J1′，2′＝9.00Hz，H-1′)，4.51，4.22～4.08(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.90～3.61(m，11H，H-4，5，H-5′，-CH2O-)，2.15～1.97(7s，21H，7CH3CO-)；13CNMR(CD3Cl)δ170.4～169.0(7C，CH3C＝O)，101.0(C-1′)，100.5(C-1)，76.2(C-4)，72.7(C-3)，72.5(C-5)，71.5(C-2)，71.0(C-5′)，70.6(C-3′)，70.5(-CH2O-)，70.1(-CH2O-)，69.9(-CH2O-)69.0(-CH2O-)，68.7(C-2′)，66.5(C-4′)，63.5(C-6′)，60.7(C-6)，20.9～20.4(7C，7CH3CO-).
實(shí)施例2.3，6，9，12-四氧雜-1，14-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]十六烷-2化合物2的制備同1，以PEG(n＝5)為連接臂，粗產(chǎn)品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶乙酸乙酯＝2∶7。得無(wú)色糖漿。收率63％。
實(shí)施例3.3，6，9，12，15-五氧雜-1，17-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三-O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖基]二十烷-3化合物3的制備同1，以PEG(n＝6)為連接臂，粗產(chǎn)品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶乙酸乙酯＝1∶4。得無(wú)色糖漿。收率60％。
實(shí)施例4.2-疊氮基-1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙烷4-2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-1，2，3，6-四-O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖(5.1g，7.52mmol)及2-疊氮-1，3-丙二醇(0.4g，3.42mmol)溶于無(wú)水CH2Cl2(10mL)中，加入BF3·OEt2(0.2mL)，室溫?cái)嚢?4小時(shí)。混合物用CH2Cl2(20mL)稀釋后，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，蒸除溶劑。粗產(chǎn)品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮3∶2，得無(wú)色糖漿。收率86％。
實(shí)施例5.2-氨基-1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙烷5——化合物4(1g，0.74mmol)溶于乙酸乙酯-乙醇(1∶1，20mL)，加入Pd(OH)2(100mg)，室溫下催化氫化(0.4MPa)6小時(shí)，濾除催化劑，蒸除溶劑。粗產(chǎn)品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶3，。得無(wú)色糖漿。收率92％。[α]25D-18.65°(c 1.93，CHCl3).1HNMR(CD3Cl)δ5.35(d，1H，H-4′)，5.18(t，1H，H-3)，5.10(dd，1H，H-2′)，4.96(dd，1H，H-3′)，4.89(t，1H，H-2)，4.49(d，2H，J1，2＝8.10Hz，H-1)，4.44(d，1H，J1′，2′＝8.40Hz，H-1′)，4.46，4.12～4.08(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.91～3.43(m，6H，H-4，5，H-5′，-CH2O-，-CHNH2-)，2.17～1.92(7s，21H，7CH3CO-)；13CNMR(CD3Cl)δ170.2～168.9(7C，CH3C＝O)，100.9(C-1′)，100.7(C-1)，76.0(C-4)，72.6(C-3)，72.1(C-5)，71.5(C-2)，70.8(C-5′)，70.5(C-3′)，69.0(-CH2O-)，68.7(C-2′)，66.5(C-4′)，61.7(C-6′)，60.7(C-6)，50.5(-CHNH2-)，20.7～20.4(7C，7CH3CO-).
實(shí)施例6.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-丁二酰胺6-丁二酸(0.02g，0.17mmol)溶于無(wú)水THF(3mL)，冷卻至0℃，然后加入HOBt(0.07g，0.51mmol)和DCC(0.11g，0.51mmol)。0℃下攪拌0.5小時(shí)，化合物5(0.4g，0.34mmol)的THF溶液(5mL)用N-甲基嗎啡啉將溶液調(diào)至pH＝8～9后加入反應(yīng)瓶中，混合物在0℃下攪拌2小時(shí)后于室溫下攪拌36小時(shí)，蒸除溶劑，加入CH2Cl2(10mL)，濾去不溶物，溶液依次用10％的檸檬酸溶液、飽和碳酸氫鈉溶液和水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，蒸除溶劑。粗產(chǎn)品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶3。得無(wú)色糖漿(0.35g)，收率85％。[α]25D-19.75°(c1.62，CHCl3)；1HNMR(CD3Cl)δ6.14(d，1H，-NHCO)，5.36(d，1H，H-4′)，5.20(t，1H，H-3)，5.13(dd，1H，H-2′)，4.93(dd，1H，H-3′)，4.87(t，1H，H-2)，4.49(d，2H，J1.2＝7.80Hz，H-1)，4.45(d，1H，J1′，2′＝7.80Hz，H-1′)，4.53，4.13～4.05(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.89～3.49(m，6H，H-4，5，H-5′，-CH2O-，-CHNH2-)，2.16～2.14(s，1H，COCH2-)，2.14～1.97(7s，21H，7CH3CO-)，1.84(t，1H，-CH2-)；13CNMR(CD3Cl)δ171.4～169.0(8C，CH3C＝O，-CONH)，101.0(C-1′)，100.8(C-1)，76.1(C-4)，72.7(C-3)，72.4(C-5)，71.7(C-2)，71.5(C-5′)，70.9(C-3′)，70.6(-CH2O-)，69.0(C-2′)，66.6(C-4′)，61.8(C-6′)，60.7(C-6)，48.3(-CHNHCO-)，30.8(-CH2CO)，20.9～20.5(7C，7CH3CO-，).
實(shí)施例7.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-辛二酰胺7-化合物7的制備同化合物6，用辛二酸作連接臂，粗產(chǎn)品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶3，得無(wú)色糖漿。收率83％。
實(shí)施例8.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-1，3，5均苯三酰胺8-化合物8的制備同化合物6，用1，3，5-均苯三酸作連接臂，粗產(chǎn)品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶3。得無(wú)色糖漿。收率70％。
實(shí)施例9.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-芐氧羰酰氨基戊二酰胺9-化合物9的制備同化合物6，用芐氧羰基-L-谷氨酸作連接臂。粗產(chǎn)品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮＝2∶3，得無(wú)色糖漿，收率88％.
實(shí)施例10.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-氨基戊二酰胺10-化合物9(0.2g，0.07mmol)溶于MeOH(10mL)，加入Pd/C，室溫下催化氫化(0.4MPa)3小時(shí)，濾除催化劑，蒸除溶劑，粗產(chǎn)品用柱層析純化，石油醚(60-90℃)∶丙酮2∶5，得無(wú)色糖漿(0.18g)，收率94％。[α]25D-31.58°(c1.14，CHCl3)；1HNMR(CD3Cl)δ6，21(d，1H，-NHCO)，6.18(d，1H，-NHCO)，5.35(d，1H，H-4′)，5.20(t，1H，H-3)，5.12(dd，1H，H-2′)，4.96(dd，1H，H-3′)，4.86(dd，1H，H-2)，4.46(d，2H，J1，2＝J1′2′＝7.50Hz，H-1，H-1′)，4.48，4.13～4.08(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.90～3.53(m，7H，H-4，5，H-5′，-CH2O-，-COCHNH-，-CHNH2-，)，2.32～1.97(m，23H，7CH3CO-，-COCH2-，-CH2CHNH2)；13CNMR(CD3Cl)δ170.3～169.0(9C，CH3C＝O，-CONH)，101.0(2C，C-1，C-1′)，76.1(C-4)，72.8(C-3)，72.6(C-5)，71.6(C-2)，71.5(C-5′)，70.9(C-3′)，70.6(-CH2O-)，69.0(C-2′)，66.5(C-4′)，61.8(C-6′)，60.7(C-6)，48.6～48.3(2C，-CHNHCO-)，20.8～20.5(9C，7CH3CO-，-CH2CO，-CH2CHNH2).
實(shí)施例11.2-FITC-1，3-二-O-二-[-2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖基]丙烷11-FITC(0.06g，0.15mmol)溶于無(wú)水DMF(0.2mL)，滴加化合物5(0.2g，0.15mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液，40℃攪拌8小時(shí)。蒸除溶劑，粗產(chǎn)品用柱層析純化，CHCl3∶MeOH＝10∶1，得到黃色糖漿(0.25g)，收率96％.[α]25D-28.95°(c 1.52，CHCl3)；8.02，7.93，6.72，6.58(m，9H，PhH)，7.15(d，2H，-NHCSNH-)，5.35(d，1H，H-4′)，5.14(t，1H，H-3)，5.10(dd，1H，H-2′)，4.92(dd，1H，H-3′)，4.82(dd，1H，H-2)，4.55(d，2H，J1，2＝J1′，2′＝7.80Hz，H-1，H-1′)，4.53，4.13～4.09(m，4H，H-6a，b，H-6a′，b′)，3.93～3.68(m，6H，H-4，5，H-5′，-CH2O-，-CHNHCS-，)，2.94(1H，PhCH-)，2.18～1.97(m，21H，7CH3CO-)；13CNMR(CD3Cl)δ207.3，180.7，139.9，129.4，110.6(10C，Ph，PhCH-)，171.1～169.0(8C，CH3C＝O，-PhCO)，162.7(C＝S)，102.7(C-1′)，100.8(C-1)，75.9(C-4)，72.9(C-3)，72.6(C-5)，71.5(C-2)，71.3(C-5′)，70.8(C-3′)，70.4(-CH2O-)，68.9(C-2′)，66.5(C-4′)，61.7(C-6′)，60.6(C-6)，52.9(-CHNHCS-)，30.7()，20.9～20.3(7C，7CH3CO-).
實(shí)施例12.N-{2-[1，3-二-O-二-[2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，6-三--O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-FITC-戊二酰胺12-化合物12的制備同化合物11，粗產(chǎn)品用柱層析純化，CHCl3∶MeOH＝10∶1，得到黃色糖漿，收率95％。
實(shí)施例13.3，6，9-三氧雜-1，11-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]十二烷13-化合物1(0.1g)溶于甲醇(10mL)，加入催化量的鈉，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，然后用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂中和至中性。濾去樹(shù)脂，蒸除溶劑，殘?jiān)苡?0mL水，冷凍干燥，得白色固體(0.06g，97％)。[α]D＝+56.3°(c＝0.71，H2O)；1HNMR(D2O)δ4.33(d，1H，J1′，2′＝8.40Hz，H-1′)，4.26(d，1H，J1，2＝7.50Hz，H-1)，3.85～3.47(m，19H，H-3，4，5，6a，b，H-2′，3′，4′，5′，6a′，b′，-CH2O-)，3.36(m，1H，H-2)；13CNMR(D2O)δ105.7(C-1′)，104.8(C-1)，81.0(C-4)，78.1，77.5，77.0，75.2，74.4，73.8，73.7，72.3，72.2，71.5，71.3，63.8，62.8(C-2，3，5，6，C-2′，3′，4′，5′，6′，-CH2O-).
實(shí)施例14.3，6，9，12-四氧雜-1，14-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]十六烷14-化合物14的制備同化合物13，收率97％。
實(shí)施例15.3，6，9，12，15-五氧雜-1，17-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]二十烷15-化合物15的制備同化合物13，收率95％。
實(shí)施例16.2-氨基-1，3-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙烷16-化合物16的制備同化合物13，收率98％。
實(shí)施例17.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-丁二酰胺17-化合物17的制備同化合物13，收率97％。[α]25D-46.51°(c 1.29，H2O)；1HNMR(D2O)δ6.10(d，1H，-NHCO)，4.33(d，1H，J1，2＝7.80Hz，H-1)，4.28(d，1H，J1′，2′＝7.80Hz，H-1′)，3.83～3.18(m，13H，H-2，3，4，5，6a，b，H-2′，3′，4′，5′，6a′，b′，-CH2O-，-CHNH2)，2.40(s，1H，-CH2CO)；13CNMR(D2O)δ175.4(-NHC＝O)，103.5(C-1′)，103.1(C-1)，78.9(C-4)，75.9，75.3，74.8，73.3，73.1，72.3，71.5，69.1，(C-2，3，5，C-2′，3′，4′，5′，-CH2O-)，61.6，60.6(C-6，C-6′)，49.5(-CHNH2)，31.5(COCH2).
實(shí)施例18.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-辛二酰胺18-化合物18的制備同化合物13，收率95％。
實(shí)施例19.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-1，3，5-均苯三酰胺19-化合物19的制備同化合物13，收率94％。
實(shí)施例20.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-氨基-戊二酰胺20-化合物20的制備同化合物13，收率96％。
實(shí)施例21.2-FITC-1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙烷21-化合物21的制備同化合物13，收率96％。[α]25D-35.82°(c 1.34，H2O)；1HNMR(D2O)δ7.77，6.68，6.36(m，9H，C6H5)，7.10(d，2H，-NHCSNH-)，4.26(d，2H，J1，2＝J1′，2′＝7.50Hz，H-1，H-1′)，3.75～3.17(m，13H，H-2，3，4，5，6a，b，H-2′，3′，4′，5′，6a′，b′，-CH2O-，-CHNH-)；13CNMR(D2O)δ165.5(C＝S)，155.4，152.7，141.0，131.3，119.9，117.4，113.2(10C，C6H5，C6H5CH)，103.6(C-1′)，103.3(C-1)，79.1(C-4)，78.8，75.9，75.4，74.8，73.4，73.1，71.5，69.1，68.7(C-2，3，5，C-2′，3′，4′，5′，-CH2O-)，61.6，60.8(C-6，C-6′)，49.4(-CHNH).
實(shí)施例22.N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-FITC-戊二酰胺22-化合物22的制備同化合物13，收率94％。
活性試驗(yàn)結(jié)果將上述合成的化合物進(jìn)行了抗粘附和抗休克活性的測(cè)定，均顯出良好的抗粘附和休克保護(hù)作用。熒光標(biāo)記的乳糖綴合物作為生物探針，在粘附靶細(xì)胞的研究中得到了明確的結(jié)果。具體活性試驗(yàn)操作及典型化合物的結(jié)果如下抗粘附活性試驗(yàn)(1)血液粒細(xì)胞的制備動(dòng)物麻醉后，分離頸部動(dòng)脈插管，以肝素抗凝取血3-5ml，并加等量生理鹽水稀釋?zhuān)靹蚝筝p輕加到底部裝有5ml淋巴細(xì)胞分離液的試管中，2000rpm離心20min，取紅細(xì)胞表層的白細(xì)胞，加到5ml紅細(xì)胞裂解液中搖勻放置8min，再looorpm離心smin，棄上清液，(紅細(xì)胞去除不完全可再重復(fù)裂解1次)，以DMEM培養(yǎng)基洗2次，計(jì)數(shù)后，配成1-2XIO6/ml濃度的粒細(xì)胞懸液備用。
(2)大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)動(dòng)物放血處死，75％酒精浸泡消毒動(dòng)物皮膚，無(wú)菌條件下開(kāi)胸取其肺組織，洗去血液后再將肺周邊組織剪下一圈，將其剪碎成1mm3大小的組織塊，加含20％小牛血清DMEM培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃、5％CO2中培養(yǎng)60～72小時(shí)，換液去掉組織塊，再培養(yǎng)4～7天，培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿(mǎn)鵝卵石樣的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞。用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，將其傳代至載玻片上繼續(xù)培養(yǎng)，待其長(zhǎng)滿(mǎn)后用于粘附實(shí)驗(yàn)。
(3)細(xì)胞液流室制作液流室由兩層透明有機(jī)玻璃制成中空液流通道，內(nèi)徑長(zhǎng)6.1cm，寬1.5cm。液流室兩端及兩側(cè)各有一通道，用于通入液體及測(cè)壓力。其中一端連接蠕動(dòng)泵用于形成不同流速不同切應(yīng)力的液體灌流。
(4)粒細(xì)胞粘附特性的檢測(cè)將已長(zhǎng)滿(mǎn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的載玻片放入液流室中，用橡膠墊圈上下密封玻片四周，蓋好后用螺絲釘旋緊至無(wú)液體滲漏。連接好蠕動(dòng)泵后放入Olympus倒置顯微鏡的觀(guān)察室中，觀(guān)察室保持37℃恒溫。將視野放大400倍，用MTV彩色攝象機(jī)、National監(jiān)視器和JVC錄像機(jī)同步錄像觀(guān)察記錄。先用Hanks液灌洗以清除液流室及其連接導(dǎo)管中的氣泡(關(guān)鍵步驟)。然后再加入分離的白細(xì)胞到液流室中與內(nèi)皮細(xì)胞溫育20～30min。開(kāi)動(dòng)蠕動(dòng)泵，以不同的切應(yīng)力灌流2min，計(jì)數(shù)各種切應(yīng)力灌流后視野中與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的白細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其粘附率。
兩個(gè)代表性化合物16和20的抗粘附活性(flow chamber)如圖1所示結(jié)果表明這兩種寡糖具有明顯抑制休克大鼠白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的活性。
燒傷休克保護(hù)活性試驗(yàn)動(dòng)物模型24只SD大鼠，體重180～220g，雌雄不限，隨機(jī)分為3組。用133％烏拉坦+05％氯醛糖(06mL/100g體重，ip)麻醉。一側(cè)頸總動(dòng)脈插入PE-50導(dǎo)管，用于監(jiān)測(cè)血壓和采血。用80℃熱水燙傷腰以下肢體30s(占體表面積35％～40％)造成深I(lǐng)I度燒傷，復(fù)制大鼠重癥燒傷休克模型。燙傷后20分鐘左右給予寡糖或生理鹽水，只給藥一次。
動(dòng)物試驗(yàn)的樣品量40nmol/100g體重。
兩個(gè)代表性化合物16和20的抗燒傷休克保護(hù)活性(大鼠模型)，如圖2所示結(jié)果表明，兩種寡糖均能延長(zhǎng)燒傷休克大鼠的存活時(shí)間，具有明顯的治療作用。
熒光標(biāo)記寡糖綴合物用于粘附靶點(diǎn)的確定將寡糖配制成10pmol/ul的工作液，與分離得到的白細(xì)胞作用10分鐘后洗去未結(jié)合寡糖，在熒光顯微鏡下觀(guān)察。
化合物21、22粘附結(jié)果分別如圖3、圖4所示結(jié)果表明化合物21、22都能與白細(xì)胞結(jié)合，特別是粒細(xì)胞。這可能是其抗粘附和抗休克的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
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12.Lindhorst，T.，K.，Kieburg，C.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1996，35，1953-.195權(quán)利要求
1.具有通式(I)的抗粘附活性的乳糖簇化合物， R1選自聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸中的一種或幾種，其中m為2、4、6。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于聚乙二醇的聚合度n為4-6的整數(shù)；多元羧酸選自丁二酸、辛二酸、均苯三酸中的一種或幾種。
3.權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于該化合物為3，6，9-三氧雜-1，11-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]十二烷；3，6，9，12-四氧雜-1，14-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]十六烷；3，6，9，12，15-五氧雜-1，17-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]二十烷；2-氨基-1，3-二-O-二-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙烷；N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-丁二酰胺；N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-辛二酰胺；N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡哺葡萄糖基]丙基}-1，3，5-均苯三酰胺；N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-氨基-戊二酰胺。
4.具有通式(II)的熒光標(biāo)記化合物， R1選自聚乙二醇、2-氨基-1，3-丙二醇及多元羧酸中的一種或幾種，其中m為2、4、6。
5.權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于聚乙二醇的聚合度n為4-6的整數(shù)；多元羧酸選自丁二酸、辛二酸、均苯三酸中的一種或幾種。
6.權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于該化合物為2-FITC-1，3-二-O-二-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙烷；N-{2-[1，3-二-O-二-[O-β-D-吡哺半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]丙基}-2-FITC-戊二酰胺。
7.權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的化合物在制備抗粘附、抗休克活性藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求4至6任意一項(xiàng)所述的熒光標(biāo)記化合物作為分子探針的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類(lèi)新的乳糖簇和其熒光標(biāo)記物，及其制備方法和在制備抗粘附、抗休克藥物及作為分子探針在生物學(xué)研究中的用途。該類(lèi)化合物能夠有效地抑制內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞的粘附，減輕休克的程度，延長(zhǎng)存活時(shí)間，可作為抗炎、抗休克藥物用于重癥休克病人的搶救和治療。部分糖簇的熒光標(biāo)記物，可作為分子探針用于粘附位點(diǎn)的研究。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1834104SQ20061007866
公開(kāi)日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2006年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月30日
發(fā)明者李中軍, 李慶, 趙致輝, 孟祥豹 申請(qǐng)人:北京大學(xué)