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鼠抗人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):1114824閱讀:202來源:國(guó)知局
專利名稱:鼠抗人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種鼠抗人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)是早期發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子之一。MIF的cDNA編碼一個(gè)具有115個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),該蛋白不屬于任何一個(gè)細(xì)胞因子超家族,與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中其他任何蛋白都不具有很強(qiáng)同源性。所有哺乳類動(dòng)物的MIF蛋白(包括人、大鼠、小鼠、牛)大約有90%的同源性。物種間MIF的保守性顯示了MIF可能有重要的生物學(xué)功能。
免疫系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞是產(chǎn)生MIF的主要細(xì)胞,在其他組織分布也很廣。值得注意的是,表達(dá)MIF的細(xì)胞或是組織,如肺、皮膚上皮層、胃腸道、泌尿生殖道等,和宿主的自然環(huán)境直接相關(guān)。MIF的另一個(gè)與眾不同的性質(zhì)是一些內(nèi)分泌系統(tǒng)的組織可以高水平表達(dá)MIF,特別是那些和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的器官,如下丘腦、垂體、腎上腺等。
糖皮質(zhì)激素是一種廣譜的抗炎藥物,而MIF是人們發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)糖皮質(zhì)激素功能的拮抗蛋白。MIF一經(jīng)釋放,就可以使類固醇(糖皮質(zhì)激素)的免疫抑制效應(yīng)失效,從而表現(xiàn)出獨(dú)特的生理作用,就好像是一種由糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控因子(Bucala,R.(1996).MIF re-discoveredpituitary hormone andglucocorticoid-induced regulator of cytokine production.Cytokine GrowthFactor Rev.7,19-24;Donnelly,S.C.and Bucala,R.(1997).Macrophagemigration inhibitory factora regulator of glucocorticoid activity witha critical role in inflammatory disease.Mol.Med.Today 3,502-507.)。
MIF作為一個(gè)細(xì)胞因子在固有性免疫系統(tǒng)中有著重要的作用。LPS,TNF-α,IFN-γ等刺激巨噬細(xì)胞釋放MIF,當(dāng)MIF釋放到組織或在全身循環(huán)時(shí),它就充當(dāng)一個(gè)經(jīng)典的促炎癥細(xì)胞因子,通過巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞活化而促進(jìn)固有性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
高水平的MIF生成在急性感染中是有害的。在動(dòng)物模型中,抑制MIF的作用,對(duì)于敗血癥,急性肺損傷以及全身炎癥反應(yīng)綜合癥都具有明顯的治療效果(Calandra,T.and Bucala,R.(1995).Macrophage migration inhibitory factora counter-regulator of glucocorticoid action and critical mediator ofseptic shock.J.Inflamm.47,39-51;Calandra,T.,Echtenacher,B.,Roy,D.L.,Pugin,J.,Metz,C.N.,Hultner,L.,Heumann,D.,Mannel,D.,Bucala,R.,andGlauser,M.P.(2000).Protection from septic shock by neutralization ofmacrophage migration inhibitory factor.Nat.Med.6,164-170)。由于全身炎癥反應(yīng)綜合癥是SARS和人禽流感的重要致死原因,抗MIF抗體對(duì)這類突發(fā)性的急性呼吸道感染應(yīng)有很好的療效。
MIF與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,哮喘,多發(fā)性硬化癥,糖尿病等自身免疫疾病也有重要聯(lián)系。例如在大鼠關(guān)節(jié)炎模型中,抗MIF抗體可以很好地減緩大鼠的病情發(fā)展,100%地抑制死亡率。由于MIF對(duì)糖皮質(zhì)激素的拮抗作用,抗MIF抗體與低劑量糖皮質(zhì)激素聯(lián)用,有可能增強(qiáng)激素的抗炎癥作用,降低激素的副作用(Baugh,J.A.andDonnelly,S.C.(2003).Macrophage migration inhibitory factoraneuroendocrine modulator of chronic inflammation.J.Endocrinol.179,15-23;Morand,E.F.(2005).New therapeutic target in inflammatory diseasemacrophage migration inhibitory factor.Intern.Med.J.35,419-426)。MIF在腫瘤生成中也起到關(guān)鍵作用,研究表明,多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)MIF,而MIF對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活以及腫瘤血管的生成是必須的(Nishihira,J.,Ishibashi,T.,F(xiàn)ukushima,T.,Sun,B.,Sato,Y.,and Todo,S.(2003).Macrophage migrationinhibitory factor(MIF)Its potential role in tumor growth andtumor-associated angiogenesis.Ann.N.Y.Acad.Sci.995,171-182;Mitchell,R.A.and Bucala,R.(2000).Tumor growth-promoting properties ofmacrophage migration inhibitory factor(MIF).Semin.Cancer Biol.10,359-366)。
綜上所述,MIF是一個(gè)非常重要的細(xì)胞因子,對(duì)MIF活性的抑制可望給患有嚴(yán)重?cái)⊙Y和炎癥,自身免疫性疾病及癌癥的病人提供新的治療選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供一種分泌特異性結(jié)合人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
該雜交瘤細(xì)胞系為雜交瘤細(xì)胞株10C3CGMCC No.1717。
雜交瘤細(xì)胞株10C3CGMCC No.1717已于2006年5月22日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC),保藏中心地址是中國(guó)北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào),其保藏編號(hào)為CGMCC No.1717。
本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種特異性結(jié)合人MIF蛋白的單克隆抗體,或者衍生于這種單克隆抗體的單鏈抗體,F(xiàn)ab片段,或者人-鼠嵌合抗體。
本發(fā)明所提供的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體;所述單克隆抗體的衍生物為單鏈抗體、Fab片段或人-鼠嵌合抗體。
所述雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體、由所述單克隆抗體衍生的Fab片段或人-鼠嵌合抗體的重鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列,輕鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列。
由所述單克隆抗體衍生的人-鼠嵌合抗體的輕鏈具有序列表中序列8的氨基酸殘基序列,重鏈具有序列表中序列9的氨基酸殘基序列。其名稱為ch-10C3。
由所述單克隆抗體衍生的單鏈抗體具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列,其名稱為10C3scFV。
上述單克隆抗體及其衍生物的編碼基因。
由所述單克隆抗體衍生的人-鼠嵌合抗體的輕鏈編碼基因可具有序列表中序列6的核苷酸序列,重鏈編碼基因可具有序列表中序列7的核苷酸序列。
單鏈抗體10C3scFV的編碼基因可具有序列表中序列10的核苷酸序列。
實(shí)驗(yàn)證明雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體、衍生于該單克隆抗體的單鏈抗體10C3scFV、人-鼠嵌合抗體ch-10C3或Fab片段與人MIF的解離常數(shù)分別為3nM,30nM,3nM,10nM。雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體、衍生于該單克隆抗體的單鏈抗體10C3scFV、人-鼠嵌合抗體ch-10C3或Fab片段可以阻斷人MIF刺激Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子NO和TNF-alpha,在LPS誘導(dǎo)的小鼠敗血癥模型中具有保護(hù)作用。
上述單克隆抗體及其衍生物能夠高親和力特異性識(shí)別人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子,并中和其生物學(xué)活性,可以用于治療敗血癥,全身炎癥反應(yīng)綜和癥或急性肺損傷等炎癥反應(yīng);可以用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,哮喘,多發(fā)性硬化癥,糖尿病或紅斑狼瘡等自身免疫性疾??;還可以抑制腫瘤的生成;上述單克隆抗體及其衍生物能夠與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合用藥,降低糖皮質(zhì)激素的用量及副作用。
上述單克隆抗體及其衍生物可用于臨床檢驗(yàn)MIF的水平。


圖1為ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體與人MIF的解離曲線圖2為雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體抑制人MIF刺激Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO曲線圖3為雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體抑制人MIF刺激Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-alpha的結(jié)果圖4為注射LPS和注射LPS和雜交瘤細(xì)胞株10C3CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的小鼠的存活情況具體實(shí)施方式
下述實(shí)驗(yàn)方法,如無特別說明,均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、抗MIF單克隆抗體的制備和鑒定1、雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的制備本發(fā)明用大腸桿菌表達(dá)的人MIF蛋白(huMIF)(將huMIF的編碼區(qū)克隆至刪除了GST編碼區(qū)的PET-41a載體(Novagen,USA),克隆的質(zhì)粒在DH5α里擴(kuò)增,再經(jīng)由BL21中表達(dá)。融合蛋白中帶有6×his Tag,通過Ni-NTA親和層析純化。)免疫NZB/W F1小鼠(南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所),80微克人MIF加MPL+TDM乳液狀佐劑(sigma)足底免疫,一周一次,共三次。第三次免疫3天后的NZB/W F1小鼠取淋巴結(jié)中的免疫細(xì)胞與鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞以5∶1比例混合,用聚乙二醇進(jìn)行融合,HAT篩選后得到雜交瘤。
分泌特異性結(jié)合MIF抗體的雜交瘤檢測(cè)以大腸桿菌表達(dá)的GST-MIF重組蛋白(10微克/毫升)(將huMIF的編碼區(qū)克隆至PET-41a載體(Novagen,USA),克隆的質(zhì)粒在DH5α里擴(kuò)增,再經(jīng)由BL21中表達(dá)。融合蛋白中帶有GST Tag,通過谷胱甘肽親和層析純化。)包板,雜交瘤上清(進(jìn)行梯度稀釋)為一抗,HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG多克隆抗體(R&D Systems)為二抗進(jìn)行ELISA檢測(cè),獲得解離曲線。ELISA最大讀數(shù)的50%相對(duì)應(yīng)的抗體濃度為抗體的解離常數(shù)。
亞克隆用限制性稀釋法多次克隆分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞,最后獲得雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717。ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體與MIF的解離曲線如圖1所示,表明雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體與人MIF的解離常數(shù)為3nM(即480ng/ml)。圖1的橫坐標(biāo)是雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的濃度,縱坐標(biāo)是ELISA顯色后的光吸收值。
抗體亞型鑒別實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌表達(dá)的GST-MIF重組蛋白(10微克/毫升)包板,雜交瘤上清為一抗,HRP偶聯(lián)的大鼠抗小鼠IgG1,IgG2a,或IgG2b單克隆抗體(BD Pharmingen)為二抗進(jìn)行ELISA檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證明雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCCNo.1717分泌的單克隆抗體為IgG2b亞型。
腹水的制備方法Balb/C小鼠腹腔注射降植烷0.5ml/只十天后,將雜交瘤細(xì)胞懸液接種于小鼠腹腔,待小鼠腹腔有明顯腫脹后收集腹水,離心取上清。通過蛋白A/G親和層析柱(Pierce)純化抗體,0.1M Glycine/HCl(pH2.5)洗脫。
2、雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的生物活性鑒定(1)雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體可以阻斷人MIF刺激Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO重組人MIF(制備方法同上)和步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合后刺激Raw264.7細(xì)胞16小時(shí)。共設(shè)六個(gè)處理終濃度為3ug/ml重組人MIF和終濃度為100ug/ml的步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合處理、終濃度為3ug/ml重組人MIF和終濃度為33.3ug/ml的步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合處理、終濃度為3ug/ml重組人MIF和終濃度為11.1ug/ml的步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合處理、終濃度為3ug/ml重組人MIF和終濃度為3.7ug/ml的步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCCNo.1717分泌的單克隆抗體混合處理、終濃度為3ug/ml重組人MIF和終濃度為1.23ug/ml的步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合處理、終濃度為3ug/ml重組人MIF和終濃度為0.41ug/ml的步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合處理。細(xì)胞培養(yǎng)液中新產(chǎn)生的一氧化氮量用Griess試劑顯色法測(cè)量。結(jié)果如圖2所示,表明步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體(抗體起始濃度為100ug/ml,3倍稀釋)與MIF混合后能顯著降低MIF刺激Raw264.7細(xì)胞引起的NO的分泌。反應(yīng)中加過量的多粘菌素B以消除步驟1純化過程中殘留的LPS影響。圖2的橫坐標(biāo)是雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的濃度。
(2)雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體可以阻斷MIF刺激Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF-a)重組人MIF(制備方法同上)和步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合后刺激Raw264.7細(xì)胞3小時(shí)后收集上清液,稀釋成1/100來刺激L929細(xì)胞,16h后加入5mg/ml MTT 20ul/孔,繼續(xù)培養(yǎng)3h后棄上清,加入150ul DMSO,震蕩后測(cè)A590吸光值。用未經(jīng)刺激的Raw264.7細(xì)胞上清樣品的吸光值減去刺激后的Raw264.7細(xì)胞上清樣品的吸光值,得到相對(duì)殺傷,對(duì)比鼠TNF-a標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到對(duì)應(yīng)的濃度,再乘以樣品體積,得到TNF-a的量。其中,重組人MIF和步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體共有六種混合處理終濃度為0ug/ml重組人MIF和終濃度為0ug/ml的步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合處理、終濃度為3ug/ml重組人MIF和終濃度為0ug/ml的步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合處理、終濃度為0ug/ml重組人MIF和終濃度為100ug/ml的步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合處理、終濃度為3ug/ml重組人MIF和終濃度為100ug/ml的步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合處理、終濃度為3ug/ml重組人MIF和終濃度為33ug/ml的步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合處理、終濃度為3ug/ml重組人MIF和終濃度為11ug/ml的步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體混合處理。結(jié)果如圖3所示,表明步驟1純化的雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體與MIF混合后能顯著降低MIF刺激Raw264.7細(xì)胞引起的TNF-a的分泌。圖3中,10C3Ab表示雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體。
實(shí)施例2、抗MIF人-鼠嵌合抗體ch-10C3的制備鼠抗體在人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng),因此只能由于急癥的治療,一旦人體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)鼠抗體的抗抗體,作為藥物的鼠抗體就會(huì)失效。為了克服這一缺點(diǎn),本發(fā)明對(duì)鼠抗體進(jìn)行了人源化,制備了人-鼠嵌合抗體ch-10C3。該抗體的可變區(qū)序列來自鼠抗體-雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體,不變區(qū)序列來自人IgG1。這種抗體保持了鼠單抗的抗原結(jié)合特異性,同時(shí)降低了在人體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)。制備嵌合抗體的步驟如下從雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717中分離純化mRNA,用oligo-dT合成第一鏈cDNA。用PCR方法分別擴(kuò)增抗體輕鏈和重鏈可變區(qū),輕鏈引物為5’GAY ATTGTG MTS ACM CAR WCT MCA 3’和5’CTC CAG ATG TTA ACT GCT CAC 3’;重鏈引物為5’ATG SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC 3’和5’GGT CAA GGT CAC TGG CTCAGG3’。其中,R=G或A,Y=T或C,M=A或C,S=G或C,W=T或A,N=G或A或C或T。將PCR產(chǎn)物分別克隆到T載體中測(cè)序。結(jié)果表明雜交瘤細(xì)胞株10C3CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的編碼基因具有序列表中序列4的核苷酸序列,編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的重鏈可變區(qū);雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的編碼基因具有序列表中序列5的核苷酸序列,編碼具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的輕鏈可變區(qū)。
將雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因分別與人的輕鏈和重鏈不變區(qū)基因連接,構(gòu)建可編碼嵌合抗體ch-10C3的融合基因,該嵌合抗體輕鏈的編碼基因具有序列表中序列6的核苷酸序列,編碼具有序列表中序列8的氨基酸殘基序列的ch-10C3輕鏈;該嵌合抗體重鏈的編碼基因具有序列表中序列7的核苷酸序列,編碼具有序列表中序列9的氨基酸殘基序列的ch-10C3重鏈。
將該嵌合抗體輕鏈的編碼基因插入到有選擇性標(biāo)記(鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,gpt)和基因表達(dá)調(diào)控區(qū)(CMV啟動(dòng)子,終止子)的表達(dá)載體pCI-gpt(以promega載體pCI為模板構(gòu)建,將鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的編碼基因插入pCI的多克隆位點(diǎn)得到表達(dá)載體pCI-gpt)中,得到該嵌合抗體輕鏈表達(dá)載體pCI-gpt-10C3L。將該嵌合抗體重鏈的編碼基因插入到有選擇性標(biāo)記(二氫葉酸還原酶DHFR)和基因表達(dá)調(diào)控區(qū)(CMV啟動(dòng)子,終止子)的表達(dá)載體pCI-DHFR(以promega載體pCI為模板構(gòu)建,將二氫葉酸還原酶的編碼基因插入pCI的多克隆位點(diǎn)得到表達(dá)載體pCI-DHFR)中,得到該嵌合抗體重鏈表達(dá)載體pCI-DHFR-10C3H。
用電轉(zhuǎn)染的方法將含有嵌合抗體基因的表達(dá)載體pCI-gpt-10C3L和pCI-DHFR-10C3H一同導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞NS/O(購自ECACC)中。用霉酚酸酯(Mycophenolate)在含黃嘌呤(Xanthine)的培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。按照實(shí)施例1的方法用ELISA鑒定抗體的分泌,結(jié)果顯示得到的ch-10C3抗體保留了雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的特異性和親和力,ch-10C3抗體與MIF的解離常數(shù)為3nM。
實(shí)施例3、抗MIF單鏈抗體10C3scFV的制備PCR方法分別擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因,然后用PCR方法將重鏈和輕鏈可變區(qū)用富含甘氨酸和絲氨酸的15氨基酸片段連接起來,獲得抗MIF單鏈抗體10C3scFV的編碼基因序列(序列10)。將10C3 scFV的編碼基因序列克隆到表達(dá)載體pET-26b(Novagen,USA)中,克隆的質(zhì)粒在DH5α里擴(kuò)增,再經(jīng)由BL21中表達(dá)。融合蛋白中帶有6×his Tag,通過Ni-NTA親和層析純化。表達(dá)的10C3 scFV具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列。
按照實(shí)施例1的方法用ELISA鑒定抗MIF單鏈抗體10C3scFV,結(jié)果顯示抗MIF單鏈抗體10C3 scFV保留了雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的特異性和親和力,抗MIF單鏈抗體10C3scFV與MIF的解離常數(shù)為30nM。
實(shí)施例4、抗MIF的Fab片段10C3Fab的制備利用ImmunoPure@Fab制備試劑盒(Pierce)中的固定化木瓜蛋白酶消化雜交瘤細(xì)胞株10C3CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體,將全長(zhǎng)抗體降解成為Fab和Fc片段。酶解后的產(chǎn)物用試劑盒中提供的固定化蛋白A柱純化得到Fab的抗體片段。按照實(shí)施例1的方法用ELISA鑒定雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的Fab片段10C3Fab,結(jié)果顯示雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的Fab片段10C3Fab保留了雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體的特異性和親和力,抗MIF的Fab片段10C3Fab與MIF的解離常數(shù)為10nM。
實(shí)施例5、抗MIF抗體在敗血癥小鼠模型中的應(yīng)用8周齡C57BL/6雌性小鼠20只,重17.5g--18.5g,按體重匹配均分為兩組LPS組(LPS)和抗體組(LPS+anti-MIF)。實(shí)驗(yàn)前在SPF級(jí)動(dòng)物房中同籠48小時(shí),自由進(jìn)食及水。注射前2小時(shí)禁食。LPS組和抗體組小鼠依體重給予LPS(SigmaO111B4)22.5mg/kg。抗體組在給LPS后,給予雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體100ug/只。兩種藥物均用無菌PBS稀釋到終體積200ul,腹腔內(nèi)注射。將兩組分籠喂養(yǎng),觀察給藥后情況。在12hr后,均出現(xiàn)相似的顫抖,體毛直立,對(duì)外界刺激不敏感表現(xiàn)。16小時(shí)后,LPS組和抗體組開始有小鼠死亡;60小時(shí),抗體組的存活率為40%,LPS組的存活率為20%(圖4)。說明雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體在LPS誘導(dǎo)的小鼠敗血癥模型中具有保護(hù)作用。
序列表<160>10<210>1<211>121<212>PRT<213>人工序列<400>1Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys85 90 95Ala Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Tyr Asp Val Trp Gly100 105 110Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>2<211>109<212>PRT<213>人工序列
<400>2Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Ser Ile Ile Ala Ser Arg Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Arg Ser Ser Ile Ser Ser Thr20 25 30Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Leu Asp Ser Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Glu Thr Ser Asp Thr Leu Thr Ile Ser Cys Met Gln65 70 75 80Asp Glu Val Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ser Pro85 90 95Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg100 105<210>3<211>245<212>PRT<213>人工序列<400>3Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys85 90 95Ala Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Tyr Asp Val Trp Gly100 105 110Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser115 120 125Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro130 135 140Val Ser Ile Ile Ala Ser Arg Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg145 150 155 160Ala Arg Ser Ser Ile Ser Ser Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys165 170 175Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala180 185 190Ser Gly Val Leu Asp Ser Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Ser Asp195 200 205Thr Leu Thr Ile Ser Cys Met Gln Asp Glu Val Ala Ala Thr Tyr Tyr210 215 220Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys225 230 235 240Leu Glu Leu Lys Arg245<210>4<211>363<212>DNA<213>人工序列<400>4
caagtacagc tggaggagtc tgggggagcc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acctatgcca tgtcttgggt tcgccagact120ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtgatta cacccactat180ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctatac240ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt tttactgtgc aagaccctac300tacggcagta gttactggtt ctacgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc360tca 363<210>5<211>327<212>DNA<213>人工序列<400>5gatattgtgc tgacccaaac tccagtgtcc ataattgctt ctcgagggga gaaggtcacc60atcacctgcc gtgccagatc aagtataagt tccacttact tacactggta ccagcagaag120ccaggatcct cccctaaact tttgatttat aggacatcca tcctggcatc tggagtccta180gacagcttca gtggcagtgg gtctgagacc tctgacactc tgacaatcag ctgcatgcag240gacgaagttg ctgccactta ctattgtcag caggggagta gtagcccgct cacgttcggt300gctgggacca agctggagct gaaacgg327<210>6<211>645<212>DNA<213>人工序列<400>6gatattgtgc tgacccaaac tccagtgtcc ataattgctt ctcgagggga gaaggtcacc60atcacctgcc gtgccagatc aagtataagt tccacttact tacactggta ccagcagaag120ccaggatcct cccctaaact tttgatttat aggacatcca tcctggcatc tggagtccta180gacagcttca gtggcagtgg gtctgagacc tctgacactc tgacaatcag ctgcatgcag240
gacgaagttg ctgccactta ctattgtcag caggggagta gtagcccgct cacgttcggt300gctgggacca agctggagct gaaacggact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg360ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc420tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc480caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg540acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag600ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt645<210>7<211>1359<212>DNA<213>人工序列<400>7atgcaagtac agctggagga gtctggggga gccttagtga agcctggagg gtccctgaaa60ctctcctgtg cagcctctgg attcactttc agtacctatg ccatgtcttg ggttcgccag120actccagaga agaggctgga gtgggtcgca accattagta gtggtggtga ttacacccac180tatccagaca gtgtgaaggg tcgattcacc atctccagag acaatgccag gaacacccta240tacctgcaaa tgagcagtct gaggtctgag gacacggcca tgttttactg tgcaagaccc300tactacggca gtagttactg gttctacgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc360tcctcagcgt cgaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc420tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg480gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag540tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc600cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt660gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg720gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg780acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc840aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag900tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat960ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg1080gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc1140gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct1200cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc1260aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac1320tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 1359<210>8<211>215<212>PRT<213>人工序列<400>8Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Ser Ile Ile Ala Ser Arg Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Arg Ser Ser Ile Ser Ser Thr20 25 30Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Leu Asp Ser Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Glu Thr Ser Asp Thr Leu Thr Ile Ser Cys Met Gln65 70 75 80Asp Glu Val Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ser Pro85 90 95Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala100 105 110Ala Pro Ser Val PheIle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser115120 125Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu130 135 140Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asm Ser
145 150 155 160Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu165 170 175Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val180 185 190Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys195 200 205Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys210 215<210>9<211>452<212>PRT<213>人工序列<400>9Met Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr20 25 30Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp35 40 45Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser50 55 60Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu65 70 75 80Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr85 90 95Cys Ala Arg Pro Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Tyr Asp Val Trp100 105 110Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro115 120 125Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr130 135 140Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro165 170 175Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr180 185 190Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn195 200 205His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser210 215 220Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu225 230 235 240Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu245 250 255Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser260 265 270His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu275 280 285Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr290 295 300Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn305 310 315 320Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro325 330 335Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln340 345 350Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val355 360 365Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val370 375 380Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro385 390 395 400Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr405 410 415Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val420 425 430Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu435 440 445Ser Pro Gly Lys450<210>10
<211>735<212>DNA<213>人工序列<400>10caagtacagc tggaggagtc tgggggagcc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acctatgcca tgtcttgggt tcgccagact120ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtgatta cacccactat180ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctatac240ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt tttactgtgc aagaccctac300tacggcagta gttactggtt ctacgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc360agcggcagca gcggcagcgg cagcagcggc agcggcagca gcggcagcga tattgtgctg420acccaaactc cagtgtccat aattgcttct cgaggggaga aggtcaccat cacctgccgt480gccagatcaa gtataagttc cacttactta cactggtacc agcagaagcc aggatcctcc540cctaaacttt tgatttatag gacatccatc ctggcatctg gagtcctaga cagcttcagt600ggcagtgggt ctgagacctc tgacactctg acaatcagct gcatgcagga cgaagttgct660gccacttact attgtcagca ggggagtagt agcccgctca cgttcggtgc tgggaccaag720ctggagctga aacgg 73權(quán)利要求
1.雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717。
2.雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體及其衍生物,所述單克隆抗體的衍生物為單鏈抗體、Fab片段或人-鼠嵌合抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體及其衍生物,其特征在于所述雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體、由所述單克隆抗體衍生的Fab片段或人-鼠嵌合抗體的重鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列,輕鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單克隆抗體衍生物,其特征在于由所述單克隆抗體衍生的人-鼠嵌合抗體的輕鏈具有序列表中序列8的氨基酸殘基序列,重鏈具有序列表中序列9的氨基酸殘基序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體及其衍生物,其特征在于由所述單克隆抗體衍生的單鏈抗體具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列。
6.權(quán)利要求2-5中任一所述的單克隆抗體及其衍生物的編碼基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因,其特征在于由所述單克隆抗體衍生的人-鼠嵌合抗體的輕鏈編碼基因具有序列表中序列6的核苷酸序列,重鏈編碼基因具有序列表中序列7的核苷酸序列;由所述單克隆抗體衍生的單鏈抗體編碼基因具有序列表中序列10的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求2-5中任一所述的單克隆抗體及其衍生物在制備藥物中的應(yīng)用,所述藥物為治療由人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子參與的炎癥反應(yīng)的藥物、治療由人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子參與的自身免疫性疾病的藥物或治療由人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子參與的腫瘤的藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其特征在于所述炎癥反應(yīng)為敗血癥,全身炎癥反應(yīng)綜合癥或急性肺損傷;所述自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,哮喘,多發(fā)性硬化癥,糖尿病或紅斑狼瘡。
10.權(quán)利要求2-5中任一所述的單克隆抗體及其衍生物在檢驗(yàn)人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鼠抗人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子單克隆抗體及其應(yīng)用。該鼠抗人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子單克隆抗體,是由雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞株10C3 CGMCC No.1717分泌的單克隆抗體、衍生于該單克隆抗體的單鏈抗體、人-鼠嵌合抗體或Fab片段可以用于治療敗血癥,全身炎癥反應(yīng)綜和癥或急性肺損傷等炎癥反應(yīng);可以用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,哮喘,多發(fā)性硬化癥,糖尿病或紅斑狼瘡等自身免疫性疾??;還可以抑制腫瘤的生成;上述單克隆抗體及其衍生物能夠與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合用藥,降低糖皮質(zhì)激素的用量及副作用。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1869207SQ20061007840
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日
發(fā)明者唐捷, 伍艷芳, 王云波, 周洪哲 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所
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