本發(fā)明屬于中藥化合物篩選技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種香附藥材中天然-葡萄糖苷酶抑制劑的快速篩選方法。

背景技術(shù)：

-葡萄糖苷酶（agh）是一種分布于小腸黏膜刷狀緣的糖苷代謝酶，通過(guò)水解低聚糖中的-1,4糖苷鍵，將進(jìn)入小腸的碳水化合物最終轉(zhuǎn)化為葡萄糖，所產(chǎn)生的葡萄糖被機(jī)體吸收進(jìn)入血液即成為血糖。-葡萄糖苷酶抑制劑（aghi）是20世紀(jì)70年代后期開(kāi)發(fā)出的一類(lèi)的新型口服降血糖藥物，可延遲葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收，進(jìn)而有效推遲糖尿病人餐后血糖升高的時(shí)間及進(jìn)程，降低糖尿病風(fēng)險(xiǎn)。目前，以阿卡波糖為代表的aghi已成為治療ii型糖尿病的一線藥物。然而這些人工合成的aghi，具有一些較為明顯的副作用（如腸胃脹氣，腹部痙攣等），因此從中藥和天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新型的、副作用較小的天然aghi一直是藥學(xué)工作者們所關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

目前，天然aghi的主流篩選方法有系統(tǒng)分離法、活性追蹤法和高通量篩選法等，然而這些主流篩選方法均存在著一個(gè)重大缺陷，均需要進(jìn)行復(fù)雜的、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的分離工作，才能從天然混合物中分離出單體活性成分。由此可見(jiàn)，制約天然aghi篩選效率的主要因素是繁瑣的分離純化步驟，即使是高通量篩選，也僅僅是加快了活性測(cè)試的過(guò)程，但它仍需要大量的、經(jīng)過(guò)系統(tǒng)分離后的單體化合物作為化合物庫(kù)，方能進(jìn)行快速篩選。為了突破這個(gè)瓶頸，一些著眼于簡(jiǎn)化化合物分離、純化環(huán)節(jié)的快速篩選新方法迅速發(fā)展起來(lái)，其中基于固定化酶親和吸附原理的快速篩選方法最受人們關(guān)注。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種香附藥材中天然-葡萄糖苷酶抑制劑的快速篩選方法。

本發(fā)明的上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：香附藥材中天然-葡萄糖苷酶抑制劑的快速篩選方法，具體包括以下步驟。

步驟1、固定化酶的合成：將氨基硅膠與戊二醛反應(yīng)，得到醛基硅膠，即為空白基質(zhì)；所得的醛基硅膠再與-葡萄糖苷酶（agh）反應(yīng)，得到agh鍵和硅膠，即固定化酶。

步驟2、固定化酶的親和吸附與解吸：將固定化酶與香附提取液共孵育一段時(shí)間后，離心分離出固定化酶，再將固定化酶上特異性親和吸附的化合物洗脫下來(lái)，所述的特異性親和吸附的化合物為aghi候選分子；重新取香附提取液，并將空白基質(zhì)與香附提取液共孵育一段時(shí)間后，離心分離出空白基質(zhì)，再將空白基質(zhì)上特異性親和吸附的化合物洗脫下來(lái)，所述的特異性親和吸附的化合物為假陽(yáng)性分子。

步驟3、香附aghi的結(jié)構(gòu)確定：將aghi候選分子和假陽(yáng)性分子分別進(jìn)行uhplc-ms分析，測(cè)定二者的指紋圖譜，隨后將aghi候選分子的指紋圖譜和假陽(yáng)性分子的指紋圖譜進(jìn)行扣減（“aghi候選分子的指紋圖譜”的信號(hào)減去“假陽(yáng)性分子的指紋圖譜”的信號(hào)），即可得到除去假陽(yáng)性結(jié)果的香附aghi指紋圖譜；再通過(guò)hr-ms技術(shù)即可確定香附aghi的結(jié)構(gòu)。

步驟4、香附aghi的活性驗(yàn)證：將上述篩選出的香附aghi，采用常規(guī)的酶活測(cè)定法檢測(cè)其agh抑制活性，進(jìn)一步證明親和篩選結(jié)果的可靠性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的篩選方法具有如下優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)。

本發(fā)明是在我們的前期研究成果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入研究，前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥香附提取物具有很強(qiáng)的agh抑制活性，很有希望從中發(fā)現(xiàn)天然aghi活性單體，因此我們將香附提取物作為待篩選化合物庫(kù)，采用固定化agh酶親和篩選方法進(jìn)行天然aghi的快速發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的方法是先將固定化agh酶與待篩選化合物庫(kù)共孵育，利用酶和抑制劑間的特異性親和作用力，形成“酶-抑制劑”復(fù)合體，隨后將這種復(fù)合體從孵育體系中分離出來(lái)，再?gòu)膹?fù)合體上解吸出抑制劑，并進(jìn)一步鑒定出抑制劑結(jié)構(gòu)。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)需復(fù)雜耗時(shí)的分離工作，可在較短時(shí)間內(nèi)（數(shù)小時(shí)）篩選出天然產(chǎn)物混合物中的活性抑制劑單體。

本發(fā)明的篩選方法相對(duì)于傳統(tǒng)的天然aghi篩選方法而言，本技術(shù)具有快速（篩選周期由數(shù)天至數(shù)周縮短至數(shù)小時(shí)），高效經(jīng)濟(jì)（無(wú)需消耗大量藥材、試劑、人力和場(chǎng)地），實(shí)用可靠（可消除假陽(yáng)性，另包含活性驗(yàn)證環(huán)節(jié)）等突出特點(diǎn)；相對(duì)于目前已建立的一些aghi親和篩選方法而言，本方法的特點(diǎn)在于：首次將基于固定化酶親和技術(shù)的天然-葡萄糖苷酶抑制劑的快速篩選方法應(yīng)用于香附藥材的活性成分篩選中，并成功完成了快速篩選，命中了三種強(qiáng)效的天然aghi；引入平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，有效的消除了由于固定化基質(zhì)的非特異性吸附引起的假陽(yáng)性結(jié)果；引入化合物抑制活性驗(yàn)證環(huán)節(jié)，驗(yàn)證了本篩選方法的可靠性。

附圖說(shuō)明

圖1固定化酶的制備過(guò)程原理示意圖。

圖2固定化酶的親和吸附與解吸過(guò)程原理示意圖；其中1為固定化酶，2為空白基質(zhì)，3為香附提取物，4為親和解析，5為aghi候選分子，6為假陽(yáng)性分子。

圖3香附aghi的結(jié)構(gòu)確定過(guò)程的原理示意圖；其中1為aghi候選分子，2為非特異性吸附的假陽(yáng)性分子，3為注入uhplc-ms進(jìn)行指紋圖譜分析，4為aghi候選分子的指紋圖譜，5為假陽(yáng)性分子的指紋圖譜，6為圖譜扣減，7為扣除假陽(yáng)性結(jié)果后得到的香附aghi的指紋圖譜。

圖4香附藥材提取液的uhplc-ms指紋圖譜。

圖5aghi候選分子（實(shí)線）及假陽(yáng)性分子（虛線）的uhplc-ms指紋圖譜。

圖6扣減后所得香附aghi的uhplc-ms指紋圖譜。

圖7峰1的hr-ms圖譜及分子結(jié)構(gòu)。

圖8峰2的hr-ms圖譜及分子結(jié)構(gòu)。

圖9峰3的hr-ms圖譜及分子結(jié)構(gòu)。

圖10峰4的hr-ms圖譜及分子結(jié)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例1。

一、固定化酶的合成。

將0.2g氨丙基硅膠（10m,120,sepaxtechnologies,inc）加入到2.5％的10ml戊二醛水溶液中，室溫磁力攪拌3h，可見(jiàn)反應(yīng)液由黃色變成紅色，由于氨基與醛基形成c=n的席夫堿結(jié)構(gòu)造成的；隨后去離子水充分洗滌除去過(guò)量的戊二醛，去離子水中保存，得到醛基硅膠（即空白基質(zhì)）。

將0.1g醛基硅膠加入到2.5ml濃度為5.25mg/ml的agh緩沖液中（緩沖液為：50mmna2hpo4溶液，ph7.0），室溫振蕩反應(yīng)1h，再于4℃冰箱中反應(yīng)24h；反應(yīng)結(jié)束后，用緩沖液（50mmna2hpo4緩沖液，ph7.0）、含0.2mkcl的緩沖液、h2o依次洗滌，除去未反應(yīng)的酶，最后在緩沖液中保存，得agh鍵和硅膠，即固定化酶。

固定化酶的制備過(guò)程原理，如圖1所示。

二、香附藥材提取液的制備。

取香附藥材粉末0.2g，過(guò)80目篩；用20ml80%甲醇水溶液在室溫下超聲提取30min；提取液過(guò)濾，凍干，再用10ml親和緩沖液（親和緩沖液為：67mmkh2po4（含5%甲醇），ph6.8）復(fù)溶，然后0.45m微孔濾膜過(guò)濾，即得。

三、固定化酶的親和吸附與解吸。

將400l所得的香附藥材提取液與0.1g固定化酶在37°c下震蕩孵育吸附20min；孵育吸附結(jié)束后，800rpm離心處理5min，分離得到固定化酶，用400l親和緩沖液清洗四次，以除去未親和結(jié)合的小分子化合物；隨后加入200l親和洗脫液（親和洗脫液為：2mol/lnacl溶液（20%甲醇水溶液配制））進(jìn)行解吸，37°c下振蕩10min，收集上清液，即為與固定化酶具有強(qiáng)吸附作用的化合物（aghi候選分子）溶液。

將上述過(guò)程中的固定化酶替換為空白基質(zhì)，即可得到只在基質(zhì)上有非特異性吸附的假陽(yáng)性分子溶液。

固定化酶的親和吸附與解吸過(guò)程原理，如圖2所示。

四、香附aghi的結(jié)構(gòu)確定。

香附aghi的結(jié)構(gòu)確定過(guò)程的原理，如圖3所示。

將所得的aghi候選分子溶液和假陽(yáng)性分子溶液，分別在氮吹儀上濃縮至10l（40℃），隨后分別注入uhplc-ms（agilent1290infinitylc-6520accurate-massqtof-ms）進(jìn)行指紋圖譜分析，見(jiàn)圖4和圖5；將二者所得指紋圖譜相扣減，即可得到除去假陽(yáng)性結(jié)果（sugetriol，峰4）的香附aghi的指紋圖譜，見(jiàn)圖6；進(jìn)一步通過(guò)hr-ms技術(shù)，即可初步確定香附aghi的結(jié)構(gòu)，分別為以下三種化合物：scirpusinsb（峰1）、cyperusphenola（峰2）、mesocyperusphenola（峰3），峰1-峰4的hr-ms圖譜及分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖7-10，該結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步通過(guò)與其對(duì)照品的出峰時(shí)間和hr-ms圖譜比對(duì)得以證實(shí)。

三種香附aghi對(duì)照品的制備方法可參見(jiàn)文獻(xiàn)（中國(guó)專(zhuān)利：cn104910172a）。

五、香附aghi的活性驗(yàn)證。

對(duì)三種香附aghi（scirpusinsb、cyperusphenola、mesocyperusphenola）和陽(yáng)性對(duì)照（阿卡波糖）進(jìn)行常規(guī)的agh抑制活性實(shí)驗(yàn)，以證明篩選結(jié)果的可靠性。

采用對(duì)硝基酚--d-吡喃葡萄糖苷（pnpg）為底物的酶-抑制藥篩選模型進(jìn)行活性篩選。

三種香附aghi的分離純化：純化方法參見(jiàn)文獻(xiàn)（中國(guó)專(zhuān)利：cn104910172a）。

樣品的配制：將0.48ml磷酸緩沖液（67mm，ph6.8），0.02ml谷胱甘肽（3mm），0.05mlpnpg（10mm）和0.02ml待測(cè)樣品溶液（三種香附aghi（scirpusinsb、cyperusphenola、mesocyperusphenola）和阿卡波糖）混合均勻后，于37℃孵育10min，然后加入0.02mlα-葡萄糖苷酶（0.3u/ml），混合均勻后，于37℃孵育20min，所有的試劑均用磷酸緩沖液（67mm，ph6.8）配制；用2.4ml碳酸鈉水溶液（100mm）終止酶解反應(yīng)，隨即于410nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度（as）。

對(duì)照樣品的配制方法與上述樣品的配制方法基本相同，僅將待測(cè)樣品溶液替換為等量的磷酸緩沖液（67mm，ph6.8）。

空白樣品和空白對(duì)照的配制方法也分別與上述樣品和對(duì)照樣品的配制方法基本相同，僅分別將樣品和對(duì)照樣品中的-葡萄糖苷酶溶液替換為磷酸緩沖液即可。

樣品抑制活性（%）計(jì)算公式為：抑制率（%）=100%×[(as-asb)/(ac-acb)]。

其中，as、asb、ac及acb分別代表樣品、空白樣品、對(duì)照樣品和空白對(duì)照組的吸光度；所有數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定三次；4個(gè)樣品在不同濃度點(diǎn)的具體抑制率，見(jiàn)表1；三種香附aghi及陽(yáng)性對(duì)照（阿卡波糖）的agh抑制活性，見(jiàn)表2。

表1三種香附aghi及陽(yáng)性對(duì)照的agh抑制率。

表2三種香附aghi及陽(yáng)性對(duì)照的agh抑制活性。

由表2結(jié)果可知，本發(fā)明所篩選得到的三種香附aghi（scirpusinsb、cyperusphenola、mesocyperusphenola）均為agh的強(qiáng)效抑制劑，進(jìn)一步證明和驗(yàn)證了本篩選方法的可靠性。