本發(fā)明屬于海洋生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海綿提取物的生物活性mtt測定方法。
背景技術(shù)：
海洋生物堿作為海洋生物的一種特征次級代謝產(chǎn)物，以其結(jié)構(gòu)的新穎性、多樣性和顯著的生物活性成為海洋天然產(chǎn)物的重要研究對象。到目前為止，海洋來源的天然產(chǎn)物已經(jīng)超過20000個(gè)，其中約三分之一的化合物含有氮原子，在46個(gè)海洋藥物中，33個(gè)屬于生物堿。海綿一直是海洋生物堿的主要來源，研究報(bào)道calcarea綱中富含咪唑生物堿，在過去的30年中，共分離得到60多個(gè)咪唑生物堿。這類生物堿具有顯著的抗菌、抗炎和細(xì)胞毒活性。
海綿是生物堿的主要來源，這些生物堿具有結(jié)構(gòu)類型新穎，生物活性好的特征。calcarea綱的海綿分布與全球各個(gè)海域，其中l(wèi)eucetta和clathrina屬海綿被報(bào)道其特征性化學(xué)成分為咪唑類生物堿，在過去30年中，從這兩個(gè)屬中分離到的咪唑類生物堿已超過60個(gè)。咪唑類生物堿的結(jié)構(gòu)以2-氨基咪唑環(huán)為基本母核，2位氨基通常連有取代基乙內(nèi)酰脲，n1，c-4，c-5位常連有苯環(huán)取代基，c-4，c-5位連有苯環(huán)的稱為naamines或naamidines，n1，c-4位連有苯環(huán)的結(jié)構(gòu)類型稱作isonaamines或isonaamidines。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在為海綿的提取物提供一種方便可靠的生物活性測定方法。
一種海綿提取物的生物活性mtt測定方法，包括如下步驟：
(1)取對數(shù)期腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為200000個(gè)/ml，每孔200μl，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；
(2)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h(37oc，5%co2)；
(3)待測樣品分別設(shè)5個(gè)濃度梯度(每個(gè)濃度3個(gè)平行樣)，同時(shí)設(shè)陰性、陽性對照，每孔加空白液或樣品液2μl，培養(yǎng)72h；
(4)每孔加入mtt液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h；
(5)終止培養(yǎng)，離心8min(37oc、2000r/min)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；
(6)每孔加入dmso各100μl，于微量振蕩器中振蕩15min，直至結(jié)晶充分溶解；
(7)酶標(biāo)儀測定每孔在570nm處的吸光值(即od值)。取三孔的平均od值，按公式ir%=(od空白對照-od樣品)/od空白對照×100%計(jì)算樣品對細(xì)胞增殖的抑制率(ir%)。
測定原理為：mtt為3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃顏色的染料，其檢測原理為在活細(xì)胞線粒體中，琥珀酸脫氫酶可以使外源性mtt還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶（formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。formazan與活細(xì)胞數(shù)成正比，二甲基亞砜（dmso）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。以此原理來測定化合物的抗腫瘤活性。
本發(fā)明的測定方法相對于現(xiàn)有技術(shù)簡單快速、而且檢測結(jié)果可靠，適于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
選擇k562和hl-60腫瘤細(xì)胞株用mtt法對從海綿提取物分離得到的咪唑生物堿類化合物(ph-1~ph-5)進(jìn)行了體外抗腫瘤活性篩選，，包括如下步驟：
(1)取對數(shù)期腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為200000個(gè)/ml，每孔200μl，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；
(2)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h(37oc，5%co2)；
(3)待測樣品分別設(shè)5個(gè)濃度梯度(每個(gè)濃度3個(gè)平行樣)，同時(shí)設(shè)陰性、陽性對照，每孔加空白液或樣品液2μl，培養(yǎng)72h；
(4)每孔加入mtt液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h；
(5)終止培養(yǎng)，離心8min(37oc、2000r/min)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；
(6)每孔加入dmso各100μl，于微量振蕩器中振蕩15min，直至結(jié)晶充分溶解；
(7)酶標(biāo)儀測定每孔在570nm處的吸光值(即od值)。取三孔的平均od值，按公式ir%=(od空白對照-od樣品)/od空白對照×100%計(jì)算樣品對細(xì)胞增殖的抑制率(ir%)。
對初篩結(jié)果見表1-2，分析表中數(shù)據(jù)可以看出在濃度為50μm濃度水平，化合物ph-4對腫瘤細(xì)胞株k562表現(xiàn)出強(qiáng)的抑制活性，抑制率在90%左右，化合物ph-5對2種腫瘤細(xì)胞株均表現(xiàn)出強(qiáng)的抑制活性，抑制率都在90%以上，化合物(ph-1~ph-3)對2種細(xì)胞株的抑制活性均較弱。
表1化合物ph-1~ph-5對k562腫瘤細(xì)胞株的抑制率(%)
表2化合物ph-1~ph-5對hl-60腫瘤細(xì)胞株的抑制率(%)
對初篩活性較好的化合物(抑制率大于30%)進(jìn)行了ic50測試。ic50結(jié)果顯示化合物ph-4和ph-5對腫瘤細(xì)胞株k562具有強(qiáng)的抑制活性，ic50值分別為9.35和11.3um；ic50值分別為21.4和22.1um。由此可以看出化合物ph-4，ph-5對腫瘤細(xì)胞株具有高度的選擇性，且對k562細(xì)胞株具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。