本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域，涉及牛奶樣品中二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷有害物質(zhì)的檢測，特別是檢測中牛奶樣品的前處理方法。

背景技術(shù)：

二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷作為一類外源性激素，越來越受到人們的關(guān)注。該化合物都具有與雌激素相類似的作用，可導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂，性早熟等危害。由于自然環(huán)境或外包裝材料中都可能含有該物質(zhì)，從而導(dǎo)致它們遷移到牛奶當(dāng)中的幾率是非常大，因此它們對人體的健康威脅是巨大的。該物質(zhì)熔點(diǎn)15℃(lit.)，密度1.19 g/mL at 25℃(lit.)，折射率n20/D 1.579(lit.)，分子結(jié)構(gòu)式如下：

牛奶樣品組分比較復(fù)雜，有害有機(jī)物含量極低，一般在ppm和ppb，而且還存在目標(biāo)待測物的同系物、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物和軛合物影響，要想除去與目標(biāo)物同時存在的雜質(zhì)，減少色譜干擾峰，避免檢測器和色譜柱污染，樣品預(yù)處理十分重要，大約占工作量的70%左右。

現(xiàn)有關(guān)于脂肪、蛋白質(zhì)含量較高的食品中二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷的檢測主要集中在肉類樣品，暫未見有關(guān)牛奶樣品的檢測，該類樣品的預(yù)處理主要采用固相萃取法（SPE），預(yù)處理過程一般是為：叔丁基甲醚提取--提取液吹干--正己烷/水萃取--固相萃取相，如“高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定肉類罐頭中雙酚-二縮水甘油醚”，趙曉亞等，色譜，2012年第30卷第10期；“石墨烯固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定食品接觸材料中9 種雙酚-二環(huán)氧甘油醚的遷移量”，龔強(qiáng)等，食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2014 年第33卷第12期；“多壁碳納米管固相萃?。咝б合嗌V－串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品接觸材料中雙酚－二環(huán)氧甘油醚的遷移量”，吳新華等，色譜，2010年第28卷第11期。這種預(yù)處理方法由于使用時間比較長，工藝比較成熟，但是也存在步驟繁瑣，固相萃取柱造價(jià)高，溶劑消耗量大的缺點(diǎn)，科研人員一直在尋找更加高效的替代方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有脂肪含量較高的食品中二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷檢測過程樣品預(yù)處理過程繁瑣、成本高的缺陷，提供了一種牛奶樣品中二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷的提取凈化方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種牛奶樣品中二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷的提取凈化方法，步驟如下：

（1）牛奶樣品用甲酸乙腈溶液提取；

（2）向步驟（1）的提取液中加入無水硫酸鎂和氯化鈉，振蕩，離心，得到上清液；

（3）向步驟（2）得到的上清液中加入N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷鍵合硅膠和無水硫酸鎂，振蕩，離心，得到提取凈化的二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷樣品。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述甲酸乙腈溶液的甲酸濃度為0.1vt%。

優(yōu)選地，步驟（1）采用超聲提取，提取時間為10min。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述無水硫酸鎂和氯化鈉的質(zhì)量比為1:2。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷鍵合硅膠和無水硫酸鎂的質(zhì)量比為1:1:2.5。

一種檢測牛奶樣品中二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷含量的方法，步驟如下：

（1）牛奶樣品用甲酸乙腈溶液提??；

（2）向步驟（1）的提取液中加入無水硫酸鎂和氯化鈉，振蕩，離心，得到上清液；

（3）向步驟（2）得到的上清液中加入N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷鍵合硅膠和無水硫酸鎂，振蕩，離心，液體吹干，得到的二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷樣品再用乙腈溶液溶解，濾膜過濾，得待測樣品；

（4）待測樣品采用帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀檢測，色譜柱為C₁₈柱，流動相采用水和濃度為0.1vt%的甲酸乙腈溶液，激發(fā)波長235nm，發(fā)射波長為305nm。

本發(fā)明的牛奶樣品預(yù)處理過程簡單快捷、效率高、溶劑消耗量小，符合綠色化學(xué)和環(huán)?；瘜W(xué)的要求、花費(fèi)較少、節(jié)省大量的人力物力，適合于牛奶樣品中二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷的快速檢測。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是提取凈化后二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷的色譜圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

1、儀器和試劑

（1）儀器：高效液相色譜儀-熒光檢測器、waters公司色C₁₈譜柱、離心機(jī)、渦旋儀、振蕩儀、氮吹儀、離心管、復(fù)合過濾頭，注射器。

（2）試劑：乙腈、甲酸、超純水、N-丙基乙二胺（PSA）和十八烷基硅烷鍵合硅膠（C₁₈）、氯化鈉、無水硫酸鎂。

2、樣品提取凈化步驟

用移液管準(zhǔn)確量取牛奶樣品(5±0.02 mL)裝入15mL具塞離心管中，加入5 mL含有0.1%甲酸的乙腈，超聲提取之后，加入1.0g無水硫酸鎂和2.0g氯化鈉，振蕩5min。以10000 rpm的轉(zhuǎn)速在10℃下離心5min。上清液轉(zhuǎn)入另一含有PSA和 C₁₈以及250 mg 無水硫酸鎂的離心管中，渦旋30s，振蕩2min之后，以10000 rpm的轉(zhuǎn)速在10℃下離心5min。液體轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中，在50℃下氮吹到近干，再用1mL濃度55vt%的乙腈水溶液復(fù)溶，過0.22um復(fù)合濾膜到進(jìn)樣瓶中，上高效液相色譜儀測試。

3、儀器方法的條件

使用帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀儀，色譜柱為Waters Xcharge C₁₈ column (250mm×4.6mm, 5 μm,100A)，流動相由水和含有0.1vt%甲酸的乙腈組成，流速為1.0 mL/min。熒光檢測器激發(fā)檢測波長為215-240 nm，發(fā)射波長為295-315。 進(jìn)樣體積為 20 μL，柱溫為35±5℃。

4、樣品提取凈化和檢測器條件優(yōu)化

C₁₈ 凈化牛奶中的脂肪，色素和維生素，PSA 能夠凈化牛奶中的碳水化合物和有機(jī)酸，乙腈可以使得牛奶中蛋白質(zhì)析出，另外無機(jī)鹽氯化鈉和硫酸鎂都具有鹽析作用，可以進(jìn)一步除去殘存的蛋白質(zhì)。

（1）凈化劑PSA和 C₁₈用量

以處理牛奶樣品都為5.0±0.02 mL為例，實(shí)驗(yàn)中PSA和 C₁₈按照1:1的質(zhì)量比投料，其他條件相同，設(shè)置為5個PSA投料水平：0.025，0.05，0.1，0.2 和0.4 g。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)PSA用量為0.1g時，目標(biāo)化合物有最大的回收率。當(dāng)用量較少的時候，凈化效果不好，當(dāng)用量過多的時候，對目標(biāo)化合物的吸附作用較大，造成了不必要的損耗。最后選擇凈化5.0±0.02 mL牛奶樣品時，使用PSA和C₁₈的量分別為0.1g作為最優(yōu)條件。

（2）超聲萃取時間

超聲萃取具有耗時短、效率高、簡單、快捷的優(yōu)點(diǎn)，我們對超聲萃取時間進(jìn)行了優(yōu)化。采用單因素試驗(yàn)，其他條件不變，設(shè)置超聲萃取時間為5個水平：5，10，15，20和25min。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)萃取時間為10min，效率最高。時間縮短或者延長都會對實(shí)驗(yàn)效果產(chǎn)生不利影響。

（3）熒光檢測器波長

熒光檢測激發(fā)波長被設(shè)定為215, 220, 225, 230, 235, 240 和245 nm共7個水平，發(fā)射波長被設(shè)定為295, 300, 305, 310 和 315nm共5個水平，分別采用單因素實(shí)驗(yàn)，在保持其他條件不變的情況下，采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，改變激發(fā)波長和發(fā)射波長，測定目標(biāo)化合物二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷的色譜峰高，當(dāng)峰高最高的時候，該方法有最佳的靈敏度。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。當(dāng)激發(fā)波長為235nm時，目標(biāo)化合物有最大峰高；當(dāng)發(fā)射波長為305nm，目標(biāo)化合物有最大峰高。因此，最后選定激發(fā)波長235nm，發(fā)射波長為305nm，為我們的最佳條件。

（4）最佳樣品提取凈化條件和檢測器條件

用移液管準(zhǔn)確量取牛奶樣品(5±0.02 mL)裝入15mL具塞離心管中，加入5 mL含有0.1%甲酸的乙腈，超聲提取10min之后，加入1.0g無水硫酸鎂和2.0g氯化鈉，振蕩5min。以10000 rpm的轉(zhuǎn)速在10℃下離心5min。上清液轉(zhuǎn)入另一含有PSA和 C₁₈各0.1g以及250 mg無水硫酸鎂的離心管中，渦旋30s，振蕩2min之后，以10000 rpm的轉(zhuǎn)速在10℃下離心5min。液體轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中，50℃下氮吹到近干，再用1mL 濃度為55%的乙腈水溶液復(fù)溶，過0.22μm復(fù)合濾膜到進(jìn)樣瓶中，上機(jī)測試。

流動相由水和含有0.1vt%甲酸的乙腈組成，流速為1.0 mL/min， 進(jìn)樣體積為 20 μL，柱溫為35±5℃，熒光檢測器激發(fā)波長235nm，發(fā)射波長為305nm。

目標(biāo)化合物二[4-(氧化縮水甘油)苯基]甲烷的色譜圖如圖1所示。

5、方法的驗(yàn)證

（1）準(zhǔn)確度

方法的準(zhǔn)確度由加標(biāo)回收試驗(yàn)確定。我們采用空白加標(biāo)試驗(yàn)，選擇空白的牛奶樣品，按照高中低3個濃度（10, 50 and 100 μg/L）加入目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用建立起來的方法對加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理，并上高效液相色譜儀測定，按照測得濃度，計(jì)算加標(biāo)回收率。通過日內(nèi)和日間加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，我們得到目標(biāo)化合物的回收率為75.82-93.86%，滿足殘留分析一般75-120%的要求。

（2）精確度

精確度由相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，relative standard deviation）來確定。在日間實(shí)驗(yàn)（，每天平行測定6個水平加標(biāo)樣品，連續(xù)測定3天）和日內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)（單日連續(xù)測定18個樣品）據(jù)來確定，結(jié)果為3.6-10.9%，滿足殘留分析一般小于15%。

（3）靈敏度

靈敏度由最低檢出限（LOD，limit of detection）和最低定量限（LOQ，limit of Quantitation）來確定，LOD定性分析時用3倍性噪比表示，LOQ定量分析使用10倍信噪比表示。通過加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，得到最低檢出限（LOD）為2.5μg/L，最低定量限（LOQ）為8.4μg/L，符合殘留檢測的要求。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。